专利名称：重组毒素蛋白的高水平表达的制作方法
重组毒素蛋白的高水平表达优先权要求本申请根据35 U. S. C. $119(e)要求2010年4月16日提交的美国临时申请系列号61/325，235,2010年4月9日提交的PCT/US 10/30573和2010年3月30日提交的美国临时申请系列号61/319，152的优先权。这些申请的内容特此通过引用整体并入本文。序列表本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，该序列表特此通过引用整体并入本文。创建于2011年3月16日的所述ASCII拷贝被命名为38194201. txt，其大小为156，975个字节。发明背景 微生物毒素蛋白在医学中用作针对产生毒素的微生物的疫苗接种的免疫原以及用作其他疫苗的载体蛋白质和佐剂，并且在科学研究中用作研究分子途径的工具。白喉毒素(DT)是由白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的产毒菌株合成和分泌的蛋白质性毒素。产毒菌株含有携帯毒素基因的噬菌体溶素原。DT被合成为535个氨基酸的多肽，其经历蛋白水解以形成成熟的毒素。成熟的毒素包含由ニ硫键连接的两个亚基A和B。由完整DT的C末端部分形成的B亚基使DT能够结合细胞膜并通过细胞膜进入到胞质中。一旦进入细胞，由完整DT的N末端部分形成的酶的A亚基催化延伸因子2 (EF-2)的ADP核糖基化。其结果是，EF-2被灭活、蛋白质合成停止和细胞死亡。白喉毒素是高度细胞毒性的，单个分子可以致死细胞，且10ng/kg的剂量可以杀死动物和人。CRM197蛋白是DT的无毒的、免疫学交叉反应的形式。已研究了其作为DT增强剂或疫苗抗原的潜在用途。CRM197是通过由产毒的P棒状杆菌噬菌体的亚硝基胍诱变构建的非产毒噬菌体P 197tQX_感染的白喉杆菌产生的。CRM197蛋白具有与DT相同的分子量，但在A亚基中有单碱基变化(鸟嘌呤变为腺嘌呤)的差异。这ー单碱基变化导致氨基酸置换(谷氨酸置換为甘氨酸)，并消除了 DT的毒性性质。使用CRM197作为载体蛋白的结合多糖疫苗已批准人体使用。疫苗包括MenVe0 (Novartis Vaccines and Diagnostics)(标明用于预防由脑膜炎球菌亚群A、C、Y和W-135引起的侵袭性脑膜炎球菌疾病的疫苗)、Menjugate (Novartis Vaccines)(脑膜炎双球菌C群结合疫苗)、和Prevnar (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)(革巴向于肺炎链球菌的七种血清型的儿童肺炎疫苗)和HibTITER (Wyeth)(流感嗜血杆菌b型疫苗)。此外，CRM197具有用作白喉杆菌疫苗接种的增强抗原的潜力并正在研究作为用于其它疫苗中的载体蛋白。用于批准的治疗和研究用途的CRM197高水平表达的方法尚未见报道。CRM197已在例如白喉杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中以数十mg/L的水平表达。单剂Prevnar结合疫苗含有大约20ii g CRM197。因此，用于经济地以约lg/L或以上的水平生产CRM197的方法将极大地促进疫苗研究和生产。由霍乱弧菌(Vibrio cholera)产生的霍乱毒素(CTX)是ー种导致以腹泻和呕吐为特征的感染的细菌性病原体，也是ー种ADP-核糖基化毒素。CTX是由六个蛋白质亚基组成的低聚复合物单ー拷贝的霍乱毒素A亚基(CTA)和五个拷贝的霍乱毒素B亚基(CTB)。这五个各重12kDa的B亚基形成了ー个五元环。A亚基具有Al部分CTAl和A2链CTA2，CTAl是将G蛋白进行ADP-核糖基化的球状酶，而CTA2形成紧靠地位于B亚基环中心孔中的伸展的a螺旋。该环结合到宿主细胞表面上的GMl神经节苷脂受体上，导致整个复合物的内化。一旦内化，CTAl链通过ニ硫键的还原释放。然后CTAl被激活并且催化腺苷酸环化酶的ADP核糖基化。由此导致的腺苷酸环化酶活性的增强提高了环AMP的合成，这导致大量的流体和电解质流出并且导致腹泻。CTX的B亚基尽管是相对无害的，但仍保留了其结合到GMl神经节苷脂受体上的能力。因此，CTB可用于促进化学地或遗传地偶联的外来抗原的粘膜摄取。已证实其诱导粘膜免疫和系统免疫，并且是用于可食用疫苗的生产的候选物。由于其结合偏好，CTB也可用作神经元示踪物。百日咳毒素(PTX) 是由导致百日咳病的人呼吸道细菌性病原体百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)产生的外毒素和毒力因子。百日咳全毒素是具有AB 5结构的多亚基复合物。酶活性的A亚基(SI)是修饰哺乳动物细胞内几种异三聚体G蛋白的a亚基的ADP-核糖基转移酶，而B低聚物(S2、S3、两个拷贝的S4和S5)结合细胞上的糖结合物受体。该毒素的五个亚基由百日咳类毒素操纵子表达。已研究了用于保护性疫苗和用作疫苗佐剂的百日咳毒素的无毒变异体。也需要百日咳毒素蛋白来用于研究，例如用于对G蛋白信号传导途径的研究。由破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生的破伤风毒素是具有150kDa分子量的神经毒素。它由以下两部分组成100kDa重链或B-链和50kDa轻链或A-链。这些链通过ニ硫键连接。B链结合到位于神经元膜上的ニ唾液酸神经节苷脂(⑶2和⑶Ib)上。A链(一种锌内肽酶)攻击囊泡相关膜蛋白(VAMP)。A链的作用通过降解小突触泡蛋白阻止了受影响的神经元释放抑制性神经递质GABA( Y-氨基丁酸)和甘氨酸。其后果是最小刺激引起肌肉的危险的过度活动ー感官刺激对运动反射的抑制失败。这导致主动肌和拮抗肌肌肉组织的全身性收缩，被称为强直性痉挛。破伤风毒素C片段(Tet C或TTC)是通过破伤风毒素的蛋白酶切割(例如用木瓜蛋白酶)或通过片段的重组表达而产生的50kD的多肽。它对应于C-末端的451个氨基酸(氨基酸位置865-1315)。C片段已表明为无毒性的。因为它以高特异性和亲和カ与神经元结合，TTC可用作神经元药物递送的靶向分子或用于研究目的。TTC蛋白也可潜在地用作疫苗载体蛋白并且在疫苗中用来避免破伤风梭菌感染。艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素B(TcdB)是由艰难梭菌产生的毒力因子，它导致医院获得性腹泻和假膜性结肠炎。TcdB和第二大梭菌毒素TcdA參与了假膜性结肠炎的发生。TcdB是约270kD的葡糖基化毒素，且可分成酶、易位和受体结合域。TcdB的前546个氨基酸包含酶区域，接着是推定的易位和受体结合域。TcdB具有作为艰难梭菌感染的保护性疫苗以及用于诊断检验及其开发的潜在用途。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A (ETA或PE)是一种II型ADPRT。就像它的家族成员白喉毒素和霍乱毒素ー样,它通过细胞延伸因子2的ADP-核糖基化来抑制蛋白质合成。铜绿假单胞菌外毒素A作为单体存在，由613个氨基酸的单ー多肽链^6kd)组成。ETA可潜在地用作疫苗偶联物。ETA的无毒性突变体已作为用于防御金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痕疾和伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)的疫苗接种的疫苗偶联物进行了研究。以足够满足不断扩大的需求的量来生产这些毒素已成为重大的挑战。当在常规蛋白质过表达系统中生产时，由于降解、不正确的折叠或这两者，取决于毒素的具体特征，例如大小和ニ级结构，毒素蛋白仅以非常低的浓度以活性形式回收。因此，需要以低成本生产大量可溶性和/或活性形式的这些毒素的方法。
发明内容
本发明涉及在假单胞菌宿主细胞中生产重组毒素蛋白的方法，所述方法包括将 编码毒素蛋白的核苷酸序列接合到表达载体中；用该表达载体转化假单胞菌宿主细胞；和在适合重组毒素蛋白表达的培养基中培养已转化的假单胞菌宿主细胞；其中该重组毒素蛋白是CRM197、白喉毒素、霍乱全毒素、霍乱毒素B、百日咳毒素、破伤风毒素C片段、艰难梭菌毒素B或铜绿假单胞菌外毒素A。在实施方式中，重组毒素蛋白是霍乱毒素B、霍乱全毒素、百日咳毒素、破伤风毒素C片段、艰难梭菌毒素B或铜绿假单胞菌外毒素A。在其他实施方式中，重组毒素蛋白是霍乱毒素B、霍乱全毒素、百日咳毒素、破伤风毒素C片段或艰难梭菌毒素B。在其他实施方式中，重组毒素蛋白是CRM197、白喉毒素、霍乱全毒素、霍乱毒素B、百日咳毒素、破伤风毒素C片段或艰难梭菌毒素B。在某些实施方式中，重组蛋白以约0. 2克/升至约12克/升的可溶性和/或活性毒素蛋白的产率生产。在特定实施方式中，可溶性和/或活性毒素蛋白的产率为约0. 2g/L、约 0. 3g/L、约 0. 4g/L、约 0. 5g/L、约 0. 6g/L、约 0. 7g/L、约 0. 8g/L、约 0. 9g/L、约 lg/L、约
I.5g/L、约 2g/L、约 2. 5g/L、约 3g/L、约 3. 5g/L、约 4g/L、约 4. 5g/L、约 5g/L、约 5. 5g/L、约6g/L、约 6. 5g/L、约 7g/L、约 7. 5g/L、约 8g/L、约 8. 5g/L、约 9g/L、约 9. 5g/L、约 10g/L、约
