改性的h因子结合蛋白(fhbp)及其使用方法

专利名称：改性的h因子结合蛋白(fhbp)及其使用方法
改性的H因子结合蛋白(FHBP)及其使用方法交叉引用本申请要求申请号为61/319，181，申请日为2010年3月30日、申请号为61/334，542，申请日为2010年5月13日、申请号为61/381，025，申请日为2010年9月8日、申请号为61/423，757，申请日为2010年12月16日、以及申请号为61/440,227，申请日为2011年2月7日的美国临时专利申请的优先权，各申请的全部内容通过引用并入本申请。关于联邦政府资助研究的声明本发明在美国国家过敏与感染性疾病研究所和国立卫生研究院基金的资助下完成，基金号R01AI046464、ROlAI 082263、和Al 070955。政府对本发明享有一定权利。
並直脑膜炎奈瑟球菌是一种革兰氏阴性细菌，寄居在人上呼吸道，最值得注意的是，它导致脑膜炎和败血症在世界范围内的零星和周期性流行爆发。两岁以下儿童的发病率和死亡率最高。与其他革兰氏阴性细菌相似，脑膜炎奈瑟球菌通常具有细胞质膜、肽聚糖层、夕卜膜和菌毛，外膜与荚膜多糖一起构成细菌细胞壁，菌毛突出在外环境中。有荚膜的脑膜炎奈瑟球菌菌株是青少年中导致细菌性脑膜炎和败血症的主要原因。侵袭性脑膜炎奈瑟球菌感染的流行和经济上的重要性促使人们研究有效的疫苗，使之能对各种菌株，特别是具有不同血清型或血清亚型的遗传多样性B群菌株产生免疫力。
H因子结合蛋白(fHbp，在本领域也称为脂蛋白2086(Fletcher et al (2004)Infect Immun72:2088-2100))、基因组衍生的奈瑟菌属抗原(GNA) 1870 (Masignani etal. (2003) J Exp Medl97:789-99)或“741”)是一种脑膜炎奈瑟球菌蛋白，其在细菌中以表面暴露的脂蛋白形式表达。fHbp的一个重要功能是与人补体因子H(fH)结合，其能够下调补体的活性。fH与细菌表面的结合是病原体在未经免疫的人血清或血液中存活并逃避先天性宿主防御的重要机制。最近，发现人H因子基因簇的遗传变异影响对发生脑膜炎球菌疾病的易感性(Davila S et al. (2010) Nat Genetics doi : 10. 1038/ng. 640)。fH 与人 fH 的fHbp的特异性结合能够解释为何脑膜炎奈瑟球菌仅严格地作为人的病原体。仍需要一种能够引发有效的杀菌抗体应答的fHbp多肽。发明概沭本申请提供了 H因子结合蛋白及其使用方法，所述蛋白能够引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌种菌株具有杀菌性的抗体。附图简沭图I :列A，以脑膜炎球菌fHbp作为各孔中的抗原，通过ELISA检测得到的人fH浓度的标准曲线。详细情况参见实施例I。列B，人fH转基因(Tg)小鼠血清中的人fH浓度，其中包括人fH-Tg阴性同窝小鼠或已知的野生型BALB/c小鼠，以及人血清中的人fH浓度。参见实施例I。图2 :经C群脑膜炎球菌偶联对照疫苗免疫后，人fH转基因(fH Tg)BALB/c小鼠和野生型(WT) BALB/c小鼠的血清IgG抗体应答(列A和列B)，以及针对C群4243菌株的血清杀菌性滴度(列C)。偶联疫苗不与人fH结合。详细情况参见实施例I。列D :人fH与野生型fHbp疫苗结合，但不与对照MenC-CRM偶联疫苗或某些突变的fHbp疫苗结合，如实施例部分表5的相应图示。小鼠(或家兔、或大鼠等)fH不与野生型fHbp结合。图3 :使用结合人fH的野生型fHbp接种(列A)、或不结合人fH的R41S突变体接种(列B)后，fH转基因小鼠血清中人fH的浓度与血清杀菌性抗体应答的关系。列C为利用一般线性回归模型估算的GMT比率(突变/野生型疫苗与免疫的fH转基因小鼠的人fH血清浓度的相关性)。详细情况参见实施例4。图4 :利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定人fH、抗-fHbp mAb、JAR4、和JAR5与野生型和突变型fHbp(fHbpIDl的突变体，包含Glu替换为Ala)的结合。图5 WT fHbp ID I和ID I双突变体E218A/E239A的SDS-PAGE大小和纯度分析。分子量以kDa计，显示在左侧。图6 :通过ELISA，检测可溶性fHbp对抗fHbp MAb与固定的野生型fHbp的结合的抑制。 