纯化生长因子蛋白的方法

专利名称：纯化生长因子蛋白的方法
纯化生长因子蛋白的方法本发明涉及使用色谱纯化生长因子蛋白的方法。从天然来源的原料中纯化蛋白是一种挑战，因为感兴趣的蛋白通常仅以痕量存在并伴随以其它生物聚合物例如脂质、蛋白或者甚至细胞片段。另外感兴趣的蛋白往往与生物学功能相关联，所述生物学功能经常在其纯化方法步骤中丧失。纯化生物聚合物例如蛋白质的方法的库是很大的。除了沉淀方法，基于多种材料的色谱方法也是已知的。所述材料常常用化学部分修饰，例如有机离子、阳离子例如质子化氨或部分或完全烷基化的氨。这样的材料用作阴离子交换剂。但是阳离子交换剂也可用于基于感兴趣的蛋白的物理特性的纯化方法，所述物理特性例如性状、分子量和尤其是其电荷。可选地或联合地使用亲和色谱法。本领域已知传统离子交换色谱树脂(例如SP-，CM-, Q-或DEAE琼脂糖FF离子交 换色谱树脂)的一个缺点是蛋白质与树脂的连接仅能在相对低盐浓度(电导率，渗透压浓度等)内，典型地在O. 01-0. 15M的盐(NaCl等)浓度范围内发生。在某些应用中存在能够利用相对温和的纯化条件的需求，其中离子交换色谱步骤施加于所述蛋白，并在有所增加的离子强度下直接(没有进一步稀释)施加至色谱树脂。增加的离子强度对蛋白溶液中的蛋白稳定性有显著优势；尤其在粗品蛋白制备中，像在收获重组制备的蛋白产物或在血浆源性产物中，其中潜在的蛋白酶存在于溶液中，其可以负向影响目标蛋白。由于蛋白酶经常在生理条件下最好地工作(像在大多细胞系统中的情况)，即大约PH 7和盐浓度为大约O. 15M。可以通过改变工作条件例如通过加入盐和/或改变pH来抑制蛋白酶，然而，这些参数都对传统的离子色谱步骤的性能是很重要的，并且从而经常不可能组合使用。需要提供这样的纯化方法，在所述方法的过程中可以使用使蛋白酶的影响最小化的条件。W0-A2-2008/073620公开了一种多肽生产方法，所述多肽在昆虫细胞中用杆状病毒表达系统生产。在一个实例中，所述昆虫细胞培养物在补充了脂质混合物之后立即感染(例如，一小时之后感染)。从所述昆虫细胞培养物中用这样的方法分离多肽在纯化过程的早期利用阴离子交换或混合式色谱。该方法步骤用于移除源自昆虫细胞的多糖内切酶和蛋白酶并从而减少期望多肽由于酶降解而带来的损失。在另一个实例中，将混合式色谱与染料配体亲和色谱以连续流方式组合以允许昆虫细胞培养物液体的快速处理和捕获多肽。在又一个实例中，用这样的方法从昆虫细胞培养物液体中分离多肽在制备基本上不含多糖内切酶和蛋白水解活性的多肽溶液的单一操作单元中将中空纤维过滤、混合式色谱和染料配体亲和组合。再进一步的实例中，所述分离的多肽是具有昆虫特定糖基化方式的糖肽，其任选地用糖基转移酶和修饰的核苷酸糖连接至修饰基团，例如聚合物(例如，PEG)。W0-A2-2009/063069公开了一种纯化肽的方法，特别地但不排他地，涉及从肽溶液中移除外毒素的方法，包含用于所述方法的反应物的试剂盒和通过所述方法获得的纯化的肽。Dasari Venkata Krishna Rao等人公开了一种纯化方法，其使用一种为促进rhG-CSF (重组人粒细胞克隆-刺激因子)的产量而发展的过程控制策略。在该研究中达到了 > 99%的纯度和2. 18g/l的总产量。纯化期间产物的分析表明去污剂移除了 72%的LPS(脂多糖)和98%的HCP (宿主细胞蛋白)而不移除核酸。半胱氨酸浓度是蛋白再折叠的关键参数。评估了 SEC (尺寸排阻色谱)柱中的基底高度和HETP (高度等效理论板)值并研究了其对拆分的效果。发现SEC期间的公式化对增加产物产量和节约时间和过程成本是至关重要的。Quan Bai等用强阴离子交换色谱(SAX)研究了在大肠杆菌中表达的重组人粒细胞巨噬细胞克隆刺激因子(rhGM-CSF)的纯化和复性。用SAX分别研究了流动相中pH值、GSH/GSSG的浓度比和尿素浓度对rhGM-CSF的纯化和复性的影响。结果显示上述三个因子对rhGM-CSF的复性效率和质量回收具有显著影响。流动相中加入GSH/GSSG能提高rhGM-CSF中正确的二硫键的形成从而增加其复性产量。另外，为了用SAX增加rhGM-CSF的质量回收，将低浓度的尿素加入流动相中以防止变性蛋白聚集。在优化条件下，仅通过一个步骤在30分钟内使rhGM-CSF复性同时在SAX柱上纯化。
