进行抗体表达和组装的重组系统及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和蛋白质技术领域，具体设及抗体表达和组装的重组系统 及应用。 技术背景
[0002] 自抗体研究W来，许多棘手的临床疾病对于医生来说并非不可能。随着技术的不 断发展，抗体的研究也有了突飞猛进的进步。抗体的研究也进入新阶段，从最初简单的抗体 到鼠源化抗体，再到如今的人源化抗体。如今人源化抗体的不断进步和完善，在医学领域得 到了广泛应用，在医学领域的应用已显示出它巨大的潜力。
[0003] 人源化抗体是在嵌合抗体的基础上减少鼠源成分，保留鼠抗体CDR区，其余全部替 换成人抗体相应部分，经过改型抗体，人源成分达90%即为所指的人源化抗体。在疾病治疗 中，人源化抗体优于鼠源化抗体，不仅因为抗体中鼠源性成分的减少降低了机体的免疫排 斥反应，还在于人源化抗体中化段，能够诱发机体的效应机能募集效应因子或效应细胞，后 者对祀细胞具有杀伤作用。还有一个优点在于人源化抗体在体内的半衰期可达数天，而鼠 源抗体的半衰期则不到20h。
[0004] 随着抗体工程的发展，建立在隧菌体外壳表达抗体片段的能力基础上的隧菌体展 示技术产生，即从免疫后的脾细胞、外周血淋己细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，利用PCR技 术分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体上，并在 适当的宿主细胞中表达成有功能的抗体分子，从而利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、扩 增，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。
[000引近几年来，随着对鼠单克隆抗体的人源化技术越来越成熟，大量的人源化抗体被 用于临床治疗肿瘤疾病研究，它已成为继手术切除、放疗及化疗后又一治疗肿瘤的药物。因 此研究有利于表达人源化抗体的载体骨架也变的至关重要。
[0006] WpR化骨架为基础的表达人源化抗体的真核载体已有一些研究，PRTL质粒的特 占 . y ?、、·
[0007] hEFl-HTLV启动子是一个含有延伸因子-Ια化F-la)核屯、启动子和人类T细胞白血 病病毒化化V)I型长末端重复区域的R片段和R-U5,序列的复合启动子。在体外转基因研究 中EF-化启动子展示出很强的活性，并启动产生持久的表达。R-肌，和EF-la-同W提高RNA 的稳定性。
[0008] SV4化An:猿猴病毒40晚期多聚腺巧酸化信号促使有效的分割和聚腺巧酸化反应， 导致大量稳定态mRNA的产生。
[0009] 化i :一个最短的E.coli复制起点，它可用来控制载体的大小，但是与长的化i具有 相同的活性。
[0010] CMV enhancor/hFerLpromter:运种复合启动子由人类巨细胞病毒immediate-early基因1增强子和人类铁蛋白轻链基因的核屯、启动子所组成。运个普遍存在的启动子引 导Zeocin?抗性基因在哺乳动物细胞中的表达。
[0011] EM2KC:是一个细菌启动子，它能够使抗性基因在E.coli细胞内中持续表达。EM2KC 位于内含子内，是在哺乳动物细胞中被剪切掉。
[0012] WlopAn:人beta-globin 3，UTR和多腺巧酸化序列能够让转基因转录得到有效捕 获。
[0013] Human IgHGUlgGl重链恒定区）：当将重链可变区插入到多克隆位点时，务必注意 读码框的正确，W保证重链恒定区的完整。
[0014] Zeocin:抗 Zeocin 抗性序列是来源于 Str 邱 1:〇日11〇16；[油11311；[]1山131:日]1113的化1316基 因。运个基因可用于哺乳动物和原核生物如E.coli的抗性选择。运种抗生素可用来分离对 其它筛选剂(如:庆大霉素，潮霉素)有抗性的克隆。Zeocin是一种属于争光霉素家族的糖蛋 白抗生素，在体内能作用于大多数细菌(包括E.coli)、真菌(如:酵母菌）、植物细胞、动物细 胞。
[0015] 所述重组载体为一种穿梭质粒，具有两种不同复制起点，因而可W在真核和原核 两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。为了提高表达效率，本载体在起始密码子侧 翼加上了Kozak序列，后期在设计插入基因时不必考虑Kozak序列的引入问题。所述重组载 体是真核原核细胞共用一个抗性筛选标记，为:zeocin抗性，在原核质粒制备系统中的使用 浓度为25μg/ml，在真核表达系统中的筛选浓度约为5(K)μg/ml，不同真核细胞抗性筛选浓度 稍有不同。
[0016] 将插入序列连接到由限制性内切酶酶切的载体后，在原核细胞中纯化质粒，共转 染至相对应的真核宿主细胞(293F细胞或C册细胞），表达具有功能的各类抗体。
【发明内容】
[0017] 本发明提供一种进行抗体表达和组装的重组系统，所述重组系统包括宿主细胞和 重组载体。
[0018] 本发明的技术方案是：
[0019] -种进行抗体表达和组装的重组系统，所述重组系统包括宿主细胞和重组载体。
[0020] 所述宿主细胞为C册细胞或293F细胞。
[0021 ] 所述重组载体包括重链区域表达载体pR化1-肥和轻链区域表达载体pR化1-LC，重 组载体的载体骨架为pCTL载体。