图7 :列A和列B显示了野生型fHbp ID I和E218A/E239A双突变体蛋白(列A)与野生型fHbp ID I和R41S突变体蛋白(列B)的差示扫描量热法结果。列C显示了经ELISA法确定的小鼠的抗fHbp IgG抗体滴度，所述小鼠经野生型fHbp ID I或E218A/E239A双突变体蛋白免疫。经WT或突变体fHbp免疫小鼠的抗fHbp IgG抗体应答。在研究3中，使用三个剂量的重组WT或突变体fHbp免疫小鼠，所述fHbp吸附于弗氏佐剂(FA)或氢氧化铝(Al (OH) 3);在研究4中，使用吸附于氢氧化铝(Al (OH) 3)的一个剂量的WT或突变体fHbp免疫⑶-I小鼠；在研究5中，使用吸附于氢氧化铝(Al (OH) 3)的三个剂量的WT或突变体fHbp免疫BALB/c小鼠。阴影柱状图，WT fHbp ;空心柱状图，E218A/E239A突变体fHbp。列D表示研究6中BALB/c小鼠的抗-fHbp IgG滴度，所述小鼠给予两个剂量的fHbp疫苗。图8 :列A表示fH与天然fHbp变体的结合。酶标板的各孔用表示变体fHbp IDI、14、或15的重组fHbp包被。如实施例部分所述检测人fH的结合。列B和列C分别表示变体 fHbpID I、14、和 15 与 Mab JAR4 和 JAR5 的结合。图9 :列A，fHbp与人fH片段复合物的结构。在卡通示意图中，fHbp在底部用黑色表示，fH在顶部用灰色表示。fHbp与fH片段结合的结构模型基于已公开的原子坐标(Schneideret al. ((2009) Nature 458:890-3))。黑色带分别表不 fHbp 分子的 N-和 C-末端结构域。灰色带表示此前已发表的人fH的第六和第七短同源重复结构域，所述结构域介导人 fH 与 fHbp 的相互作用(Schneideret al. ((2009)Nature 458:890-3)。左边的局部放大图为位置41的精氨酸残基，其与fH之间形成了带电荷的H键，预计精氨酸被丝氨酸取代后，H键将消失(右下插图)。该图使用MacPyMol (www. pymol. org)生成。列B显示了人H因子(fH)的氨基酸序列，已知其GenBank登录号为NP_000177 (P08603)，它的编码核酸为NM_000186o图 10 :利用 ELISA 检测的 fH (列 A)或抗-fHbp Mab JAR 4 (列 B)或 JAR 5 (列 C)与fHbp ID I的R41S和R41A突变体的结合。人fH(列A)与抗-fHbp MAb (列B和列C)的结合检测见实施例2所述。

图11 :人H因子(左列)或抗-fHbp Mab JAR 4(右列)与变体群I中不同的fHbp及其相应R41S突变体的结合。结合检测见实施例2。列A和列B显示了 fHbp ID 4的结合结果。列C和列D显示了 fHbp ID 9的结合结果。列E和列F显示了 fHbp ID 74的结合结果。“ID”指fHbp氨基酸序列变体识别(Identifcation，ID)编号，如奈瑟菌属多基因座序歹丨J分类网站 http: //pubmlst (dot) org/neisseria/fHbp/ 中所述。图12 :人fH和抗-fHbp MAb对照与变体群2中fHbp及fHbp的相应R41S突变体的结合。列A和列B显示了人H因子与野生型(WT) fHbp ID 19和fHbp ID 19的R41S突变体的结合。列C和列D显示了人H因子与WT fHbp ID 22和fHbp ID 22的R41S突变体的结合。列E和列F显示了人H因子与WT fHbp ID 77和fHbp ID 77的R41S突变体的结合。MAb对照为JAR4 (列B和列D)或JAR 11 (列F)。图13 :在人fH转基因小鼠血清中引发的抗-fHbp抗体对fH与fHbp结合的影响。用ELISA检测fH与fHbp的结合，所述检测使用免疫前(列A，免疫前)和免疫后(列B，免疫后)血清的1:100稀释液，所述血清来自经野生型fHbp ID I或R41S突变体ID IfHbp疫苗免疫的各转基因小鼠。对于铝对照组，空心方块表示来自含有人fH的转基因小鼠的混合血清的数据，闭合三角表示来自不含人fH的野生型小鼠血清的数据。OD值表示结合人fH的量，所述量使用绵羊抗人fH和偶联至碱性磷酸酶的驴抗绵羊IgG检测。