ShellyA. Pizarro报告了一种血管内皮生长因子(VEGF165),这是一种在体内诱导血管生成和血管渗透性有效的促细胞分裂原，并证明了对加速创伤愈合的治疗应用的潜力。该报告中描述的方法涉及能够生产大约9g的rh VEGF每升的培养基的细菌表达系统和蛋白质折叠和三个色谱步骤的下游纯化方法，之后为药物物质的制剂化。使用了高细胞密度(HCD)补料分批发酵方法以在原生质包含体中生产rhVEGF。从细胞溶解物中收获包含体并使之经历单一步骤的蛋白溶解和重折叠操作以提取rhVEGF用于纯化。在发展包括重折叠和色谱期间的全部回收收率为30±6%。在实验室和大尺度示范性方法中宿主细胞混杂物均被常规地清除至低于目标水平。重折叠和纯化的rhVEGF的结构通过质谱来确认。N-端测序、胰蛋白酶肽作图以及产物变体通过多重HPLC化验来分析。Kimberly A. Kaleas公开了混合式色谱树脂作为用于挑战给料的纯化工具越来越流行，并公开了用Capto MMC从碱性给料中选择性捕获重组人血管内皮生长因子(rhVEGF)工业化应用的发展。Capto MMC树脂包含这样的配体，其具有参与与蛋白的离子、疏水和氢键作用的潜力并与高交联琼脂糖珠基体偶联。VEGF是涉及血管生成的关键生长因子并具有对创伤愈合的治疗性应用。它在大肠杆菌中以包含体表达。从细胞溶解物中收获固体，溶解rhVEGF并在pH 9. 8下在尿素和氧化还原试剂存在下溶解和重折叠。Capto MMC的独特的混合模式特性使得能够以最小的负载条件捕获该碱性蛋白，并以>95%收率向下游过程传递浓缩池同时使宿主细胞蛋白含量降低至< 1.2%。该研究探索了负载条件和保留时间对动态结合容量的影响以及最佳纯化性能的洗脱条件的开发。在评价各种洗脱缓冲液之后，L-精氨酸HCl显示出可作为rhVEGF从Capto MMC解吸附的有效洗脱试剂，因为它成功中断了树脂和rhVEGF之间的多重相互作用。实验室尺度的成果产生了成功地以商业化制造尺度实施的坚固的色谱步骤。本发明的一个目的是通过提供新的方法来避免现有技术中生长因子蛋白的纯化方法的缺点。根据本发明，该目的通过以使用色谱的纯化顺序纯化选自以下的生长因子的方法来实现克隆刺激因子(CSF)例如G-CAF (粒细胞克隆刺激因子)或粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)、白介素3 (IL-3)、肝细胞生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子(酸性)，其中-至少一个色谱用多元树脂(multimodalresin)来进行-将所述生长因子蛋白在pH4-6. 2下结合至多元树脂，和
-将所述生长因子蛋白在pH> 6. 3下从多元树脂上洗脱。本发明提供了这样的方法，其中蛋白酶的影响可以被便利地最小化。使得可以在潜在存在能够降解目标蛋白的蛋白酶的情况下在粗蛋白样品中添加盐和/或改变PH，并可以在没有任何进一步的测量的情况下处理蛋白溶液并将目标蛋白结合至混合式色谱树脂并从而提供在粗样品中浓缩和纯化目标蛋白的优化步骤，使得适合于用针对目标蛋白的特定亲和色谱步骤进行进一步的下游纯化，其在下游处理期间具有减少的蛋白酶和/或DNA含量。这对纯化期间避免目标蛋白的降解具有特别的重要性，使得多元色谱的组合作为粗蛋白溶液中的捕获步骤。
在一个实施方式里，多元树脂色谱与酵母源性亲和配体色谱步骤组合。使用酵母源性亲和配体的色谱步骤特别适合于高收率和不改变分子完整性(降解等)的目标蛋白纯化。所述生长因子蛋白是克隆刺激因子(CSF)例如G-CSF (粒细胞克隆刺激因子)。这是造血调节糖蛋白中的一员，造血调节糖蛋白涉及来自干细胞的造血细胞的生长和分化。生长因子蛋白是粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)、白介素3 (IL-3)、肝细胞生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子(酸性)。生长因子蛋白全部显示IP <6。在本发明进一步的实施方式里，所述多元树脂包含结合基质的部分并且该部分能通过离子相互作用和其它类型的相互作用例如氢键、疏水和亲硫相互作用而与基质中的生长因子蛋白结合。在本发明进一步的实施方式里，所述亲和配体是酵母源性的针对生长因子蛋白的Fab片段。在本发明进一步的实施方式里，执行所述多元树脂步骤以从粗蛋白溶液中捕获生长因子蛋白随后将获得的多元色谱树脂洗脱液进行酵母源性的亲和配体色谱步骤，并且在将来自所述亲和色谱步骤的生长因子蛋白的洗脱之后，实现与蛋白和DNA有关的大于大约90%的纯度。