一种重组人细小病毒b19蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种人细小病毒B19重组蛋白，还提供了该重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。采用本发明提供的人细小病毒B19蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人细小病毒B19感染临床诊断的需要。
【专利说明】—种重组人细小病毒BI 9蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种人细小病毒B19蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]1975年Cossat等人从I个无症状健康供血员血清标本中发现直径为20_25nm球形病毒颗粒，编定为B19病毒。经基因和生化分析,该病毒属细小病毒属,称人细小病毒B19(Human Parvovirus B19,以下简称B19病毒)。B19病毒是目前细小病毒家族中除人博卡病毒(HBoV)和新型细小病毒PARV4 (Human parvovirus4)以外唯一可以引起人类疾病的病毒。它可能是多种疾病的致病因子，感染儿童可引起传染性红斑，感染成人可引起多发性关节病综合征，而对一些有免疫病和血液病的患者，B19感染可以引起严重的疾病，如慢性红细胞贫血，再生障碍性贫血危象。
[0003]1986年，Shade等首次发表了 B19病毒近全长的基因组核昔酸序列。B19病毒是一种直径约为20~25nm的无包膜单链线状DNA病毒，B19病毒基因组全长5.6Kb，其两端均有发夹结构，各由383个碱基组成，非结构蛋白NSl编码区基因组左半侧，且相互重叠，VP2基因位于VPl基因内。B19病毒感染细胞后，共产生9种mRNA，其中5种与特异性蛋白有关。两种编码较大的结构蛋白VPl (85X 103)，两种编码较小的结构蛋白VP2(55X 103)，另一种则编码非结构蛋白NSl (77X IO3)。病毒衣壳的95%由VP2蛋白组成，VPl仅占5%。VPl除N端增加的227个氨基酸外，其余部分均与VP2相同。病毒的大部分中和抗原位于VPl独特区和VP1-VP2连接区，机体感染该病毒后的中和性抗体主要针对该部位产生。
[0004]序列同源性分析及DNA杂交结果表明，虽然细小病毒属的多数成员间核昔酸序列同源性很高，但是B19病毒与其它细小病毒的基因组序列同源性却很低。经多年研究，认为不同来源的B19病毒毒株之 间的基因变异比丙型肝炎等具有显著异性源有高度可变性的病毒小得多，但是该病毒仍具有多个明显不同的基因型。
[0005]由于细小病毒B19致病的广泛性和复杂性，目前，国际上对该病毒的研究比较活跃。如人类免疫缺陷病毒(艾滋病病毒)、丙型肝炎病毒和幽门螺杆菌一样，B19亦被认为是当代医学史上新发现的与人类疾病密切相关的重要致病因子。
[0006]目前血清学检测包括B19抗体和抗原的检测。其中，抗体检测是目前临床诊断及流行病学调查B19感染的主要方法。检测B19病毒抗体起初是采用血源抗原，但该抗原来源困难，难丁普及和推广。目前应用重组技术表达B19病毒结构蛋白制备的基因工程抗原，已应用于B19抗体检测，并在不断改进和完善。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种重组人细小病毒B19蛋白，本发明的另一目的是提供该重组人细小病毒B19蛋白在制备检测试剂盒中的应用。
[0008]本发明提供了一种编码人细小病毒B19蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的人细小病毒B19蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0009]本发明还提供了一种人细小病毒B19蛋白的表达载体pET-21a_B19，它是将SEQID N0.1所示所述的重组DNA序列插入到质粒pET-21a上得到的重组质粒,其质粒图谱如附图2所示。将表达载体pET-21a-B19导入大肠杆菌中，得到表达人细小病毒B19蛋白的工程菌株，该菌株于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为 CGMCCN0.8893。
[0010]本发明利用SEQ ID N0.1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备人细小病毒B19蛋白可以通过如下步骤实现:
[0011]I)获得具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0012]2)将该核苷酸序列导入质粒，优选pET-2Ia质粒；
[0013]3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21 (DE3)菌株中；
[0014]4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；
[0015]5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。
[0016]上述步骤 4)的培养条件为:37°C培养3小时后(转速200r/min)，加入诱导剂(终浓度为lmmol/mL)，37°C诱导表达5小时(转速200r/min)。