列C，免疫后血清中的抗-fHbp IgG滴度表明，针对两种疫苗产生了类似的抗体应答。列D，在加入的人 fH存在的情况下，人fH与fHbp结合的抑制。列E，fH结合的抑制百分率与人fH转基因小鼠SBA滴度的关系，所述小鼠经fHbp疫苗免疫。图14 :列A和列B分别显示了 fHbp ID I的K241E突变体与fH的结合，以及与MAb JAR5的结合。列C和列D分别显示了 fHbp ID 15的E241K突变体与fH的结合，以及与MAb JAR5的结合。如实施例2所述检测fH或抗fHbp MAb与fHbp的结合。图15 :利用 ELISA 检测 fH 或抗 fHbp MAb 与 fHbp ID I 的 H119A 和 R130A 单突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)与抗fHbp MAb JAR 5 (列B)或JAR 4 (列C)的结合。图16 :六个最常见的fHbp模块群的示意图，所述模块群命名为I至VI。可变片段分别衍生自两个遗传谱系之一，命名为α (以灰色表示)或β (白色)。根据pubmlst. org/neisseria/fHbp/网站采用的命名法，也可以将α和β谱系命名为谱系I和2。片段1起始于氨基酸残基8并延伸至位置73，而片段Vb起始于位置79并延伸至位置93 (所述氨基酸残基的编号基于fHbp ID I的序列)。片段V。起始于氨基酸残基98并延伸至位置159，而片段Vd起始于位置161并延伸至位置180。片段Ve起始于氨基酸残基186并延伸至位置253。在分析的70个fHbp氨基酸序列变体中，33个仅含有α类片段，7个仅含有β类片段，两类片段分别命名为模块群I和II。其余的30个fHbp变体为含有α和β片段不同组合的天然嵌合体，可以分配至四个模块群(III-VI)之一。显示了模块群与Masignani变体群命名的关系，以及在各fHbp模块群中观察到的唯一序列的数量。图16的最后一个模块图显示了工程化(非天然存在的)fHbp嵌合体I的模块架构。对于来自fHbp ID I和ID 77 “嵌合体 I” 的工程化嵌合蛋白而言(Beernink et al. (2008) Infec. Immun. 76:2568-2575),位置136至139的四个氨基酸残基GEHT (SEQ ID NO: 27)表示Vc片段的结点(参见图19)。ID指的是在公开的网站http: //pubmlst. otr/neisseria/fHbp/中所描述的fHbp序列多肽识别号。图17 fH与重组fHbp突变体S41P(fHbp ID 15的突变体)的结合。列A显示了fH与fHbp ID 15的S41P突变体的结合。列B和列C分别显示了 fHbp ID 15的S41P突变体与 MAb JAR 5 和 MAb JAR31 的结合。“Pep28” 为 fHbp ID 28 ;“P印I ” 为 fHbp ID I ；“P印 15WT” 为 fHbp ID 15;以及 “P印 15S41P” 为 fHbp ID 15 的 S41P 突变体。图18 :人 fH 与 fHbp 嵌合体 I 的 R41S 突变体的结合(Beernink et al. (2008)Infec. Immun. 76:2568-2575)(列 A)以及相应 JAR 5 的结合(列 B)。图19 :列A,天然变体与人工嵌合体(嵌合体I ；Beernink et al. (2008) Infec.Tmmun. 76:2568-2575)的 fHbp 序列比对。fHbp ID I 属于模块群 I (根据 Beernink andGranoff (2009) Microbiology 155:2873-83的定义，全部五个可变片段，A_E，均衍生自α谱系)。fHbp ID 28属于模块群II (全部五个片段均衍生自β谱系)。fHbp ID 15是天然嵌合体(属于模块群IV，具有一个β A片段以及α B、C、D、和E片段)。fHbp ID 28的β -型A片段(Va ;残基8-73)与fHbp ID 15的相应A片段(Va)相比较，后者也具有β -型A片段(νΑβ)。长方形表示在Ε218Α/Ε239Α双突变fHbp中改变的残基。列B，fHbp ID I和fHbp ID 77的A片段(氨基酸残基8至73)的比对。列C，fHbp ID I和fHbp ID 77的C片段(氨基酸残基98至159)的比对。结点在残基136。