在本发明的另外一个实施方式里，所述多元树脂步骤和酵母源性亲和配体色谱步骤与其它色谱纯化步骤组合以实现最终生长因子蛋白产物纯度大于99%。在本发明的另外一个实施方式里，包含生长因子蛋白的混合物是溶液。在本发明的又另一个实施方式里，生长因子蛋白是重组生长因子蛋白。在本发明的又另一个实施方式里，生长因子蛋白是在潜在地包含能降解产物的蛋白酶的粗蛋白溶液中。在另一个实施方式里通过pH改变> pH 6. 3将生长因子蛋白洗脱。在本发明进一步的实施方式里用包含具有碱性侧链和/或高离子强度的氨基酸的洗脱试剂来进行洗脱。可选地或组合地，可以通过pH改变来进行所述洗脱。通过用例如氢氧化钠或乙酸来调节洗脱缓冲液的PH至期望的pH并且然后将缓冲液应用于多元树脂来执行PH改变，并且可以通过在应用于多元树脂之前向洗脱缓冲液组合物加入盐来执行离子强度调节，例如包括在Hofmeister系列中的盐,例如氯化钠和氯化钾。根据本发明，洗脱试剂的浓度特别在从大约O. IM到大约2M的范围。根据本发明的另一个实施方式，生长因子蛋白在约pH 6. O下结合至多元树脂，而生长因子蛋白在约PH 6. 5或更高特别是在约pH 7. O下从多元树脂上洗脱。在本发明的进一步的实施方式里，使用这样的缓冲物质，其优选包含选自以下的物质中的至少一种柠檬酸钠、组氨酸、2-(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、Tris碱和乙酸钠，特别在约pH 4至约pH 8的范围内。在本发明的方法里在使用的任何缓冲液里可以存在一种非离子去污剂，该非离子去污剂特别选自聚山梨醇酯(聚山梨醇酯20，40，60，80)和Pluronic F68。在本发明的方法的进一步的实施方式里，所述氨基酸可以选自具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；有机盐可以选自KCl和NaCl。在本发明的另一个实施方式里，在从多元树脂洗脱生长因子蛋白之前，在pH约PH4至约pH 6的范围内执行洗涤步骤，其特征在于洗涤缓冲液包括洗涤试剂，所述洗涤试剂包含具有碱性侧链和/或高离子强度的氨基酸，可以通过在应用于多元树脂之前向洗涤缓冲液组合物加入盐来执行离子强度的调节，例如包括在Hofmeister系列中的盐，例如氯化钠和氯化钾。
根据本发明，洗涤试剂的浓度特别在约O. IM至约2M的范围。在生长因子蛋白被释放之前向多元树脂施加洗涤缓冲液以洗去污染物(蛋白酶，DNA等)并保留生长因子蛋白是有利的。特别地，在pH 6-8时带正电荷的氨基酸的浓度在洗涤缓冲液中在pH < 6. 3下以最多2M的量存在。典型地，在洗涤缓冲液中精氨酸的量在O. 1-1. OM的范围，特别是O. 5M。在pH彡6. 3的洗脱缓冲液中精氨酸的量典型地在O. I至2M的范围，特别是O. 5M。在pH彡6. 3的洗脱缓冲液中，包含在O. 1-2. OM范围的氯化钠，特别是在O. I至IM的范围。在pH < 6. 3的洗涤缓冲液中，包含在O. 1-2. OM范围的氯化钠，特别是在O. I至IM的范围。非离子去污剂的量典型地在O. 001至1%的范围，特别在多元色谱的缓冲液中为O. 02%。根据本发明可以使用的多元色谱树脂可以包含以下部分中的至少一种a.带正电荷的N-苯甲基-N-甲基乙醇胺配体，b.带负电荷的2-(苯甲酰胺)丁酸配体，c.苯丙基配体，d. N-己基配体，e. 4-巯基-乙基-批P定配体，f. 3- ((3-甲基-5-((四氢呋喃-2-基甲基)-氨基)-苯基)-氨基)-苯甲酸配体或其组合。特别地，根据本发明使用的多元色谱选自下列商业上可获得的树脂HEPHyperceI ；PPA Hypercel ；Capto Adhere ；Capto MMC ；MEP Hypercel 。在本发明的另一个实施方式里，纯化顺序可以进一步包含病原体移除/失活步骤，其包含基于化学的失活步骤，基于尺寸的移除步骤，色谱步骤或其组合，所述步骤基于针对待移除的病原体的不同的物理性质。在本发明的方法的一个具体的实施方式里，纯化顺序进一步包含如下步骤I.阳离子多元树脂例如Capto MMC ；2.基于化学的失活步骤以封装病毒，尤其是使用EP-A-131740中公开的三正丁基磷酸酯和Triton X-IOO的溶剂/去污剂失活；3.基于酵母中表达的配体的亲和树脂；4.