[0017]本发明提供的检测人细小病毒B19感染的试剂盒，其组分中的抗原是本发明的重组人细小病毒B19病毒蛋白。用于标记人细小病毒B19蛋白的标记物选自胶体金、辣根过氧化物酶(HRP)。
[0018]本发明所述的采用胶体金标记抗原的试剂盒中，抗人IgM抗体划线包被浓度为
1.0mg/ml,抗人IgM抗体划线量为1.0 μ 1/cm, B19抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫，抗原胶体金结合物喷点量为60 μ L/cm2,小鼠IgG胶体金结合物喷点量为14 μ L/cm2，羊抗鼠IgG抗体包被量为1.0 μ l/cm,包被浓度为1.0mg/ml。
[0019]以下将更详细的描述本发明的技术方案:
[0020]本发明公开了一种编码人细小病毒B19蛋白的如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备人细小病毒B19蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的人细小病毒B19蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测人细小病毒病毒感染的应用。
[0021]SEQ ID N0.1所示核苷酸序列可以通过全基因合成的方法制备，根据抗原表位筛选结果，选取了抗原反应较强的9个表位集中的多肽区域，构建融合抗原多肽表达重组序列。设计PCR引物P1-P18。引物Pl和P2用于扩增是片段P1P2，P3和P4用于扩增片段P3P4, P5和P6用于扩增片段P5P6，P7和P8用于扩增片段P7P8，P9和PlO用于扩增片段P9P10, Pll和P12用于扩增片段P11P12，P13和P14用于扩增片段P1314，P15和P16用于扩增片段P1516，P17和P18用于扩增片段P17P18，引物Pl和P18分别带有BamHI和XhoI的酶切位点，并分别对应于片段I的5’末端和片段9的3’末端。
[0022]引物序列如下:
[0023]P1:ATAGGATCCAACCCGCTGGAGAACCCATCATCT[0024]P2:CAGCTCTTCATCACCACTACTCCCAGGCTTGTGTAAGTCTTC
[0025]P3:GGGAGTAGTGGTGATGAAGAGCTGTTAAAGAATATTAAG
[0026]P4:CTCTGAGGCGTTGTAGCCACTACTACCTTGAAAGCCAGTTTCATTCT
[0027]P5:GAAACTGGCTTTCAAGGTAGTAGTGGCTACAACGCCTCAGAGAAATACC
[0028]P6:GGAATTAAGAACTGTCTGGAACTCCACATGCTCTTGACAGGATTAC
[0029]P7:CATGTGGAGTTCCAGACAGTTCTTAATTCCATATG
[0030]P8:CTACTGCCAACCTTCGCCTCCTTTCCACTGGC
[0031 ] P9:GAGGCGAAGGTTGGCAGTAGTGAAATTGCTGTTAAGGATG
[0032]P10:GACCATGAATACAAGTACCCAGGAATTTCTGGAGAC
[0033]Pll:GTACCCAGGAATTTCTGGAGACAGCAAGAAG
[0034]PI2:GGAAACTTATAACTACTACCATAGAATGCTGATTCTTCACTTG
[0035]PI3:CTATGGTAGTAGTTATAAGTTTCCTCCAGTGCCG
[0036]PI4:CGCGGGCCACTACTGCCCTTTAAGAACTTGAAACTGTC
[0037]PI5:GTTCTTAAAGGGCA`GTAGTGGCCCGCGTAAGGCTACGGGAC
[0038]PI6:CTGTCGGGTCATATACTCCAGGTTGAGGATTCCACCGTCC
[0039]PI7:CCTCAACCTGGAGTATATGACCCGACAGCTACAGATGCAAAG
[0040]P18:
[0041]TACTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGCCCACTGCTCTTGGCTGTCCACAATTCTTC
[0042]引物Pl和P2用于扩增是片段P1P2，P3和P4用于扩增片段P3P4，P5和P6用于扩增片段P5P6, P7和P8用于扩增片段P7P8, P9和PlO用于扩增片段P9P10, Pll和P12用于扩增片段P11P12，P13和P14用于扩增片段P1314，P15和P16用于扩增片段P1516，P17和P18用于扩增片段P17P18。
[0043]以第一轮PCR扩增得到的P1P2和P3P4为模板，加入引物Pl和P4，扩增P1P4片段；以P5P6和P7P8为模板，加入引物P5和P8，扩增P5P8片段；以P9P10和Pl 1P12为模板，加入引物P9和P12，扩增P9P12片段；以P13P14和P15P16为模板，加入引物P13和P16，扩增P13P16片段。
[0044]以第二轮PCR扩增得到的P5P8和P9P12为模板，加入引物P5和P12，扩增P5P12片段；以P13P16和P17P18为模板，加入引物P13和P18，扩增P13P18片段。
[0045]以第三轮PCR扩增得到的P5P12为模板，以P1P4和P13P18引物，扩增P1P18片段。