10.5g/L、约 I lg/L、约 12g/L、约 0. 2g/L-约 0. 5g/L、约 0. 2g/L_ 约 lg/L、约 0. 2-约 2g/L、约0. 3g/L-约 0. 6g/L、约 0. 3g/L-约 lg/L、约 0. 3-约 2g/L、约 0. 4-约 0. 7g/L、约 0. 4-约 Ig/L 约 0. 4-约 2g/L、约 0. 4-约 3g/L、约 0. 5g/L_ 约 lg/L、约 0. 5g/L_ 约 2g/L、约 0. 5g/L_ 约3g/L、约 0. 5g/L-约 4g/L、约 0. 5g/L_ 约 5g/L、约 0. 5g/L_ 约 6g/L、约 0. 5g/L_ 约 7g/L、约0. 5g/L-约 8g/L、约 0. 5g/L-约 9g/L、约 0. 5g/L_ 约 10g/L、约 0. 5g/L_ 约 I lg/L、约 0. 5g/L-约 12g/L、约 lg/L-约 2g/L、约 lg/L-约 3g/L、约 lg/L-约 4g/L、约 lg/L-约 5g/L、约 Ig/L-约 6g/L、约 lg/L-约 7g/L、约 lg/L-约 8g/L、约 lg/L-约 9g/L、约 lg/L-约 10g/L、约 Ig/L-约 llg/L、约 lg/L-约 12g/L、约 2g/L-约 3g/L、约 2g/L_ 约 4g/L、约 2g/L_ 约 5g/L、约2g/L-约 6g/L、约 2g/L-约 7g/L、约 2g/L_ 约 8g/L、约 2g/L_ 约 9g/L、约 2g/L_ 约 10g/L、约2g/L-约 I lg/L、约 2g/L-约 12g/L、约 3g/L_ 约 4g/L、约 3g/L_ 约 5g/L、约 3g/L_ 约 6g/L、约 3g/L-约 7g/L、约 3g/L-约 8g/L、约 3g/L_ 约 9g/L、约 3g/L_ 约 10g/L、约 3g/L_ 约 Hg/L、约 3g/L-约 12g/L、约 4g/L-约 5g/L、约 4g/L_ 约 6g/L、约 4g/L_ 约 7g/L、约 4g/L_ 约 8g/L、约 4g/ L-约 9g/L、约 4g/L-约 10g/L、约 4g/L_ 约 I lg/L、约 4g/L_ 约 12g/L、约 5g/L_ 约6g/L、约 5g/L-约 7g/L、约 5g/L-约 8g/L、约 5g/L_ 约 9g/L、约 5g/L_ 约 10g/L、约 5g/L_ 约llg/L、约 5g/L-约 12g/L、约 6g/L-约 7g/L、约 6g/L_ 约 8g/L、约 6g/L_ 约 9g/L、约 6g/L_ 约10g/L、约 6g/L-约 llg/L、约 6g/L-约 12g/L、约 7g/L_ 约 8g/L、约 7g/L_ 约 9g/L、约 7g/L-约 10g/L、约 7g/L-约 I lg/L、约 7g/L-约 12g/L、约 8g/L_ 约 9g/L、约 8g/L_ 约 10g/L、约8g/L-约 I lg/L、约 8g/L-约 12g/L、约 9g/L_ 约 10g/L、约 9g/L_ 约 I lg/L、约 9g/L_ 约 12g/L、约 lOg/L-约 I lg/L、约 lOg/L-约 12g/L 或约 llg/L-约 12g/L。在实施方式中，将编码毒素蛋白的核苷酸序列与分泌信号编码序列融合，分泌信号编码序列表达时指引毒素蛋白向周质转移。在实施方式中，宿主细胞在至少ー种蛋白酶的表达上存在缺陷或者宿主细胞过表达至少ー种折叠调节因子，或它们的组合。在实施方式中，重组毒素蛋白是CRM197，和宿主细胞在HslU、HslV, PrcU DegPUDegP2和AprA的表达上存在缺陷。在相关实施方式中，重组毒素蛋白与分泌前导序列即Azu、IbpS31 A、CupA2、PbpA20V或Pbp融合。在实施方式中，重组毒素蛋白是CRM197，且宿主细胞在HslU和HslV或Prcl或DegPl或DegP2或AprA的表达上存在缺陷。在特定实施方式中，重组毒素蛋白是CRM197，且宿主细胞在沙雷氏菌溶素(Serralysin)、HslU、HslV,PrcU DegPU DegP2或AprA的表达上存在缺陷，或者宿主细胞过表达DsbA、DsbB, DsbC和DsbD0在实施方式中，宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且重组毒素蛋白与分泌前导序列Azu融合。在实施方式中，宿主细胞在沙雷氏菌溶素的表达上存在缺陷，且重组毒素蛋白与分泌前导序列Pbp或Azu融合。在实施方式中，宿主细胞在HslU和HslV的表达上存在缺陷，且重组毒素蛋白与分泌前导序列Pbp或Azu融合。在实施方式中，重组毒素蛋白是CRM197，且宿主细胞是野生型，其中重组毒素蛋白与分泌前导序列Pbp或Azu融合。在实施方式中，重组毒素蛋白是CRM197并且重组毒素蛋白与分泌前导序列Azu、Pbp、IbpS31A、CupA2 或 PbpA20V 融合。在其他实施方式中，重组毒素蛋白是霍乱毒素B，且宿主细胞在Lon、La和AprA的表达上存在缺陷，或者宿主细胞在HslU、HslV, Prcl、DegPl、DegP2和AprA的表达上存在缺陷。在相关实施方式中，宿主细胞在Lon、La和AprA的表达上存在缺陷，而且其中重组毒素蛋白与分泌前导序列Pbp A20V融合。在其他实施方式中，重组毒素蛋白是百日咳毒素SI E129A R9K，且宿主细胞在以下的表达上存在缺陷Lon、La和AprA ;GrpE、DnaK和DnaJ ；HtpX ； RXFO1590 ；或ppiB(RXF05345)。在相关实施方式中，重组毒素蛋白与它的天然分泌前导序列融合。在其他实施方式中，重组毒素蛋白是破伤风毒素C，且宿主细胞在HslU、HslV,Prcl、DegPl、DegP2和AprA的表达上存在缺陷。在相关实施方式中，重组毒素蛋白与分泌前导序列DsbC、Pbp A20V或CupA2融合。在其他实施方式中，重组毒素蛋白是破伤风毒素C，且宿主细胞在Lon、La和AprA的表达上存在缺陷。在相关实施方式中，重组毒素蛋白与分泌前导序列DspA融合。在其他实施方式中，重组毒素蛋白是破伤风毒素C，且宿主细胞在GrpE、DnaK和DnaJ的表达上存在缺陷。在相关实施方式中，重组毒素蛋白与分泌前导序列NikA融合。在其他实施方式中，重组毒素蛋白是艰难杆菌毒素B，且宿主细胞在以下的表达上存在缺陷HtpX ；DegPl ;HslU、HslV、Prcl和Prc2 ;或Lon和DegP2，或者宿主细胞既在Lon、Prcl、DegP2和AprA的表达上存在缺陷又过表达DegP2 S219A。在实施方式中，在活性测定中测定重组毒素蛋白的活性，其中所生产的可溶性毒素蛋白中约40%至约60%确定为有活性。在相关实施方式中，活性测定为免疫学測定、受体结合测定或酶測定。在本发明的实施方式中，表达载体包含可操作地连接到蛋白质编码序列上的Iac衍生启动子，而且其中培养包括用浓度为约0. 02至约I. OmM的IPTG诱导该启动子，诱导时细胞密度是约40至约200吸光度单位(AU)的光密度，培养物的pH值为约6至约7. 5，生长温度为约20至约35摄氏度。在实施方式中，宿主细胞是假单胞菌细胞。在相关实施方式中，宿主细胞是荧光假单胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)。 在本发明的实施方式中，为了在假单胞菌宿主细胞中表达而对核苷酸序列进行了优化。在相关实施方式中，为了在假单胞菌属宿主细胞中表达而对核苷酸序列进行了优化。在其他相关实施方式中，为了在荧光假单胞菌宿主细胞中表达而对核苷酸序列进行了优化。在实施方式中，百日咳毒素是野生型或SI E129A R9K。在实施方式中，铜绿假单胞菌外毒素A是野生型、CRM66或rERA。在本发明的实施方式中，表达载体进ー步包含邻近分泌信号的编码序列的标签序列。在实施方式中，表达载体进ー步包含邻近毒素蛋白的编码序列的标签序列。本发明还提供根据本文所述方法生产的重组毒素蛋白。在实施方式中，重组毒素蛋白是CRM197、白喉毒素、霍乱全毒素、霍乱毒素B、百日咳毒素、破伤风毒素C片段、艰难梭菌毒素B或铜绿假单胞菌外毒素A。在实施方式中，外毒素A是野生型、CRM66或rERA。在某些实施方式中，重组毒素蛋白在荧光假单胞菌的菌株中生产，该菌株在本文中确认为生产高产率的毒素或生产高质量的毒素。在某些实施方式中，重组毒素蛋白在荧光假单胞菌的菌株中生产，该菌株在本文中描述为生产最高产率的毒素蛋白。在其他实施方式中，重组毒素蛋白在本文描述为用于毒素发酵生产的菌株的菌株中生产。援引并入本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同特别地和単独地指示各单个公开、专利或专利申请通过引用并入本文。
