一种xl-2人肺癌高转移细胞系及用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞生物学领域，特别设及一种人肺癌高转移细胞系及用途。
【背景技术】
[0002] 肿瘤转移是一个多阶段、多步骤、多因素、多基因相互作用极其复杂的过程，自癌 细胞从瘤母体脱离到转移灶形成要经过黏附与解黏附、蛋白酶水解、运动等复杂过程和机 审IJ。在恶性肿瘤患者体内，进入淋己管或血管的瘤细胞可W有很多，但是只有某些瘤细胞亚 群得W优势生长，获得转移表型，运些具有高转移潜能的瘤细胞才易发生转移。动物实验也 证明：将T241肉瘤细胞移植于C57BL/6小鼠后，24小时在血液中就可查见活的瘤细胞，但到 第7天后方出现转移；将放射性标记的肿瘤细胞注入动物血管中，进入血循环24小时后，能 够存活的瘤细胞仅1%，而最后抵达某一部分产生继发灶的不到0. 1%。
[0003] 目前，尽管国内外由学者采用筛选的方法成功建立了高转移模型，例如： Krasagakis等曾经从皮肤神经经内分泌细胞癌的淋己结转移灶中建立了癌细胞系。Lee等 从前列腺癌硬脑膜转移灶中建立了癌细胞系。Seki等从人肝癌淋己结转移灶中建立了一个 细胞系。但是，目前少见成功构建理想的人肺癌体内移植转移模型的报道。因此本领域还 需要进一步研究开发出人肺癌高转移模型及细胞系。
[0004] 另外目前经过连续的体外人工培养传代，很多肿瘤细胞已经不能维持其最原始的 生物学特性。因此，使用运种肿瘤细胞建立的转移模型其临床预测能力较低。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的在于提供一株人肺癌化-2高转移细胞系。
[0006] 本发明另一目的在于提供该人肺癌化-2高转移细胞系的用途。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种人肺癌化-2高转移细胞系，简称化-2sci，其是W 常规肺癌细胞化-2细胞，经动物体内循环筛选获得；所述人肺癌细胞化-2细胞在中国典 型培养物保藏中屯、保藏，保藏号为CCTCC NO C201282,中国典型培养物保藏中屯、地址：中 国.武汉.武汉大学，保藏日期2012年6月19日。 W08] 在本发明的一个优选实施例中，所述人肺癌化-2高转移细胞系的染色 体除了具有化-2细胞中出现的两个染色体异位之外还具有另一个异位：deH9) 巧pter - pll: :lqll - qter);除此之外，XL-2高转移细胞中还有一个marker染色体。
[0009] 在本发明的一个优选实施例中，所述人肺癌化-2高转移细胞系的肺转移率90 %。
[0010] 在本发明的第二方面，提供所述人肺癌化-2高转移细胞系的用途，用于筛选肺癌 转移相关基因。
[0011] 在本发明的第Ξ方面，提供一种筛选潜在的肺癌转移相关基因的方法，所述方法 包括如下步骤：将所述的人肺癌化-2高转移细胞系与人肺癌细胞化-2中表达的基因比较， 选出所述的人肺癌化-2高转移细胞系中在统计学上表达上调的基因，该基因为潜在的肺 癌转移相关基因。
[0012] 在另一优选例中，该方法还包括：在所获得的潜在的肺癌转移相关基因进行进一 步的细胞试验和/或动物试验，W选出对于肺癌的而转移起确切作用的基因。
[0013] 在本发明的第四方面，提供所述的人肺癌化-2高转移细胞系的用途，用于筛选抗 肿瘤转移药物。
[0014] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0015] 图1为化-2细胞上皮特性及染色体核型分析示意图。
[0016] 图2为化-2细胞II型肺泡起源及肺腺癌特点示意图。
[0017] 图3为第一、Ξ、五轮筛选获得的人肺癌化-2高转移细胞系体外迁移、侵袭能力比 较示意图。
[0018] 图4为化-2高转移细胞染色体核型分析示意图。
[0019] 图5为人肺癌化-2细胞与人肺癌化-2高转移细胞系体内转移能力比较示意图。
[0020] 图6为人肺癌化-2细胞与人肺癌化-2高转移细胞系之间侵袭、迁移、增殖能力的 比较示意图。 阳02U 图7为克隆形成实验检测人肺癌化-2细胞与人肺癌化-2高转移细胞系之间单个 细胞增殖能力示意图。
【具体实施方式】
[0022] 本发明人经过长期的研究和反复的筛选，找到一种肺癌转移率高且恶性程度高的 人肺癌化-2高转移细胞系，所述的人肺癌化-2高转移细胞系是一种理想的研究肿瘤转移 的模型。基于此完成了本发明。人肺癌高转移细胞肿瘤细胞存在一定的异质性，它们之间 的转移潜能存在差异。
[0023] 本发明进行反复的筛选，旨在找到转移潜能高的人肺癌化-2高转移细胞系。