阳离子交换剂例如 SP Sepharose 或 Resource S ；5.病原体过滤移除步骤,使用平均孔尺寸约20nm例如Planova 20N ；6.缓冲液交换和/或浓缩步骤，例如用大约截断l_5kDa的超滤；7.尺寸排阻色谱树脂例如Superdex 75。附图简述图I显示了在pH 4. O下以Capto MMC柱用乙酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。 图2显示了在pH 4. O下以Capto MMC柱用乙酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。图3显示了在pH 4. O下以Capto MMC柱用乙酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。图4显示了在起始材料pH 4. O下以Capto MMC柱用乙酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。图5显示了在pH 4. O下以Capto MMC柱用柠檬酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。图6显示了在pH 5. O下以Capto MMC柱用柠檬酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。图7显示了在pH 5. 5下以Capto MMC柱用柠檬酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。图8显示了在pH 6. O下以Capto MMC柱用柠檬酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。图9显示了在pH 6. 5下以Capto MMC柱用柠檬酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。图IOa和IOb显示了在起始和来自Capto MMC洗脱液中的蛋白分离和银染色的SDS-PAGE。

图11显示了来自无细胞上清液的G-CSF的色谱图。图12显示了考马斯蓝染色的SDS-PAGE，其显示了亲和色谱步骤后的洗脱液。图13显示了银染色的SDS-PAGE，其显示起始材料、流过液和亲和色谱步骤之后的洗脱液。本发明进一步通过下述非限制性实施例来描述，其通过G-CSF纯化来示例。实施例分析方法的描述通过G-CSF特异性ELISA确定G-CSF含量酶联免疫吸附分析(ELISA)的原理是蛋白质(抗原)通过其特异性结合至针对该蛋白的抗体来定量。G-CSF的定量通过使用基于G-CSF Duo Set ELISA (R&D Systems, CatNo DY214)的多层ELISA来执行。作为标定标准使用了大肠杆菌源性的重组人G-CSF (R&Dsystems, Cat No. 214-CS-005，O. 015 - lng/ml)。捕获抗体(鼠抗-人 G-CSF)结合至 96 孔微滴定板的孔。在捕获G-CSF抗原和洗涤步骤之后，将生物素化的探测抗体(山羊抗-人G-CSF)结合至G-CSF抗原。在第二洗涤步骤之后，施加连接至辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白(Streptavidin-HRP)，其结合至生物素化的探测抗体。为了定量，在过氧化氢存在下加入过氧化物酶底物四甲联苯胺(TMB)并显示出蓝色。在用磺酸停止反应滞后，形成稳定的黄色染料。黄色染料的浓度与结合的过氧化物的量成正比，从而与G-CSF抗原的量成比例。染料浓度以450nm处的光度来测量。未知样品中的G-CSF浓度根据重组人G-CSF标准曲线来计算，所述标准曲线通常给出线性相关系数(r) > O. 99。