本发明的新特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过參考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解。图I. CRM197的高通量表达分析。利用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析利用图IB所示的DNA序列表达的CRM197蛋白。在由SDS-CGE数据生成的凝胶样图像中显示了所测试的40个CRM197表达菌株的可溶性部分。如表10所述的菌株名称列于各个泳道上方。荧光假单胞菌表达的CMR197在SDS-CGE上作为 58kDa的单一条带(左侧箭头)迁移。第一个和最后一个泳道内的分子量标记是16、20、29、48、69和119kDa。图2.霍乱毒素B的高通量表达分析。利用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析应用SEQ ID NO :23中所示的DNA序列表达的霍乱毒素B蛋白。在由SDS-CGE数据生成的凝胶样图像中显示了所测试的40个霍乱毒素表达菌株的可溶性部分。如表11所述的菌株名称列于各个泳道上方。诱导的CTB在SDS-CGE上作为 11. 5kDa的单一条带(左侧箭头)迁移。第一个和最后一个泳道内的分子量标记是16、20、29、48、69和119kDa。图3.百日咳类毒素操纵子。显示了具有4210个碱基对的BPET0X_S1_R9K &E129A。图4.百日咳类毒素的DNA序列。图中显示了带翻译结果的百日咳毒素SI R9KE129A DNA序列(SEQ ID NO :24)。该序列来源于Genebank项目M13223。亚基S1-S5和信号序列在序列上方标明。SI中的R9K和E129A突变用下划线标注。编码的蛋白质按出现顺序分别披露为 SEQ ID NO : 25、26、28、29 和 27。图5.百日咳类毒素亚基的氨基酸序列。分泌信号用下划线标注。A. SI亚基(R9KE129A) (SEQ ID NO 25)。B. S2 亚基(SEQ ID NO 26)。C. S3 亚基(SEQ ID NO 27)。D. S4亚基(SEQ ID NO 28)。E. S5 亚基(SEQ ID NO 29)。 图6.百日咳类毒素表达样品的Western印迹分析。菌株名称已列于各个泳道上方。诱导的 Ptx 以 ll_26kDa 范围内的多个条带(SI :26. IKda, S2 20. 9Kda, S3 21. 8KDa,S4(2x) 12KDa, S5 =IlKDa)进行迁移。A.还原的样品。B.非还原的样品。两个图面泳道I-分子量标记(15、20、25、37、50、75、100、150、250kDa);泳道 2-空的;泳道 3-菌株 321 ;泳道4-菌株322 ;泳道5-菌株323 ;泳道6-菌株324 ;泳道7-菌株325 ;泳道8-菌株326 ；泳道9-菌株327 ;泳道10-菌株328。图7.破伤风毒素C片段表达。利用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析在荧光假单胞菌中表达的破伤风毒素C片段。在由SDS-CGE数据生成的凝胶样图像中显示了来自所测试的40个破伤风毒素表达菌株的可溶性部分。如表15所述的菌株名称列于各个泳道上方。诱导的破伤风毒素C片段在SDS-CGE上以 51. 6kDa的单一条带(左侧箭头)迁移。第一个和最后一个泳道内的分子量标记是16、20、29、48、69和119kDa。图8. TcdB表达。利用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析在荧光假单胞菌中表达的TcdB。在由SDS-CGE数据生成的凝胶样图像中显示了来自所测试的24个TcdB表达菌株的可溶性部分。如表18所述的菌株名称以及空提取物和參考标准(List Biologicals)都列于各个泳道上方。诱导的TcdB在SDS-CGE上以 300kDa的单一条带(左侧箭头)迁移。第一个和最后一个泳道内的分子量标记是16、20、29、48、69和119kDa。图9.外毒素A氨基酸序列。图中显示了铜绿假单胞菌外毒素A的氨基酸序列(SEQID N0:34)。图中显示了三种外毒素A蛋白野生型、CRM66和rEPA。在变异体CRM66中，His426(粗体，下划线标注的文字)如序列上方所示被Tyr取代。在rEPA中，Glu553 (粗体，下划线标注的文字)如序列上方所示缺失。图10.可溶性破伤风毒素C和霍乱毒素B在荧光假单胞菌发酵培养物中的产生。SDS-CGE分析。泳道1-16、20、29、48、69和119kDa分子量标记。泳道2和4-分别是表达霍乱毒素B的PS538-088U5和U6发酵物的诱导前样品，泳道3和5分别是表达霍乱毒素B的PS538-088U5和U6发酵物的诱导后样品，通过右侧箭头指示。图11.可溶性破伤风毒素C片段在荧光假单胞菌发酵培养物中的产生。A. SDS-CGE分析。泳道1-16、20、29、48、69和119kDa分子量标记。泳道2、3和4分别是表达破伤风韋素C片段的PS538-529U1、PS538-546U5和PS538-547U7发酵物的诱导后样品，通过右侧箭头指示。B. Western印迹分析。通过Western印迹法评估来自菌株PS538-538 (Ul和U2)、PS538-548 (U3 和 U4)、PS538-558 (U5 和 U6)和 PS538-568 (U7 和 U8)的发酵样品。发酵单位和诱导后小时数(10、18、124)已在各个泳道上方标出。分子量(MW)标准显示在印迹左侦牝破伤风毒素C參考标准(Std ;List Biological, Cat# 193)显示在右側。先用源自兔的多克隆抗破伤风毒素C片段(Abeam, Cat# ab34890),然后用源自山羊的抗兔IgG过氧化物酶(Pierce, Cat# :31460)探测印迹。免疫纯金属强化 DAB (Immunopure Metal EnhancedDAB) (Pierce 34065)用于检测。图12.可溶性艰难梭菌B毒素蛋白在荧光假单胞菌发酵培养物中的产生。泳道1_16、20、29、48、69和119kDa分子量标记。标记大小也根据它们在泳道I中的迁移显不在右侧相对应的位置上。泳道2、3和4分别是表达艰难梭菌B毒素蛋白的PS538-671 U5和PS538-647 U7发酵物的诱导后样品，通过右侧箭头指示。图13.野生型百日咳类毒素的DNA序列。图中显示了带翻译结果的野生型百日咳 毒素的DNA序列(SEQ ID NO 35)。序列来自Genebank项目M13223。亚基S1-S5和信号序列已显示在序列上方。编码的蛋白质按出现顺序分别显示为SEQ ID N0:41-45。图14.霍乱全毒素的氨基酸序列和DNA序列。A. CTA氨基酸序列(SEQ ID NO:38)，具有分泌前导序列(下划线标注)(AE003852 ;蛋白质ID AAF94614. I)。B. CTB氨基酸序列(SEQ ID NO :39)，具有分泌前导序列(下划线标注)(GeneBank AE003852 ;蛋白质ID AAF94613. I)。C. CTX DNA序列(SEQ ID NO :40)，显示了 A和B亚基，并显示出翻译结果(Genbank AE003852)。编码的蛋白质按出现顺序分别显示为SEQ ID NO :38和39。图15.在荧光假单胞菌发酵培养物中的可溶性rEPA生产的SDS-CGE凝胶样图像。利用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)分析在荧光假单胞菌发酵培养物中表达的可溶性rEPA。在由SDS-CGE数据生成的凝胶样图像中显示了所测试的在诱导后0和24小时由表达菌株PS538-1633 (ul 和 u2)、PS538-1640 (u3 和 u5)和 PS538-1670 (u6、u7 和 u8)发酵产生的可溶性部分。Mw =分子量标准(16、20、29、48和69千道尔顿)。图16.在荧光假单胞菌发酵培养物中的可溶性rEPA产生趋势。通过对处于各自发酵物(ul、u2、u3、u6、u7 和 u8)中的菌株(PS538-1633、PS538_1640 和 PS538-1670)进行SDS-CGE分析而确定的可溶性rEPA表达水平对诱导后时间作图。图17.在荧光假单胞菌发酵培养物中的可溶性rEPA产生的Western印迹分析。利用Western印迹分析来分析在荧光假单胞菌发酵培养物中表达的可溶性rEPA。利用对于铜绿假单胞菌外毒素A特异性的抗体在Western印迹分析中显示诱导后0和24小时来自表达菌株 PS538-1633 (ul)、PS538-1640 (u3 和 u5)和 PS538-1670 (u6 和 u8)发酵物的可溶性部分。Mw =分子量标准。std = rEPA标准品。图18.在荧光假单胞菌发酵培养物中的可溶性CRM197产生的SDS-CGE凝胶样图像。利用毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)来分析在荧光假单胞菌发酵培养物中表达的CRM197。在由SDS-CGE数据生成的凝胶样图像中显示了在所测试的诱导后各个不同时间(0、16、21和 23 小时)由表达菌株 PS538-772 (ul 和 u2)、PS538-776 (u3 和 u5)和 PS538-782 (u6 和u7)的各种发酵物所产生的可溶性部分。Mw=分子量标准(16、20、29、48、68和119千道尔顿)。