[0022] 所述重组载体的测序引物，正向测序引物序列如SEQ ID NO: 15所示，反向测序引 物如沈Q ID NO: 16所示。
[0023] 所述重组载体可分别编码抗体的重链和轻链，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:3所 示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0024] 所述抗体片段选自IgG、Fab、Fv或ScFv-Fc。
[00巧]所述pR化载体骨架包含CMV enhancor/hFerL promter复合启动子和IL2信号肤， 启动子和信号肤不限于一种，可选自11。6仕山日。1寸化￥、116、化、64?或〔31￥，信号肤可选自外 源蛋白自身的天然信号肤、IL2、Igkappa或hGHWL
[0026] 所述pR化1-HC表达载体的核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示的，pRTLl-LC表达载体 的核巧酸序列如SEQ ID NO:2所示的。
[0027] 所述重组载体的构建方法如下：
[002引 （l)pRTLl-肥改造设计
[0029] a.将含有 Fd 区域的 pFabZipl 克隆载体 GenBank:AY190524 中 2364bp 到 2666bp 的序 列，与P即沈-hFc2-adapt-ScFv载体GenBank: FJ716123上的姑1、姑2、姑3恒定区序列融合得 到融合片段Fd-姑1-姑2-姑3;在融合片段的Fd端上加 EoRI酶切位点，Ch3端上加 Nhel酶切位 点，人工合成该部分元件序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0030] b.如SEQ ID顯：13所示的元件序列和改造载体9。1156-}1。〇2-曰(1曰91-5〇。￥分别经 EcoRI和Nhel双酶切后连接，完成表达完整的具有较链区的IgG重链质粒的构建，命名为 pRTL载体；
[0031 ] C. W抗肥R2抗体的Vh序列为模板，从EcoRI处设计正向引物a如SEQ ID N0:5所示， 再设计反向引物b如SEQ ID NO:6所示，扩增Vh序列;正向引物C如SEQ ID NO:7所示，Ch3尾加 Xbal切点设计的反向引物d如SEQ ID N0:8所示，一同扩增Fd-CHl-CH2-CH3融合序列;通过重 叠延伸 PCR 将 Vh 和 Fd-CHl-CH2-CH3 进行融合得 VH-Fd-CHl-CH2-CH3;
[0032] d.用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和Xbal双酶切的VH-Fd-姑1-Ch2-姑3融合产物和经 EcoR巧日Nhel双酶切的pR化载体，其中Xbal和Nhel为同尾酶，经连接后，运两个酶切位点消 失，得到pRTLl-肥载体；
[0033] (2)pRTLl-LC 改造设计
[0034] a.将pMThIgGl-V表达载体GenBank:AM408495中56化P到88化P的Cl区域序列如沈Q ID NO: 14所示，通过人工合成得到具有EcoRI、BsiWI和化el酶切位点的Cl区域片段；
[003引 b.将人工合成的Cl区域序列经EcoRI和Nhel双酶切后连接到经同样EcoRI和Nhel 双酶切的pFUSE-hFc2-adapt-ScFv骨架载体上，完成表达抗体轻链的质粒的构建，命名为 pRTL'载体；
[0036] C. W抗皿R2抗体的化序列为模板，从EcoRI处设计正向引物e序列如SEQ ID N0:9 所示，从Cl的端BsiWI酶切位点序列处设计反向引物f如SEQ ID NO: 10所示和正向引物g如 SEQ ID NO: 11所示，从化el处设计反向引物h如SEQ ID NO: 12所示，PCR扩增化序列；
[0037] d.用T4 DNA连接酶连接经EcoR巧邮siWI双酶切的步骤C中纯化的PCR产物和pR化' 载体，得到pCTLl-LC载体；
[003引（3)WpR化1-肥和pR化1-LC重组载体在共转染宿主细胞，表达完整的IgG抗体。
[0039] 所述重链区域表达载体用EcoRI和化el双酶切并与所需的Vh连接，转化获得质粒， 转染真核细胞即可表达抗体的IgG重链;所述轻链区域表达载体用EcoRI和BsiWI双酶切并 与所需的化连接，转化获得质粒，转染真核细胞表达抗体的轻链;所述重组系统在共转染宿 主细胞后表达抗体。
[0040] 本发明的有益效果：
[0041] 1.本发明利用分子克隆技术可将抗肥R2、CD3等抗体序列克隆至真核表达载体，并 使其在细胞中大量表达，且纯化得到其表达产物，为表达人类IgG抗体提供重要的参考。
[0042] 2.本发明专利的主要优势在于在不改变抗体骨架氨基酸的序列前提下，能够高效 表达相对应的由Η链和L链组成的天然状态的人源抗体。
[0043] 3.本发明中的重组载体是真核原核细胞共用一个抗性筛选标记，为zeocin抗性， 在原核质粒制备系统中的使用浓度为25μg/ml，在真核表达系统中的筛选浓度约为50化邑/ ml。
[0044]说明书附图
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