通过反相(RP) HPLC确定G-CSF含量RP-HPLC包括基于蛋白质极性的蛋白质分离；通过溶质分子的非极性部分与HPLC柱的非极性固定相之间的疏水作用控制蛋白质分子的保留。装配UV检测器和JupiterC18, 300A, 5 μ m, 4. 6x 150mm 柱(Phenomenex, Cat. no. 00F-4053-E0)的 HPLC 系统(DionexUltimate 3000)用于蛋白质测定。所述柱在20±5°C下跑柱，用O. 1%(ν/ν)三氟乙酸(TFA)的水溶液(流动相A)平衡。对于洗脱，以线性梯度(O - 5分钟5%B，5 - 12分钟55%B，12-17分钟100%B，17-22分钟5%B)使用O. 1% (v/v)TFA的乙腈溶液(流动相B)，流动速率为I. Oml/分钟。上样量为30 μ g每注射，以总注射体积最大100 μ L0通过测量214nm的UV吸光率来进行检测。来自 Ph. Eur 的 FilgrastimCRS 2. 5-40 μ g (2. 5-5-10-20-40 μ g)用于标准曲线。Filgrastim CRS标样在水中预先稀释至O. 4mg/ml以作为实验室用途(WFL)。根据需要，将所述样品在WFL中预先稀释至30 μ g的注射量。未知样品中的G-CSF含量根据FilgrastimCRS标准曲线来计算，其通常给出线性相关系数(r) > O. 99。
反相(RP) HPLC确定纯度用于RP-HPLC确定纯度的方法和设备与确定G-CSF含量的方法等同。含G-CSF溶液的纯度[%]通过设置G-CSF峰的峰面积在总的峰面积的比例来计算。SDS-PAGE确定纯度和分子量分布SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)包含基于蛋白质尺寸的蛋白质分离。在还原性条件下进行包含G-CSF的样品的纯度确定和分子量分布分析。为了该目的，使用Tris-Tricine 梯度凝胶(10-20%，来自 Anamed, Cat No. TR12012)和 Tris-HCl 梯度凝胶(10-20%，来自 Biorad, Cat No. 345-0043)。对于 Tris-Tricine 梯度凝胶，使用来自 BioRad(Cat No. 161-0326 ；1. 4 - 26. 6kDa)的多肽SDS-PAGE分子量标样作为分子量标样；对于Tris-HCl梯度凝胶，使用来自BioRad (Cat No. 161-0373，10_250kDa)的精确加蛋白全蓝色标样。通过电泳分离的蛋白条带用银或考马斯蓝染色来显像。使用大肠杆菌源性重组人G-CSF (未糖基化，R&D系统，Cat No. 214-CS-005)糖基化的、CHO源的商业化产品粒细胞(Chugai)作为G-CSF参照(对照样品)。分子量和纯度的评价通过鉴定标样、参照(对照样品)和分析样品的外观来视觉上确定。重组G-CSF含G-CSF的细胞悬浮液的制备和纯化。细胞所用的细胞系是人胚胎肾细胞293 (HEK293)的衍生物，其适合于无血清生长。该宿主HEK293F，用携带编码G-CSF序列的cDNA的表达盒稳定转染。强启动子用于该表达盒。常规方法也描述于EP1739179 (Schriider等)。培养方法细胞在无血清培养基中在常规设备中根据本领域熟知的常规方法来培养，例如在t_烧瓶、摇瓶和生物反应器中振荡或搅拌培养(一次性系统和方便的搅拌容器)以批量、批量补料、灌注或连续恒化器培养(Freshney, R I (2000), Culture of animal cells amanual of basic technique,第四版，Wiley-Liss ;Spier, R E ed(2000), Encyclopediaof cell technology, Wiley, New York ；Enfors, S-O and Haggstrom L (2000),Bioprocesstechnology :fundamentals and applications, Hogskoletryckeriet, RoyalInstitute of Technology, Stockholm ；Vinci,V A and Parekh, S R(2003), Handbook ofindustrial cell culture mammalian,microbial,and plant celIs,Humana Press,USA)。典型地，培养基的灌注用于在标准批量培养水平之外增加细胞数目和产物滴定度。产物收率和宿主细胞蛋白的量根据培养模式而不同 产物滴定度典型地随细胞数目增加而增加 总蛋白质含量和DNA含量典型地随细胞数目增加而增加 总蛋白质含量和DNA含量还可以随培养持续时间增加而增加 批量培养积累蛋白质和DNA ;不从外界加入任何东西,不移除任何东西 灌注过程冲洗细胞培养物，去除代谢物、蛋白质、DNA和其它杂质；过滤器或细胞离心机典型地用于细胞保持。