图19.在荧光假单胞菌发酵培养物中的可溶性CRM197产生趋势。如通过对处于各自发酵物(ul、u2、u3、u6 和 u7)中的不同菌株(PS538-772、PS538-776 和 PS538-782)进行SDS-CGE所确定的可溶性CRM197表达水平对诱导后时间作图。图20.在荧光假单胞菌发酵培养物中的可溶性CRM197产生的Western印迹分析。利用Western印迹分析来分析在荧光假单胞菌发酵培养物中表达的CRM197。利用白喉毒素特异性抗体在Western印迹分析中显示在所测试的诱导后各个不同时间(0、16、21和23小时)由表达菌株 PS538-772 (ul 和 u2)、PS538-776 (u3 和 u5)和 PS538-782 (u6 和 u7)的各种发酵物的可溶性部分。Mw =分子量标准(37、50、75、100、150和250千道尔顿)。STD =CRM197 标准。发明详述
毒素ADP-核糖基化毒素ADP-核糖基化毒素(ADPRT)促进烟酰胺和NAD的N-核糖之间的N-糖基键切割并且将ADP-核糖部分转移至靶蛋白。ADPRT根据他们各自的靶标分类为四个家族。I型ADPRT以异聚GTP-结合蛋白为靶标。它们包括霍乱毒素(CTX)、百日咳毒素(PTX)和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)。II型ADPRT (白喉毒素和假单胞菌外毒素A)修饰延伸因子
2(EF2) o III 型 ADPRT (肉毒梭菌(Clostridium botulinum) C3 胞外酶)使小 GTP-结合蛋白ADP-核糖基化。IV型ADPRT使肌动蛋白ADP-核糖基化。这些肌动蛋白特异性的ADPRT包括ニ元毒素家族，该家族包括肉毒梭菌C2毒素、产气荚膜梭菌(C. perfringens) t -毒素、艰难梭菌毒素(一种不同于TcdA和TcdB的毒素，由Popoff等人，1988, “Actin-specificADP-ribosyItransferase produced by a Clostridium difficile strain,，. infectionand Immunity 56(9) :2299-2306描述,其通过引用并入本文)、螺状梭菌(C. spiroforme)毒素和腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)营养期杀虫蛋白(VIP)。已经确定来自各类型的ADPRT的数个酶组分的结构带有或不带有NAD，并且在例如通过引用并入本文的 Tsuge 等人,2008, “Structural basis of actin recognitionand arginine ADP-ribosyIation by Clostridium perfringens-toxin,，，PNAS 105(21)7399-7404中讨论。典型的肌动蛋白特异性ADPRT具有两个相似的结构域对催化活性至关重要的C结构域；以及对与结合和易位亚基的相互作用很重要的N结构域。相比之下，来自沙门氏菌的SpvB和III型ADPRT C3仅具有ー个ADP-核糖基转移酶结构域并且缺乏N末端衔接子结构域。在所有的IV型ADPRT中，包括两个关键的谷氨酸残基的EXE基序存在于催化中心处。EXE基序的前一谷氨酸被认为是ADP-核糖基转移酶的关键残基，它在肌动蛋白中由Arg-177去质子化。后一谷氨酸与N-核糖上的0’2形成氢键，这被认为稳定了羰基碳鐵(oxocarbenium)阳离子。Barth 等人，2004,“Binary Bacterial Toxins Biochemistry, Biology, andApplication of Common Clostridium and Bacillus Proteins,，，Microbiology andMolecular Biology Reviews 68(3) :373-402 ;Mueller_Dieckmann 等人，“Structure ofmouse ADP-ribosylhydroIase 3 (mARH3), ” Acta Cryst F64 :156-162 ;Kulich 等人，1995，“Expression of Recombinant Exoenzyme S of Pseudomonas aeruginosa, ”Infectionand Immunity 63(1) :1-8 ;Sakurai 等人，2009,“Clostridium perfringens Iota-Toxin Structure and Function,，，Toxins 1:208-228;以及 Schirmer 等人，2002, “TheADP-ribosylating Mosquitocidal Toxin from Bacillus sphaericus,，，The Journal ofBiological Chemistry 277(14) :11941-11948 进ー步描述了 ADPRT，它们全部通过引用并入本文。在本发明的实施方式中，产生选自包括ADPRT的组的重组毒素蛋白。在实施方式中，ADPRT的组由和/或WT)和假单胞菌外毒素A组成。在实施方式中，ADPRT的组由CTX(CTA和/或CTB)、PTX和假单胞菌外毒素A组成。在其他实施方式中，产生选自包括I型ADPRT的组的重组毒素蛋白。在实施方式中，I型ADPRT的组由CTX(CTA和/或CTB)和PTX组成。在其他实施方式中，产生选自包括II型ADPRT的组的重组毒素蛋白。在实施方式中，II型ADPRT的组由DT(CRM197和/或WT)和假单胞菌外毒素A组成。在其他实施方式中，产生选自包括IV型ADPRT的组的重组毒素蛋白。在实施方式中，IV型ADPRT是TcdB。CRM197 和 DT 交叉反应物质197(CRM197)是由具有错义突变的DT基因产生的白喉毒素(DT)变异体。DT是ー种ADP-核糖基化毒素；CRM197缺乏DT的ADP-核糖基转移酶(ADPRT)活性，且因此是无毒的。CMR197的基因具有单碱基置換，从而导致在残基52处引入谷氨酸而不是甘氨酸。(參见，例如，Bishai 等人，1987,“High-Level Expression of a ProteolyticallySensitive Diphtheria toxin Fragment in Escherichia coli,，，J. Bact. 169 (11)5140-51,Giannini 等人，1984,“The Amino-Acid Sequence of Two Non-Toxic Mutants ofDiphtheria toxin CRM45 and CRM197,，，Nucleic Acids Research 12 (10) :4063-9,以及GenBank登录号1007216A，全部通过引用并入本文。)CRM197蛋白可通过本领域已知的方法或通过在白喉杆菌或其他微生物中表达而低水平制备。天然存在的或野生型白喉毒素可从产毒素菌株获得，该产毒素菌株可从包括美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)在内的多种公共资源获得。用于在白喉杆菌中生产CRM197蛋白的质粒系统在例如美国专利号5，614，382，“Plasmid for Production of CRM Protein and Diphtheria toxin” 中有描述,其通过引用整体并入本文。核苷酸序列可利用重组DNA技术(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning,a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, I989 描述)制备，且也基于棒状杆菌噬菌体P所携帯的白喉毒素野生型结构基因的已知DT核苷酸序列，通过定点诱变来制备。(參见，例如，Greenfield 等人，1993, “Nucleotide Sequence of thestructural Gene for Diphtheria toxin Carried by Corynebacteriophage 18,，，ProcNat Acad Sci 80 :6953_7，通过引用并入本文。)如本文别处所述，核苷酸序列可以进行优化。在本发明的实施方式中，利用实施例I中所述的任何宿主菌株结合实施例I中所述的任何表达载体(质粒)来生产CRM197或DT。在实施方式中，为了在假单胞菌宿主细胞中表达而优化核酸序列。在实施方式中，所用的表达载体包含表达与重组CRM197或DT蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前导序列的构建体。在实施方式中，使用天然分泌前导序列。在某些实施方式中，CRM197或DT蛋白表达有标签，例如，纯化标签。在实施方式中，本发明的方法用于以约0. 5g/L至至少约12g/L的产率生产CRM197或DT。霍乱毒素由霍乱弧菌产生的霍乱毒素(CTX)也是ー种ADP-核糖基化毒素。霍乱毒素(CTX)是由六个蛋白质亚基组成的低聚复合物単一拷贝的霍乱毒素A亚基(CTA)和五个拷贝的霍乱毒素B亚基(CTB)。