[0046]本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。
[0047]本发明的一个实施方案涉及应用如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列制备人细小病毒B19蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码人细小病毒B19蛋白的如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。
[0048]编码本发明蛋白的核酸与pET-2Ia形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。
[0049]在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-21a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL2KDE3)，经IPTG诱导培养后，收集菌体，获得大肠埃希氏菌Escherichia coli YNT pET-2Ia-B 19(CGMCC N0.8893)。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。
[0050]本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的人细小病毒B19蛋白，该蛋白具有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列。
[0051 ] 本发明的一个实施方案涉及包含本发明人细小病毒B19蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人细小病毒感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的诊断人细小病毒感染。任何生物学样品，只要它们含有人细小病毒B19抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。
[0052]本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成人细小病毒B19感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断细小病毒B19感染。本发明试剂盒可包括其它多个容器，其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合需要的其它材料，如微量滴定板等。
[0053]在用于人细小病毒B19感染检测的试剂盒中，本发明的人细小病毒B19蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。
[0054]与上述标记物结合的方法是已知的。当标记物为酶时，其底物和显色剂可用于测定其活性。当使用过辣根过氧化物酶时，以3'，3'，5'，5'，-四甲基联苯胺作为底物溶液，并使用TMB显色系统。当使用过氧化物酶时，以H2O2作为底物溶液，并以邻苯二胺、4-氨基氨替比林等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，可用邻硝基苯磷酸、对硝基苯磷酸等作为底物。
[0055]采用本发明提供的重组人细小病毒B19蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人细小病毒B19感染临床诊断的需要。本发明提供的B19蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在B19疫苗研制领域具有实际应用价值。
[0056]本发明涉及的表达人细小病毒B19蛋白的工程菌株是大肠埃希氏菌Escherichiacoli YNT pET-21a-B19，已于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为 CGMCCN0.8893。
【专利附图】
【附图说明】
[0057]图1PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中M表示Marker，I表示扩增产物。
[0058]图2表达质粒pET-2 Ia-B 19的构建流程图；
[0059]图3是诱导后菌体12% SDS 一 PAGE电泳图，其中M表示Marker，1-8泳道表示菌体表达情况及纯化各阶段情况。
【具体实施方式】
[0060]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。[0061 ] 实施例1人单纯疱疹病毒蛋白的制备
[0062]1.1人单纯疱疹病毒蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆
[0063]通过计算机分析人细小病毒B19的全部氨基酸序列筛选出人细小病毒B19的型特异性蛋白VPl和VP2的优势抗原表位。