从细胞释放重组产物，细胞悬浮液或细胞悬浮液上清液为收获物。收获物的性质(如上文所述的产物滴定度和杂质)根据所用的培养方式而不同。细胞悬浮液用于一些下文描述的G-CSF样品。纯化方法重组产物从细胞释放,细胞悬浮液或细胞悬浮液上清液为收获物。应用的纯化包含4步的纯化。阳离子交换色谱(SP Sepharose Fast Flow(FF))用于从细胞培养上清液中捕获G-CSF的步骤，然后是基于锌的固定化金属亲和色谱(IMAC)步骤(Ζη-IDA螯合的Sepharose Fast Flow(FF)),用于优化的第二阳离子交换色谱步骤(Resource S)和作为最后步骤的尺寸排阻色谱步骤(Superdex75)。含G-CSF细胞培养物上清液的分离捕获步骤之前，上清液批次的G-CSF浓度[mg/L]用G-CSF特异性ELISA来确定以便核实总的G-CSF量[mg]。(_80°C )在调节至20±5°C的水浴中将冷冻的上清液解冻。之后将上清液在4°C以9000x g离心15分钟,然后另外用O. 2 μ g过滤单元过滤。将过滤后的上清液的PH用乙酸调节至pH4. O。捕获步骤(SPSepharose FF)用IOml 的 SP Sepharose FF 材料填装 XK 16/20 柱(I 个柱体积(CV) =IOml )。SPSepharose FF 树脂得自 GE Healthcare 公司(Cat No. 17-0729-01)。用3CV的平衡缓冲液(20nM乙酸钠，IOOmM氯化钠，O. 02%吐温20，pH 4. O)执行平衡，之后以2. 5ml/分钟的流速加载起始材料。后继的洗涤步骤用同样的缓冲液和流速用5CV进行。用洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱缓冲液含有20mM乙酸钠，IM氯化钠，O. 02%吐温20，PH4. 0，使用从0%到40%洗脱缓冲液的线性梯度，在8CV之内，使用2. 5ml/分钟的流速，随后是以100%洗脱缓冲液以5CV洗脱的步骤。从线性梯度洗脱收集的洗脱液汇集物的G-CSF浓度通过G-CSF特异性ELISA来分析。IMAC 步骤(Zn-IDA 螯合 Sepharose FF)用IOml的以2ml 0. 2M ZnCl2带电的螯合S印harose FF填装XK 16/20柱(I个柱体积(CV)=IOml)。螯合Sepharose FF树脂得自 GE Healthcare公司(Cat No. 17-0575-01)。上样之前将IMAC柱负载(SP Sepharose FF)的pH用NaOH调节为ρΗ8· O。
用3CV的平衡缓冲液(20nM乙酸钠，150mM氯化钠，pH 8. O)执行平衡，之后以2ml/分钟的流速加载SP Sepharose FF洗脱液。后继的洗涤步骤用同样的缓冲液和流速用2CV进行。用洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱缓冲液含有20mMTris/HCl，150mM氯化钠，pH4. O,使用从0%到100%洗脱缓冲液的线性梯度，在3CV之内，使用Iml/分钟的流速。之后使用100%洗脱缓冲液的梯度延迟进行4CV。从100%洗脱缓冲液洗脱中收集的洗脱液汇集物的G-CSF浓度通过G-CSF特异性ELISA来分析。优化步骤(ResourceS)用5CV的平衡缓冲液(20mM乙酸钠，O. 02%吐温_20，pH4. O)以4ml/分钟的流速平 衡来自 GE HEALTHCARE 公司(Cat No. 17-1180-01)柱的预填装的 Resources 柱(CV=6ml)。纯化之前必须用乙酸将IMAC洗脱液调节pH至4. O并用平衡缓冲液稀释5倍。洗涤步骤用IOCV的平衡缓冲液以4ml/分钟的流速进行。用洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱缓冲液含有20mM乙酸钠，IM氯化钠，O. 02%吐温_20，PH4. 0，使用从0%到100%洗脱缓冲液的线性梯度，在20CV之内，使用2ml/分钟的流速。通过G-CSF特异性ELISA来分析从用50_85%洗脱缓冲液的线性梯度洗脱中收集的洗脱液汇集物的G-CSF浓度。尺寸排阻色谱步骤(Superdex 75)对于尺寸排阻步骤，使用预填装的Hiload 26/60Superdex 75Prep Grade柱(GEHealthcare Cat No. 17-1044-01，CV=320ml)。