五个各重12kDa的B亚基形成五元环。A亚基具有Al部分CTAl和A2链CTA2，CTAl是使G蛋白ADP-核糖基化的球状酶，而CTA2形成了一个紧贴地位于B亚基环中心孔中的伸展的a螺旋。该环结合到位于宿主细胞表面上的GMl神经节苷脂受体上，从而导致整个复合物的内化。一旦内化，CTAl链由于ニ硫键的还原而释放。随后CTAl被激活并且催化腺苷酸环化酶的ADP核糖基化。由此导致的腺苷酸环化酶活性的增强提高了环AMP的合成，这导致大量的流体和电解质流出并且导致腹泻。CTX的B亚基尽管是相对无害的，但保留了其结合到GMl神经节苷脂受体上的能力。因此，CTB可用于促进化学地或遗传地偶联的外来抗原的粘膜摄取。已证实其诱导粘 膜免疫和系统免疫，并且是用于可食用疫苗生产的候选物。由于其结合偏好，CTB也可用作神经元示踪物。CTB的应用及其结构特征在例如Nozoye等人,2009, “Production of Ascarissuum Asl4 Protein ana Its Fusion Protein with Cholera Toxin B Subunit in RiceSeeds,，，Parasitology 995-1000 ；Harakuni 等人，2005, “Heteropentameric CholeraToxin B Subunit Chimeric Molecules Genetically Fused to a Vaccine AntigenInduce Systemic and Mucosa丄 immune Responses a Potential New Strategy to TargetRecombinant Vaccine Antigens to Mucosa丄 Immune Systems, ’’Infection and Immunity73(9) :5654-5665 ；Price 等人，2005, “Intranasal Administration of RecombinantNeisseria gonorrhoeae Transferrin Binding Proteins A and B Conjugated tothe Cholera Toxin B Subunit Induces Systemic and Vaginal Antibodies inMice,，，Infection and Immunity 73(7) :3945-3953;和 Sun 等人，1999, “IntranasalAdministration of a Schistosoma mansoni Glutathione S-Transferase-CholeraToxoid Conjugate Vaccine Evokes Antiparasitic and Antipathological Immunity inMice, ” J. Immunol. 163 :1045-1052中已有描述，它们全部通过引用并入本文。在本发明的实施方式中，利用本文实施例I中所述的任何宿主菌株结合实施例3中所述的任何表达载体来生产CTB或CTX。在实施方式中，为了在假单胞菌宿主细胞中表达而优化了核酸序列。在实施方式中，所用的表达载体包含表达与重组CTB或CTX蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前导序列的构建体。在实施方式中，使用天然分泌前导序列。在某些实施方式中，CTB或CTX蛋白表达有标签，例如，纯化标签。在实施方式中，本发明的方法用于以约0. 2g/L至至少约5g/L的产率生产CTB或CTX。百日咳毒素百日咳毒素是由导致百日咳病的人呼吸道细菌性病原体百日咳博德特菌产生的外毒素和毒力因子。百日咳全毒素是具有AB 5结构的多亚基复合物。酶活性的A亚基(SI)是修饰哺乳动物细胞内的几种异源三聚体G蛋白(主要是Gi蛋白)的a亚基的ADP-核糖基转移酶，和B低聚物(S2、S3、两个拷贝的S4和S5)结合细胞上的糖结合物受体。SI在进入细胞后被蛋白水解加工。通过引用并入本文的Carbonetti等人,2005, “ProteolyticCleavage of Pertussis Toxin SI Subunit is Not Essential for Its Activity inMammalian Cells, ^BMC Microbiology 5 :7报告，SI的加工对它在哺乳动物细胞中的细胞毒性活性并非必不可少的。已研究百日咳毒素的无毒性变异体以供在疫苗中使用。利用本发明的方法生产的百日咳毒素蛋白预期用于疫苗中以对抗百日咳。百日咳毒素也作为疫苗佐剂进行了测试，例如，如 Roberts 等人，1995, “A Mutant Pertussis Toxin Molecule That LacksADP-Ribosyltransferase Activity, PT-9K/129G, Is an Effective Mucosal Adjuvantfor Intranasally Delivered Proteins，，Infection and Immunity 63(6) :2100-2108 所述，其通过引用并入本文。此外，百日咳毒素也可用于研究目的，例如用于G蛋白信号传 导途径的研究(例如，McCoy 等人，2010, “PARI and PAR2 couple to overlapping anddistinct sets of G proteins and 丄inked signaling pathways to differentiallyregulate cell physiology, ^Molecular Pharmacology Fast Forward MOL 62018,通过引用并入本文)，以及用作佐剂来强化对诸如实验性自身免疫性脑脊髄炎(EAE)、实验性自身免疫性睾丸炎、实验性自身免疫性葡萄膜炎等自身免疫性疾病的诱导。(Su等人，2001，“Pertussis Toxin Inhibits Induction of Tissue-Specific Autoimmine Disease byDisrupting G Protein-Coupled Signals,，，J Immunol 167 :250-256,通过引用并入本文)。如图3所示，该毒素的五个亚基由百日咳类毒素操纵子表达。包括某些变异体在内的百日咳毒素蛋白的表达和结构在以上引用的报告中以及由Burnette等人，1992，“Properties of Pertussis Toxin B Oligomer Assemoled In Vitro from RecombinantPolypeptides Produced by Escherichia coli,，，Infection and Immunity 60(6)2252-2256 ;美国专利号 5，085，862, “Genetic detoxification of pertussis toxin ； ”和Kaslow等人，1987,“Structure_Activity Analysis of the Activation of PertussisToxin, ”Biochemistry 26(1) :123-7描述；它们全部通过引用整体并入本文。如本文所用的百日咳毒素或PTX指百日咳毒素突变体SI R9K E129A或野生型蛋白质。野生型百日咳毒素和百日咳毒素突变体SI R9K E129A在例如以下文献中描述Roberts等人，1995(以上引用);美国专利号7，427，404和美国专利号7，666，436，名称均为“Pertussis Toxin Mutants, Bordetella Strains Capable of Producing SuchMutants and Their Use in the Development of Antipertussis Vaccines ；，，美国专利号5，935，580,“Recombinant Mutants for Inducing Specific Immune Responses ;，，美国专利号 7，169，399, “Non-Toxic Double Mutant Forms of Pertussis Toxin as Adjuvants;，，美国专利号5，785，971和美国专利号5，427，788，名称均为“Pertussis Toxin and Use inVaccines ；，，和美国专利号 5，773，600, “DNA Encoding Pertussis Toxin Muteins”,它们全部通过引用整体并入本文。在本发明的实施方式中，利用本文实施例1、5和7中所述的任何宿主菌株生产百日咳毒素突变体SI E129A或野生型百日咳毒素。在实施方式中，所用的表达载体包含表达与重组PTX蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前导序列的构建体。在实施方式中，使用天然分泌前导序列。在实施方式中，如本文别处所述，为了在选定的假单胞菌宿主中表达而优化任何或所有亚基编码序列。在某些实施方式中，亚基由两个或多个构建体表达，例如，通过根据本领域公知的方法亚克隆单个序列。