[0024] 与原发瘤细胞相比，经筛选后的细胞可能有一些特殊的性状赋予了它们特殊的转 移能力。通过寻找运些机制，设计相应的阻断祀点，即可W抑制转移。并且，经过传代筛选 后的高转移潜能的肿瘤细胞可W具有更强的侵袭性和转移性，易粘附、高产溶解酶W及具 有各种抗宿主免疫防御的特性，因而也更容易发生转移。
[0025] 因此，本发明人从原发性肿瘤细胞出发，经过多代筛选，找到了具有特殊高转移能 力的肿瘤细胞亚系。具体而言，本发明所述的人肺癌化-2高转移细胞系是通过W下方法、 经过长期的分析和筛选而获得的：将人肺癌化-2细胞移植至T细胞、B细胞、NK细胞缺陷的 N0D-SCID小鼠的皮下，待肿瘤长至足够大时手术切除肿瘤，从小鼠体内获得肺转移灶，然后 按细胞皮下接种一皮下肿瘤切除（仅限前Ξ轮筛选）一肺转移灶一皮下移植一细胞建系反 复多代筛选得到自发性高转移动物模型，同时建立相应的高转移细胞系。本发明将该细胞 系定名为人肺癌化-2高转移细胞系，所述的人肺癌化-2高转移细胞系简称化-2sci，其是 W常规肺癌细胞化-2细胞，经动物体内循环筛选获得；所述常规肺癌细胞化-2细胞在中 国典型培养物保藏中屯、保藏，保藏号为CCTCC NO C201282。
[0026] 在体外建立人癌细胞是研究人类肿瘤的一个重要手段。肿瘤细胞的体外培养建株 式一项难度较大的工程，原发瘤组织直接用于体外建系的成功几率较低。本发明w新鲜的 经过体内5次反复筛选得到的人肺癌皮下高转移模型的皮下移植瘤作为体外培养建系的 瘤源，一方面可W增强癌细胞的活力，另一方面可W使新建细胞系本身具有较高的转移潜 能。在建系的过程中，本发明人不断摸索和调整培养条件和培养方法，同时保证培养环境的 相对稳定，成功地建立了人肺癌化-2高转移细胞系并存活。
[0027] 细胞形态学观察显示；所述的人肺癌化-2高转移细胞为典型的上皮样细胞， 细胞生长速度较快，倍增时间为37. 10 + 4. 90小时，而人肺癌化-2细胞的倍增时间为 31. 92 + 2. 73 小时。
[0028] 染色体分析证实：人肺癌化-2高转移细胞除了具有人肺癌化-2细胞中出现的两 个染色体异位之外还具有另一个异位：deH9) (9pter - pll: : Iqll - qter);除此之外， 化-2高转移细胞中还有一个marker染色体。
[0029] 人肺癌化-2高转移细胞系应用
[0030] 本发明还提供了人肺癌化-2高转移细胞系移植或人肺癌化-2高转移细胞系的用 途，包括但不限于用于：研究肿瘤（特别是肺癌）转移和/或侵袭的机制；筛选潜在的肺癌 转移相关基因；筛选抗肿瘤（特别是肺癌）转移的药物等。
[0031] 本发明还提供了一种筛选潜在的肺癌转移相关基因的方法，所述方法是将所述的 人肺癌化-2高转移细胞系中表达的基因与人肺癌化-2细胞中表达的基因比较，选出化-2 高转移细胞系在统计学上表达上调的基因，该基因因为潜在的肺癌转移相关基因。
[0032] 在细胞中检测相关基因的表达情况（或上调或下调）是本领域技术人员熟知的技 术，包括但不限于：基因忍片技术，免疫组织化学技术等，例如可将化-2高转移细胞的基因 表达情况与人肺癌化-2细胞的相关基因表达进行比较，从而找出具有统计学意义差异表 达的基因。
[0033] 本发明的优点在于：
[0034] (1)通过反复的体内筛选，成功建立了人肺癌化-2高转移细胞系模型及人肺癌 化-2高转移细胞系，其转移率高、转移稳定、直观性好、祀向性强。
[0035] (2)利用本发明的人肺癌化-2高转移细胞系，为肺癌的防治研究及抗转移治疗提 供了理想的模型。
[0036] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New化；rK:Cold Spring化rbor L油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0037] 1 材料 阳0測 1. 1标本来源
[0039] 患者，男，45岁，06年于上海市瑞金医院诊断为右肺腺癌，右上肺切除术后1年右 肾上腺、双肾、两肺、肝、后腹膜淋己结广泛转移，同时伴有大量腹水。于外科手术时取未污 染腹水标本lOOmL用于细胞分离、培养。所有操作均遵循人类组织标本使用原则。
[0040] 1.2实验动物 阳OW SPF级雄性BALB/c裸鼠，鼠龄6-8w，体重18-22g，由上海市肿瘤研究所提供，生产 许可证号为SCXK(沪）2012-0001 ;所有小鼠均在屏障系统中饲养，饲料和水自由摄入，使用 许可证号为SYXK (沪）2012-0001。 W42] 1. 3 质粒
[0043] pWP化-eGFP-2A-CBGr99质粒、pA2包装质粒，pMDG2包膜质粒由国家癌基因及相关 基因重点实验室惠赠。皿101感受态细菌购自TAKARA公司。
[0044] 1.4主要抗体
[0045] 免疫组化实验所用抗体，见表1。