用 ICV 的缓冲液(20mM 乙酸钠，200mMNaCl,0. 02%吐温20，pH6. 5)平衡所述柱，随后以2. 5ml/分钟的流速加载Resources洗脱液，最大加载体积为4%CV。洗脱液汇集物的G-CSF浓度通过G-CSF特异性ELISA和反相(RP) -HPLC来分析。最终纯化级分的纯度通过使用RP-HPLC、尺寸排阻(SE) -HPLC和SDS-PAGE来分析，并典型地> 95%。用Capto MMC树脂作为捕获步骤纯化rhG-CSF实施例I (实验I)起始材料在平衡缓冲液中稀释纯化过的rhG-CSF以降低总蛋白浓度并达到更方便的体积，之后加载于Capto MMC柱。在稀释之前将rhG-CSF溶于20mM乙酸钠，O. 5M NaCl, O. 02%吐温 20，pH 4.0 中。色谱树脂与柱Capto MMC，一种来自 GE HEALTHCARE 公司(cat no. 17-5317)的混合式树脂，用作rhG-CSF分子的捕获步骤。Capto MMC是具有疏水和亲硫相互作用和氢键的弱阳离子树脂。Tricorn 5/150 柱(GE HEALTHCARE 公司)用 Capto MMC 树脂填装至床高为 15cm。Capto MMC的柱体积为3ml。缓冲液平衡缓冲液20mM乙酸钠，O. IM NaCl, O. 02%聚山梨醇酯80，pH4. O洗脱缓冲液20mM柠檬酸钠，O. IM NaCl，O. 5M精氨酸单盐酸，O. 02%聚山梨醇酯80，pH 7. O0实验设置柱用平衡缓冲液平衡之后以Iml/分钟的流速加载起始材料。之后用平衡缓冲液洗涤并然后用洗脱缓冲液洗脱柱。抽出样品并通过HPLC方法分析rhG-CSF。如表I所示，在流出级分中没有发现G-CSF。洗脱缓冲液含O. 5M精氨酸单盐酸并将pH调节至7. O。G-CSF的回收率为89%，洗脱谱是一个更浓缩的峰。洗脱之后用IM NaOH溶液适当地清洁柱。从柱的IM NaOH洗涤液中可以看到非常小的峰。色谱图显示在图I。表I. 样品体积rhG-CSF总rhG-CSF~收率
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起始材料__8^71__Π1__966.8__100_
流过和平衡洗OOO
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洗股液丨12I 7286489结论所有加载的G-CSF在ρΗ4. O下结合至Capto MMC。在三个柱体积中收集的洗脱级分获得了高收率(89%)。洗脱缓冲液具有pH 7. O并包括O. 5M精氨酸单盐酸。图例图I.实验I ;在Capto MMC柱上pH 4. O使用乙酸钠缓冲液纯化G-CSF的色谱图。测量的280nm的吸光度(mAU)和电导率(mS/cm)表示在图中。柱用pH7. O的含O. 5M精氨酸单盐酸的缓冲液洗脱。通过洗脱获得了双峰。双峰作为一个级分收集。实施例2 (实验2)起始材料纯化过的rhG-CSF在平衡缓冲液中稀释以降低总蛋白质浓度并达到更方便的体积，之后加载于Capto MMC柱。在稀释之前将rhG-CSF溶于20mM乙酸钠，O. 5M NaCl,O. 02%吐温20，pH 4.0中。色谱树脂与柱Capto MMC，一种来自 GE HEALTHCARE 公司(cat no. 17-5317)的混合式树脂，用作rhG-CSF分子的捕获步骤。Capto MMC是具有疏水和亲硫相互作用和氢键的弱阳离子树脂。Tricorn 5/150 柱(GE HEALTHCARE 公司)用 Capto MMC 树脂填装至床高为 15cm。Capto MMC的柱体积为3ml。缓冲液平衡缓冲液20mM乙酸钠，O. IM NaCl, O. 02%聚山梨醇酯80，pH4. O洗脱缓冲液:20mM柠檬酸钠，O. IM NaCl, O. 02%聚山梨醇酯80，pH 7. O。实验设置柱用平衡缓冲液平衡之后以Iml/分钟的流速加载起始材料。之后用平衡缓冲液洗涤并然后用洗脱缓冲液洗脱柱。抽取样品并通过HPLC方法分析rhG-CSF。如表2所示，在流出级分中没有发现G-CSF。洗脱缓冲液具有7. O的pH。在洗脱的级分中发现超过90%的加载于Capto MMC柱的G-CSF。洗脱峰宽于实验I中，实验I中洗脱缓冲液中包含精氨酸。洗脱体积为两倍。表2.