在某些实施方式中，PTX蛋白表达有标签，例如纯化标签。在实施方式中，本发明的方法用于以约0. 2g/L至至少约5g/L的产率生产PTX或PTX的各单个亚基。破伤风毒素C片段由破伤风梭菌产生的破伤风毒素是具有150kDa的分子量的神经毒素。它由两部分组成100kDa重链或B-链和50kDa的轻链或A-链。这些链由ニ硫键连接。B链结合到位于神经元膜上的ニ唾液酸神经节苷脂(⑶2和⑶Ib)上。A链(一种锌内肽酶)攻击囊泡相关膜蛋白(VAMP)。A链的作用通过降解小突触泡蛋白来阻止受影响的神经元释放出抑制性神经递质GABA( Y-氨基丁酸)和甘氨酸。其后果是最小的刺激引起危险的肌肉过度活动ー感官刺激对运动反射的抑制失败。这导致主动肌和拮抗肌肌肉组织的全身性收缩，被称为强直性痉 挛。破伤风毒素C片段(Tet C或TTC)是通过破伤风毒素的蛋白酶裂解(例如，用木瓜蛋白酶)或通过该片段的重组表达而产生的50kD多肽。它对应于C-末端的451个氨基酸(氨基酸位置865-1315)。C片段的重组表达已在例如美国专利号5，443，966，“Expressionof Tetanus Toxin Fragment C, ” W0/2005/000346, “Carrier Proteins for Vaccines,”和 6，010，871, “Modification of Peptide and Protein” 中公开，它们全部通过引用整体并入本文。已证明C片段是无毒性的并且能够在小鼠和豚鼠中刺激保护性免疫应答。美国专利号5，443，966描述了破伤风毒素的序列以及C片段在大肠杆菌中的生产。重组TTC在酵母中的表达已在例如美国专利号 5，571，694,“Expression of Tetanus Toxin Fragment Cin Yeast”中描述，其通过引用整体并入本文。因为TTC以高特异性和亲和カ结合神经元，TTC可用作神经元药物递送的靶向分子或用于研究目的。此类用途在例如Townsend等人,2007, “Tetanus toxin C fragmentconjugated nanoparticles for targeted drug delivery to neurons, ^Biomaterials28(34) :5176-5184中描述，其通过引用并入本文。TTC蛋白也可潜在地用作疫苗载体蛋白，如例如W0/2005/000346中所述，并且已研究在疫苗中使用以避免破伤风梭菌感染。在本发明的实施方式中，利用本文实施例I中所述的任何宿主菌株结合实施例8中所述的任何表达载体生产TTC。在实施方式中，为了在假单胞菌宿主细胞中表达而优化核酸序列。在实施方式中，所用的表达载体具有表达与重组TTC蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前导序列的构建体。在某些实施方式中，TTC蛋白表达有标签，例如，纯化标签。在实施方式中，使用天然分泌前导序列。在实施方式中，本发明的方法用于以约0.5g/L至至少约12g/L的产率生产TTC。艰难梭菌毒素B艰难梭菌毒素B(TcdB)是由导致医院获得性腹泻和假膜性结肠炎的艰难梭菌产生的毒力因子。TcdB和第二大梭菌毒素TcdA參与了假膜性结肠炎的发生。TcdB是约270kD的糖基化毒素，可分成酶结构域、易位结构域和受体结合结构域。TcdB的前546个氨基酸含有酶区域，之后是推定的易位和受体结合结构域。已报道酶活性需要氨基末端的546个残基，因为该片段的氨基或羧基末端缺失降低了活性。在该酶区域内，已证明色氨酸102对UDP-葡萄糖结合至关重要。LCT内的保守的DXD基序对LCT葡萄糖基转移酶活性至关重要。涉及TcdB和TcsL酶结构域的嵌合体分析的研究提示残基364至516赋予了底物特异性。TcdB的结构及其表达以及作为针对艰难梭菌感染的保护性疫苗的潜在用途在例如以下文献中讨论美国专利号7，226，597, “Mutants of Clostridium DifficileToxin B and Methods of Use ； ” Jank 等人，2008, “Structure and mode of action ofclostridial glucosylating toxins the ABCD model,’’Trends in Microbiology 16(5)222-229 ;Sullivan等人，1982,“Purification and Characterization of Toxins A and Bof Clostridium difficile,^Infection and Immunity 35(3) : 1032-1040 ;和 Yang 等人，2008,“Expression of recombinant Clostridium difficile toxin A and B in Bacillusmegaterium, ” BMC Microbiology 8 :192,它们全部通过引用整体并入本文。 在本发明的实施方式中，利用本文实施例1、5和7中所述的任何宿主菌株来生产TcdB。在实施方式中，为了在假单胞菌宿主细胞中表达而优化核酸序列。在实施方式中，所用的表达载体包含表达与重组TcdB蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前导序列的构建体。在实施方式中，使用天然分泌前导序列。在某些实施方式中，TcdB蛋白表达有标签，例如，纯化标签。在实施方式中，本发明的方法用于以约0. 5g/L至至少约10g/L的产率生产TcdB。铜绿假单胞菌外毒素A铜绿假单胞菌的外毒素A (ETA或PE)是II型ADPRT。它是能够将催化结构域转位至哺乳动物细胞中并且通过细胞延伸因子2的ADP-核糖基化抑制蛋白质合成的分泌的细菌毒素家族的成员。该蛋白质作为单体存在，由613个氨基酸^6Kd)的单ー多肽链组成。以3. O-A分辨率确定的外毒素A的X射线晶体结构显示出主要由反平行的P结构组成并且包含该分子的大约一半的氨基末端结构域；由a螺旋组成的中间结构域；以及包含该分子的大约三分之一的羧基末端结构域。羧基末端结构域是毒素的ADP-核糖基转移酶。其他两个结构域推测參与细胞受体结合和膜转位。该毒素通过位于细胞表面上的特定受体结合到细胞上，然后毒素-受体复合物内化到细胞中。最后，ETA被转移到细胞溶质，在其中它酶促抑制蛋白质合成。由于弱碱比如NH4+(它提高酸性囊泡中的pH)防止细胞中毒，据认为转移过程从酸性区室发生。一旦暴露在酸性条件下，PE的疏水结构域进入膜内，从而导致通道的形成，酶结构域以伸展形式通过该通道进入细胞溶质中。PE的活性和毒性减弱的突变体在例如以下文献中描述美国专利号 4，892，827, “Recombinant Pseudomonas Exotoxins !Construction of an ActiveImmunotoxin with Low Side Effects，，和 Lukac 等人，1988, “Toxoid of Pseudomonasaeruginosa Exotoxin A Generated by Deletion of an Active-Site Residue’’Infectionand Immunity 56(12) :3095_3098，二者通过引用整体并入本文。外毒素A突变体rEPA作为疫苗偶联物的应用在例如以下文献中描述Fattom等人，1993, “Laboratory and Clinical Evaluation of しonjugate Vaccines Composedof Staphylococcus aureus Type 5 and Type 8 Capsular Polysaccharides Bound toPseudomonas aeruginosa Recombinant Exoprotein A，，Infection and Immunity 61(3)1023-1032 ;Qian 等人，2007, “Conjugating recombinant proteins to Pseudomonasaeruginosa ExoProtein A a strategy for enhancing immunogenicity of malariavaccine candidates” Vaccine 25(20) :3923-3933 ;以及 Lin 等人，2001. “The Efficacyof a Salmonella Typhi Vi Conjugate Vaccine in Two-To-Five-Year-Old Children”NEngl J Med 344(17) :1263_1269，均通过引用并入本文。本文中使用的铜绿假单胞菌外毒素A指铜绿假单胞菌外毒素A突变体CRM66、缺失rEPA或野生型蛋白质。在本发明的实施方式中，利用本文实施例1、5和7中所述的任何宿主菌株并且利用具有表达与重组外毒素A蛋白融合的表8和表3中所述的任何分泌前导序列的构建体的表达载体来生产外毒素A。在实施方式中，为了在假单胞菌宿主细胞中表达而优化核酸序列。在实施方式中，使用天然分泌前导序列。在某些实施方式中，ETA蛋白表达有标签，例如，纯化标签。在实施方式中，本发明的方法用于以约0. 5g/L至至少约12g/L的产率生产外毒素A。用本发明的方法生产的示例性毒素蛋白在表I中列出。可以理解，这个列表不是 限制性的。在本发明的实施方式中，为了在选择的假单胞菌宿主细胞中表达，可以优化在此用于利用本发明方法生产本文所述的毒素的任何核酸序列。如本文别处所述，任何给定序列的优化存在多种选择。所述的任何选项预期用于优化利用本发明方法生产的毒素的序列。本文提供的优化序列是在本发明方法中有用的优化序列的非限制性实例。表I 示例性毒素蛋白