[0064]根据抗原表位筛选结果，选取了抗原反应较强的9个表位集中的多肽区域，中间用-SSG-连接臂进行见列，构建融合抗原多肽表达重组序列。设计PCR引物P1-P18。引物Pl和P2用于扩增是片段P1P2，P3和P4用于扩增片段P3P4，P5和P6用于扩增片段P5P6，P7和P8用于扩增片段P7P8，P9和PlO用于扩增片段P9P10，P11和P12用于扩增片段P11P12，P13和P14用于扩增片段P1314，P15和P16用于扩增片段P1516，P17和P18用于扩增片段P17P18，引物Pl和P18分别带有BamHI和XhoI的酶切位点，并分别对应于片段I的5’末端
[0065]和片段9的3’末端。
[0066]引物序列如下:
[0067]P1:ATAGGATCCAACCCGCTGGAGAACCCATCATCT
[0068]P2:CAGCTCTTCATCACCACTACTCCCAGGCTTGTGTAAGTCTTC
[0069]P3:GGGAGTAGTGGTGATGAAGAGCTGTTAAAGAATATTAAG
[0070]P4:CTCTGAGGCGTTGTAGCCACTACTACCTTGAAAGCCAGTTTCATTCT[0071 ] P5:GAAACTGGCTTTCAAGGTAGTAGTGGCTACAACGCCTCAGAGAAATACC
[0072]P6:GGAATTAAGAACT GTCTGGAACTCCACATGCTCTTGACAGGATTAC
[0073]P7:CATGTGGAGTTCCAGACAGTTCTTAATTCCATATG
[0074]P8:CTACTGCCAACCTTCGCCTCCTTTCCACTGGC
[0075]P9:GAGGCGAAGGTTGGCAGTAGTGAAATTGCTGTTAAGGATG
[0076]PlO:GACCATGAATACAAGTACCCAGGAATTTCTGGAGAC
[0077]Pll:GTACCCAGGAATTTCTGGAGACAGCAAGAAG
[0078]PI2:GGAAACTTATAACTACTACCATAGAATGCTGATTCTTCACTTG
[0079]PI3:CTATGGTAGTAGTTATAAGTTTCCTCCAGTGCCG
[0080]PI4:CGCGGGCCACTACTGCCCTTTAAGAACTTGAAACTGTC[0081 ] P15:GTTCTTAAAGGGCAGTAGTGGCCCGCGTAAGGCTACGGGAC
[0082]PI6:CTGTCGGGTCATATACTCCAGGTTGAGGATTCCACCGTCC
[0083]PI7:CCTCAACCTGGAGTATATGACCCGACAGCTACAGATGCAAAG
[0084]P18:
[0085]TACTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGCCCACTGCTCTTGGCTGTCCACAATTCTTC
[0086]以上引物由(华美生物技术有限公司)合成。
[0087]引物Pl和P2用于扩增是片段P1P2，P3和P4用于扩增片段P3P4，P5和P6用于扩增片段P5P6, P7和P8用于扩增片段P7P8, P9和PlO用于扩增片段P9P10, Pll和P12用于扩增片段P11P12，P13和P14用于扩增片段P1314，P15和P16用于扩增片段P1516，P17和P18用于扩增片段P17P18。
[0088]以第一轮PCR扩增得到的P1P2和P3P4为模板，加入引物Pl和P4，扩增P1P4片段；以P5P6和P7P8为模板，加入引物P5和P8，扩增P5P8片段；以P9P10和Pl 1P12为模板，加入引物P9和P12，扩增P9P12片段；以P13P14和P15P16为模板，加入引物P13和P16，扩增P13P16片段。
[0089]以第二轮PCR扩增得到的P5P8和P9P12为模板，加入引物P5和P12，扩增P5P12片段；以P13P16和P17P18为模板，加入引物P13和P18，扩增P13P18片段。
[0090]以第三轮PCR扩增得到的P5P12为模板，以P1P4和P13P18引物，扩增P1P18片段。
[0091]扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称:TAKARA MiniBESTPlasmid purification)回收目的DNA,操作按产品说明书进行。
[0092]1.2表达载体pET-21a_B19的构建及鉴定
[0093]pET_21a载体(购自华美生物技术有限公司)与PCR扩增产物B19目的DNA片段(P1P18)经BamHI 和XhoI 双酶切，产物纯化(采用 TAKARA MiniBEST Plasmid purification试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司)后经T4DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含氨苄霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶BamHI和XhoI双酶切、鉴定，其中有3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-21a-B19。
[0094]1.3表达人细小病毒B19型蛋白的工程菌的构建