权利要求
1.一种以使用色谱的纯化顺序纯化生长因子蛋白的方法，所述生长因子蛋白选自克隆刺激因子(CSF)例如G-CSF (粒细胞克隆刺激因子)或粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)、白介素3 (IL-3)、肝细胞生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子(酸性)，其特征在于 -至少一种色谱用多元树脂进行 -所述生长因子蛋白在PH 4到6. 2之间时结合至所述多元树脂，和 -所述生长因子蛋白在pH > 6. 3下洗脱 -可选地与酵母源性亲和配体色谱步骤组合，尤其是针对所述生长因子蛋白的酵母源性Fab片段。
2.权利要求I的方法，其中所述多元树脂包含结合于基质的部分并且该部分能够通过 离子相互作用和其它类型的相互作用例如氢键和疏水相互作用而与混合物中的生长因子蛋白结合。
3.权利要求I或2的方法，其中包含生长因子蛋白的混合物是溶液。
4.权利要求1-3任意一项的方法，其中所述生长因子蛋白是重组生长因子蛋白。
5.权利要求1-4任意一项的方法，其中所述生长因子蛋白通过pH改变>pH 6. 3来洗脱。
6.权利要求1-5任意一项的方法，其中洗脱通过改变pH或通过含有氨基酸的洗脱试剂来进行，所述氨基酸具有碱性侧链和/或在洗脱缓冲液中具有高离子强度。
7.权利要求6的方法，其中洗脱试剂的浓度在约O.IM至约2. OM的范围内。
8.权利要求1-7任意一项的方法，其中所述生长因子蛋白在pH约4.O至pH约6. O下结合至所述多元树脂，并且所述生长因子蛋白在PH6. 5或更高特别是在约pH7. O下从所述多元树脂上洗脱。
9.权利要求1-8任意一项的方法，其中使用这样的缓冲物质，其包含柠檬酸钠，乙酸钠，HEPES，且所述缓冲物质优选选自柠檬酸钠，组氨酸，2- (4- (2-羟乙基)_1_哌嗪基)-乙磺酸(HEPES)，2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，Tris碱和乙酸钠，特别是在约pH4至约pH8的范围内。
10.权利要求1-9任意一项的方法，其中在所用的任何缓冲液中存在非离子去污剂，所述非离子去污剂特别选自聚山梨醇酯(聚山梨醇酯20，40，60，80)和Pluronic F68。
11.权利要求8-10任意一项的方法，其中具有碱性侧链的氨基酸是精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。
12.权利要求1-11任意一项的方法，其中使用这样的缓冲液，其包含约O.1M-2M氯化钠或O. 1M-2M精氨酸单盐酸，可以在生长因子蛋白洗脱之前在pH 4. 0-6. O范围的洗涤步骤。
13.权利要求1-12任意一项的方法，其特征在于在生长因子蛋白释放之前向多元树脂施加洗涤缓冲液，以洗去污染物而保留生长因子蛋白，其特征在于所述洗涤缓冲液包含具有碱性侧链的氨基酸和/或根据Hofmeister系列选择的盐。
14.权利要求1-13任意一项的方法，其特征在于多元色谱树脂包含下列部分中的至少一种 a.带正电荷的N-苯甲基-N-甲基乙醇胺配体， b.带负电荷的2-(苯甲酰胺)丁酸配体，C.苯丙基配体， d.N-己基配体， e.4-巯基-乙基-吡啶配体， f.3-((3-甲基-5-((四氢呋喃-2-基甲基)-氨基)-苯基)-氨基)-苯甲酸配体或其组合。
15.权利要求1-14任意一项的方法，其特征在于多元色谱树脂选自下列商业上可获得的树脂HEP Hypercel ；PPA Hypercel ；Capto Adhere ；Capto MMC ；MEP Hypercel 。
16.权利要求1-15任意一项的方法,包含下列步骤 -阳离子多元树脂例如Capto MMC ； -基于化学的失活步骤以封装病毒，尤其是使用EP-A-131740中公开的三正丁基磷酸酯和Triton X-100的溶剂/去污剂失活； -基于酵母中表达的配体的亲和树脂； -阳离子交换器例如SP Sepharose或Resource S ； -病原体过滤移除步骤，使用平均孔尺寸约20nm例如Planova 20N ； -缓冲液交换和/或浓缩步骤，例如用大约截断l_5kDa的超滤； -尺寸排阻色谱树脂例如Superdex 75。
17.权利要求16的方法，其特征在于多元色谱步骤与由基于酵母中表达的蛋白的配体提供亲和性的亲和色谱步骤组合，并且从亲和色谱树脂获得的产物的纯度大于90%。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于进行另外的色谱步骤，所述另外的色谱步骤选自尺寸排阻、阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用和固定化金属亲和色谱，其特征在于终产物的纯度大于99%。
19.权利要求1-17任意一项的方法，其特征在于所述纯化顺序进一步包含病原体移除/失活步骤，所述病原体移除/失活步骤包含基于化学的失活步骤，基于尺寸的移除步骤，色谱步骤或其组合，所述步骤基于针对要移除的病原体的不同生理学特性。
全文摘要
一种在使用色谱的纯化顺序中纯化生长因子蛋白的方法，特征在于-至少一种色谱用多元树脂进行；-所述生长因子蛋白在pH 4到6.2之间时结合至所述多元树脂，并且所述生长因子蛋白在pH＞6.3下洗脱，并且生长因子蛋白的洗脱通过向洗脱缓冲液加入精氨酸和/或NaCl来改进。-多元树脂步骤随后是酵母源性亲和配体树脂步骤，这导致产物纯度＞90%。
文档编号C07K14/52GK102858797SQ201180017726
公开日2013年1月2日 申请日期2011年3月30日 优先权日2010年3月30日
发明者古斯塔夫·吉尔加姆, 斯特凡·温厄, 马亚·蒂迈尔 申请人:奥克塔法马股份有限公司