I示例性序列___资源/参考__
CRM197白喉杆菌 NCTC 13129
白喉毒素(WT)GenBank NC 00293 5.2白喉杆菌
GenBank CAA00374.1
霍乱全毒素GenBank NC_002505.1;霍乱弧菌
NP231099.1 和 NP23110.1
霍乱毒素BGenBank ACH70471霍乱弧菌Ol生物变种
(El Tor 株)El tor百曰咳毒素 GenBank M13223.1,具有百曰咳博德特菌— 一 SI突变 —
破伤风喜素C片段 GenBank 1A8D A破伤风梭菌
艰难梭菌毒素B VPI GenBank CAA63562艰难梭菌
(TcdB)— _ ___ _ _
铜绿假单胞菌外毒 GenBank NP—249839铜绿假单胞菌PAOl
素 A_ — _ 一 密码子优化
在异源表达系统中，优化步骤可以提高宿主产生外源蛋白的能力。蛋白质表达是由一系列包括那些影响转录、mRNA加工及翻译的稳定性和起始的因素的许多因素控制的。多核苷酸优化步骤可以包括提高宿主产生外源蛋白能力的步骤，以及辅助研究人员有效地设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括,例如,翻译起始区的修饰、mRNA结构元件的改变和不同密码子偏倚性的使用。优化核酸序列以提高在细菌宿主中异源蛋白的表达的方法在本领域中是已知的，并在文献中描述。例如，用于假单胞菌宿主菌株中表达的密码子优化描述在美国专利申请公开号2007/0292918，“Codon Optimization Method”中，其全部内容通过引用并入本文。因此，优化可以处理异源基因的多种序列特征中的任意ー种。作为具体的实例，稀有密码子引起的翻译中止可导致异源蛋白表达的降低。稀有密码子引起的翻译中止包括在目标多核苷酸中存在很少在宿主生物体中使用的密码子可能对蛋白质的翻译有负面影响，因为它们在可用的tRNA池中的缺少。提高宿主生物体中最佳翻译的方法包括可导致稀有宿主密码子从合成的多核苷酸序列中去除的密码子优化。
替代的翻译起始也可以导致异源蛋白表达的降低。替代的翻译起始可包含偶然地包含能够作为核糖体结合位点(RBS)发挥功能的基序的合成多核苷酸序列。这些位点可引起从基因内部位点起始截短蛋白的翻译。降低产生截短蛋白(其可能难以在纯化过程中去除)的可能性的ー种方法包括从优化的多核苷酸序列中消除推定的内部RBS序列。重复引起的聚合酶滑脱可以导致异源蛋白表达的下降。重复引起的聚合酶滑脱涉及表明会引起可产生移码突变的DNA聚合酶的滑脱或ロ吃(stuttering)的核苷酸序列重复。这样的重复序列也能引起RNA聚合酶的滑脱。在具有高G+C含量偏倚性的生物体中，可以有更高程度的由G或C核苷酸重复构成的重复序列。因此，降低引起RNA聚合酶滑脱的可能性的ー种方法包括改变G或C核苷酸的延伸重复序列。干扰ニ级结构也可能导致异源蛋白表达的下降。ニ级结构可以隔离RBS序列或起始密码子，且与蛋白质表达的下降相关。茎-环结构也可以參与转录中止和减弱。优化的多核苷酸序列在核苷酸序列的RBS和基因编码区中可以含有最少的ニ级结构以允许转录和翻译的改善。另ー种可能影响异源蛋白表达的特征是限制性位点的存在。可以通过除去可能干扰随后转录单位亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点优化多核苷酸序列。例如，可以通过识别由宿主异源表达所需的氨基酸序列开始优化过程。可以从该氨基酸序列设计候选多核苷酸或DNA序列。在设计合成DNA序列时，密码子选择的频率可以与宿主表达有机体的密码子选择进行比较和稀有宿主密码子可以从合成序列中除去。此夕卜，合成的候选DNA序列可以被修饰以除去不想要的限制性酶切位点，以及添加或移除任何所需的信号序列、接头或非翻译区。可以分析合成DNA序列中可能会干扰的翻译过程的ニ级结构的存在，如G/C重复序列和茎-环结构。在候选DNA序列合成之前，可以检验优化的序列设计以确认该序列正确编码所需的氨基酸序列。最后，可以使用DNA合成技术合成候选DNA序列，如本领域中已知的那些合成技术。在本发明的另ー个实施方式中，可以使用宿主生物体如荧光假单胞菌中的通用密码子选择来优化异源多核苷酸序列的表达。可以评估在宿主表达系统中被视为对于特定氨基酸优选的稀有密码子的百分比和分布。5%和10%的选择率值可作为确定稀有密码子的临界值。例如，表I中列出的密码子在荧光假单胞菌MB214基因组中的计算出现率小于5%，因而通常避免用于在荧光假单胞菌宿主中表达的优化基因中。表2.在荧光假单胞菌MB214中出现率低于5%的密码子
权利要求
1.一种在假单胞菌宿主细胞中生产重组毒素蛋白的方法，所述方法包括 将编码毒素蛋白的核苷酸序列连接到表达载体中； 用该表达载体转化假单胞菌宿主细胞；以及 在适合重组毒素蛋白表达的培养基中培养已转化的假单胞菌宿主细胞； 其中所述重组毒素蛋白选自CRM197、白喉毒素、霍乱全毒素、霍乱毒素B、百日咳毒素、破伤风毒素C片段、艰难梭菌毒素B和铜绿假单胞菌外毒素A，或者 其中所述重组毒素蛋白选自霍乱毒素B、霍乱全毒素、百日咳毒素、破伤风毒素C片段、艰难梭菌毒素B和铜绿假单胞菌外毒素A，或者 其中所述重组毒素蛋白选自霍乱毒素B、霍乱全毒素、百日咳毒素、破伤风毒素C片段和艰难梭菌毒素B。
2.权利要求I的方法，其中所述重组蛋白以0.2克/升至约12克/升的可溶性和/或活性毒素蛋白的产率生产。
3.权利要求2的方法，其中可溶性和/或活性毒素蛋白的产率为约0.2克/升至约12克 / 升，为约 0. 2g/L、约 0. 3g/L、约 0. 4g/L、约 0. 5g/L、约 0. 6g/L、约 0. 7g/L、约 0. 8g/L、约 0. 9g/L、约 lg/L、约 I. 5g/L、约 2g/L、约 2. 5g/L、约 3g/L、约 3. 5g/L、约 4g/L、约 4. 5g/L、约 5g/L、约 5. 5g/L、约 6g/L、约 6. 5g/L、约 7g/L、约 7. 5g/L、约 8g/L、约 8. 5g/L、约 9g/L、约9.5g/L、约 10g/L、约 10. 5g/L、约 I lg/L、约 12g/L、约 0. 2g/L 至约 0. 5g/L、约 0. 2g/L 至约lg/L、约 0. 2 至约 2g/L、约 0. 3g/L 至约 0. 6g/L、约 0. 3g/L 至约 lg/L、约 0. 3 至约 2g/L、约0. 4至约0. 7g/L、约0. 4至约lg/L约0. 4至约2g/L、约0. 4至约3g/L、约0. 5g/L至约Ig/L、约 0. 5g/L 至约 2g/L、约 0. 5g/L 至约 3g/L、约 0. 5g/L 至约 4g/L、约 0. 5g/L 至约 5g/L、约0.5g/L 至约 6g/L、约 0. 5g/L 至约 7g/L、约 0. 5g/L 至约 8g/L、约 0. 5g/L 至约 9g/L、约 0. 5g/L 至约 10g/L、约 0. 5g/L 至约 I lg/L、约 0. 5g/L 至约 12g/L、约 lg/L 至约 2g/L、约 lg/L 至约3g/L、约 lg/L 至约 4g/L、约 lg/L 至约 5g/L、约 lg/L 至约 6g/L、约 lg/L 至约 7g/L、约 lg/L至约 8g/L、约 lg/L 至约 9g/L、约 lg/L 至约 10g/L、约 lg/L 至约 I lg/L、约 lg/L 至约 12g/L、约2g/L至约3g/L、约2g/L至约4g/L、约2g/L至约5g/L、约2g/L至约6g/L、约2g/L至约7g/L、约 2g/L 至约 8g/L、约 2g/L 至约 9g/L、约 2g/L 至约 10g/L、约 2g/L 至约 llg/L、约 2g/L 至约 12g/L、约 3g/L 至约 4g/L、约 3g/L 至约 5g/L、约 3g/L 至约 6g/L、约 3g/L 至约 7g/L、约3g/L至约8g/L、约3g/L至约9g/L、约3g/L至约10g/L、约3g/L至约I lg/L、约3g/L至约12g/L、约4g/L至约5g/L、约4g/L至约6g/L、约4g/L至约7g/L、约4g/L至约8g/L、约4g/L 至约 9g/L、约 4g/L 至约 10g/L、约 4g/L 至约 llg/L、约 4g/L 至约 12g/L、约 5g/L 至约6g/L、约 5g/L 至约 7g/L、约 5g/L 至约 8g/L、约 5g/L 至约 9g/L、约 5g/L 至约 10g/L、约 5g/L至约I lg/L、约5g/L至约12g/L、约6g/L至约7g/L、约6g/L至约8g/L、约6g/L至约9g/L、约 6g/L 至约 10g/L、约 6g/L 至约 llg/L、约 6g/L 至约 12g/L、约 7g/L 至约 8g/L、约 7g/L至约9g/L、约7g/L至约10g/L、约7g/L至约I lg/L、约7g/L至约12g/L、约8g/L至约9g/L、约 8g/L 至约 10g/L、约 8g/L 至约 I lg/L、约 8g/L 至约 12g/L、约 9g/L 至约 10g/L、约 9g/L 至约 llg/L、约 9g/L 至约 12g/L、约 10g/L 至约 llg/L、约 10g/L 至约 12g/L 或约 llg/L 至约 12g/L。