[0095]将表达质粒pET-21a_B19用化学转化法((美)J.萨姆布鲁克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社，2002.)转入大肠埃希氏菌BL21 (DE3)菌株(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含氨苄霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含氨苄霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12% SDS 一 PAGE分析(同上文献)，结果如附图3所示，确定表达人细小病毒B19蛋白的菌株即为所需的工程菌株大肠埃希氏菌 Escherichia coli YNT pET-2Ia-B19 (CGMCC N0.8893)，用甘油冷冻保存。
[0096]1.4重组人细小病毒B19型蛋白的表达制备及纯化
[0097]诱导培养已构建的表达人细小病毒B19型蛋白的大肠埃希氏菌Escherichia coliYNT pET-2Ia-B19 (CGMCC N0.8893)，用 IPTG 诱导表达 5 小时，离心收集菌体，以 1:10 (ff/V)加入菌体裂解液(50mm pH8.0Tris-Cl, 50mm NaCl, 50%甘油)，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌(冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次)、组氨酸亲和柱(300ml200mm的NiCl2过柱,流速5ml/min ；500ml PBS缓冲液洗注,流速10ml/min ;超声离心后的上清液用200ml PBS稀释后上样，流速3ml/min ；500ml PBS缓冲液洗注，流速5ml/min ;用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的PBS缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS - PAGE电泳检测纯化组分)得到纯化的重组蛋白。
[0098]1.5 重组蛋白 Western-blot 验证
[0099]为验证重组B19型蛋白质与抗HPV血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为:10份兔抗HPV抗体阳性血清(购自北京百安天地医药科技有限公司)和30份人抗HPV抗体阳性血清(经ELISA法检测证实)。阴性血清为:10份对照正常兔血清和30份人抗HPV抗体阴性血清(经ELISA法检测证实)。结果如表1。
[0100]表1重组蛋白Western-blot验证结果
[0101]
【权利要求】
1.一种编码人细小病毒B19蛋白核酸，如SEQ ID N0.1所示。
2.一种人细小病毒B19蛋白，其特征在于它由权利要求1所述的核酸编码，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.包含权利要求1所述核酸的人细小病毒B19蛋白的表达载体，其特征在于它是将权利要求I所述的核酸插入到质粒pET-21a上得到的重组pET-21a-B19质粒。
4.一种重组人细小病毒B19蛋白的制备方法，其特征在于应用权利要求1的重组DNA构建表达载体,并在该载体所适合的原核宿主细胞中表达权利要求1所述重组DNA编码的重组人细小病毒B19蛋白，包括以下步骤: O获得具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列； 2)将该核苷酸序列导入质粒； 3)将该质粒导入原核宿主细胞； 4)培养所述宿主细胞； 5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。
5.根据权利要求2所述的人细小病毒B19蛋白在制备检测试剂盒中的应用。
6.—种表达人细小病毒B19蛋白的工程菌株,其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pET-21a-B19，宿主菌为大肠杆菌，保藏编号为CGMCC N0.8893，该菌株于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101。
7.—种检测人细小病毒B19感染的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的抗原是权利要求2所述的人细小病毒B19蛋白。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于用于标记人细小病毒B19蛋白的标记物为胶体金或辣根过氧化物酶。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于抗人IgM抗体划线包被浓度为1.0mg/ml，抗人IgM抗体划线量为1.0μ 1/cm，人细小病毒B19抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫，所述抗原胶体金结合物喷点量为60 μ L/cm2,小鼠IgG胶体金结合物喷点量为14μ L/cm2，羊抗鼠IgG抗体包被量为1.0 μ 1/cm，包被浓度为1.0mg/ml。
【文档编号】G01N33/569GK103849630SQ201410098047
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】张晓刚, 张秀杰, 华艳 申请人:北京英诺特生物技术有限公司