4.权利要求1-3中任ー项的方法，其中所述编码毒素蛋白的核苷酸序列与分泌信号编码序列融合，当所述分泌信号编码序列表达时，指引所述毒素蛋白向周质转移。
5.权利要求1-4中任ー项的方法，其中所述宿主细胞在至少ー种蛋白酶的表达上有缺陷，或者其中所述宿主细胞过表达至少ー种折叠调节因子，或者两者的组合。
6.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为CRM197，并且所述宿主细胞在 HslU、HslV、Prcl、DegPl、DegP2 和 AprA 的表达上有缺陷。
7.权利要求1-6中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列融合，所述分泌前导序列为 Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V 或 Pbp。
8.权利要求1-6中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为CRM197，而且所述宿主细胞在沙雷氏菌溶素、HslU、HslV,Prcl、DegPl、DegP2、AprA或它们的任何组合的表达上有缺陷，或者其中所述宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，并且进一步地其中所述重组毒素蛋白与Azu、Pbp或天然分泌前导序列融合。
9.权利要求1-8中任ー项的方法，其中所述宿主细胞过表达DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，并且其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列Azu融合。
10.权利要求1-8中任ー项的方法,其中所述宿主细胞在沙雷氏菌溶素的表达上有缺陷，并且其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列Pbp或Azu融合。
11.权利要求1-8中任ー项的方法，其中所述宿主细胞在HslU和HslV的表达上有缺陷，并且其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列Pbp或Azu融合。
12.权利要求1-4中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为CRM197，所述宿主细胞为野生型，并且其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列Pbp或Azu融合。
13.权利要求1-8中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为CRM197，并且其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列Azu、Pbp、IbpS31A、CupA2或PbpA20V融合。
14.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为霍乱毒素B，并且所述宿主细胞在Lon、La和AprA的表达上有缺陷，或者；在HslU、HslV, PrcU DegPU DegP2和AprA的表达上有缺陷，并且过表达DegP2S219A。
15.权利要求1-5中任ー项或14的方法，其中所述宿主细胞在Lon、La和AprA的表达上有缺陷，并且其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列Pbp A20V融合,或者；在HslU、HslV, PrcU DegPU DegP2和AprA的表达上有缺陷，过表达DegP2 S219A，并且其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列DsbA融合。
16.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为百日咳毒素SIE129AR9K，并且所述宿主细胞在Lon、La和AprA的表达上有缺陷；过表达GrpE、DnaK和DnaJ ；在HtpX的表达上有缺陷；在RXF01590的表达上有缺陷；或者在ppiB (RXF05345)的表达上有缺陷。
17.权利要求1-5中任ー项或16的方法，其中所述重组毒素蛋白与它的天然分泌前导序列融合。
18.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为破伤风毒素C，并且所述宿主细胞在Lon、La和AprA的表达上有缺陷，或者所述宿主细胞在HslU、HslV、Prcl、DegPl、DegP2和AprA的表达上有缺陷，或者所述宿主细胞过表达dsbAB⑶，或者所述宿主细胞过表达 GrpE、DnaK 和 DnaJ。
19.权利要求1-5中任ー项或18的方法，其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列TolB, DsbA, DsbC, Pbp A20V、NikA 或 CupA2 融合。
20.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为破伤风毒素C，并且所述宿主细胞在Lon、La和AprA的表达上有缺陷。
21.权利要求1-5中任ー项、18或20的方法，其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列DsbA融合。
22.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为破伤风毒素C，并且所述宿主细胞在GrpE、DnaK和DnaJ的表达上有缺陷。
23.权利要求1-5中任ー项、18、20或22的方法，其中所述重组毒素蛋白与分泌前导序列NikA融合。
24.权利要求1-5中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为艰难梭菌毒素B，并且所述宿主细胞在HtpX的表达上有缺陷；在DegPl的表达上有缺陷；在HslU、HslV, Prcl和Prc2的表达上有缺陷；在Lon、Ia和DegP2的表达上有缺陷，或者；所述宿主细胞在Lon、Prcl、DegP2、AprA的表达上有缺陷并且过表达DegP2 S219A。
25.上述权利要求中任ー项的方法，进ー步包括在活性測定中測定所述重组毒素蛋白的活性，其中所生产的可溶性毒素蛋白中约40%至约100%经确定具有活性。
26.权利要求25的方法，其中所述活性测定为免疫学測定、受体结合測定或酶測定。
27.上述权利要求中任ー项的方法，其中所述表达载体包含可操作地连接到蛋白质编码序列上的Iac衍生启动子，而且其中所述培养包括用浓度为约0. 02至约I. OmM的IPTG诱导该启动子，诱导时的细胞密度为约40-约200吸光度単位(AU)的光密度，培养物的pH为约6至约7. 5，而且生长温度为约20°C至35°C。
28.上述权利要求中任ー项的方法，其中所述宿主细胞是假单胞菌细胞。
29.上述权利要求中任ー项的方法，其中所述宿主细胞是荧光假单胞菌。
30.上述权利要求中任ー项的方法，其中所述核苷酸序列已为了在假单胞菌宿主细胞中表达而进行了优化。
31.权利要求28的方法，其中所述核苷酸序列已为了在假单胞菌属宿主细胞中表达而进行了优化。
32.权利要求29的方法，其中所述核苷酸序列已为了在荧光假单胞菌宿主细胞中表达而进行了优化。
33.权利要求1-4或25-32中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为百日咳毒素，并且其中所述百日咳毒素为野生型或SI E129A R9K。
34.权利要求1-4或25-32中任ー项的方法，其中所述重组毒素蛋白为铜绿假单胞菌外毒素A，而且其中所述铜绿假单胞菌外毒素A为野生型、CRM66或rEPA。
35.权利要求4-34中任ー项的方法，其中所述表达载体进一歩包含邻近所述分泌信号的编码序列的标签序列。
36.上述权利要求中任ー项的方法，其中所述表达载体进一歩包含邻近所述毒素蛋白的编码序列的标签序列。
全文摘要
本发明涉及在细菌宿主中生产重组毒素蛋白的领域。本发明尤其涉及从细菌宿主中获得高水平重组CRM 197、白喉毒素、百日咳毒素、破伤风类毒素C片段、霍乱毒素B、霍乱全毒素和假单胞菌外毒素A的生产方法。
文档编号C07K19/00GK102869778SQ201180018149
公开日2013年1月9日 申请日期2011年3月28日 优先权日2010年3月30日
发明者D·M·雷奥尔阿克, L·丘, H·金, H·W·塔尔伯特 申请人:菲尼克斯公司