嵌合fHbp包括从IDl至残基G136的氨基酸序列，以及fHbp ID 77从残基136至C末端的序列。列D显示了在氨基酸位 置41 (编号基于fHbp ID I的编号)的天然多态性的比对；某些变体具有精氨酸(R41，ID1、19、4、9和74)，而其他变体具有丝氨酸(S41,ID 55、15)或脯氨酸(P41，ID 28)。ID指的是fHbp序列ID ；MG指的是fHbp模块群；以及VG指的是变体群。列E，fHbp ID UfHbp ID77和嵌合体I的比对。fHbp ID 77中用阴影表示的残基强调了片段V。中与嵌合体I中相应位置不同的残基。以从N-末端至C-末端的顺序，加粗和用阴影表示的残基对应于K113、K119、和 D121。图 20 :利用 ELISA 检测 fH 或抗 fHbp MAb 与 fHbp ID 77 的 K113A、K119A、和 D121A单突变体的结合。如实施例2所述检测人fH (列A)和抗-fHbp MAb JAR 31 (列B)与fHbpID 77突变体的结合。图 21 :利用 ELISA 检测 fH 或抗 fHbp MAb 与 fHbp ID 77 的 R41S/K113A、R41S/K119A、和41S/D121A双突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)和抗-fHbp MAbJAR 31(列B)与fHbp ID 77突变体的结合。图22 :利用 ELISA 检测 fH 或抗-fHbp MAb 与 fHbp ID 77 的 K113A/D121A 双突变体和R41S/K113A/D121A三突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)、抗-fHbp MAbJAR 4(列B)和抗-fHbp MAb JAR 31 (列C)与fHbp ID 77突变体的结合。图23 :利用ELISA检测fH与fHbp ID 22突变体的结合。如实施例2所述检测人fH与D221A、R80A、或野生型fHbp的结合(列A)，人fH与E218A、E248A、或野生型fHbp的结合(列B)，以及人fH与R41S、Q38A、Q126A、或野生型fHbp的结合(列C)。图24 :利用ELISA检测抗fHbp MAb JAR31与fHbp ID 22突变体的结合。如实施例2所述检测R80A和D211A突变体与JAR31的结合(列A)，以及E218A和E248A突变体与JAR31的结合(列B)。图25:利用ELISA检测抗fHbp Mab JAR4与fHbp ID 22突变体的结合。如实施例2所述检测R80A和D211A突变体与JAR4的结合(列A)，以及E218A和E248A突变体与JAR4的结合(列B)。图26 :利用ELISA检测抗fHbp MAb JAR35与fHbp ID 22突变体的结合。如实施例2所述检测R80A和D211A突变体与JAR35的结合(列A)，以及E218A和E248A体突变与JAR35的结合(图B)。图27 :利用 ELISA 检测抗 fHbp MAb 与 fHbp ID 22 的 T220A/H22A 双突变体，或G236I突变体的结合。如实施例2所述检测人fH (列A)、抗fHbp MAb JAR 31 (列B)、JAR35 (列C)、或JAR4 (列D)与fHbp ID 22突变体的结合。图28 :利用 ELISA 检测 fH 或抗 fHbp MAb 与 fHbp ID 22 的 R41S、Q38A、和 A235G 突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)、抗fHbp MAb JAR 31 (列B)或JAR 35 (列C)与fHbp ID 22突变体的结合。图 29 :利用 ELISA 检测 fH 或抗 fHbp MAb 与 fHbp ID 22 的 Q126A、D201A 、和 E202A突变体的结合。如实施例2所述检测人fH(列A)、抗fHbp MAb JAR 35 (列B)与fHbp ID22突变体的结合。图30 :与fHbp ID 28 (变体群3)突变体的结合。列A和列C，利用ELISA检测fH与K199A、E217A、和E218A突变体的结合。列B和列D显示了抗fHbp MAb JAR 31 (列B)、和抗fHbp MAb JAR 33 (列D，仅fHbp野生型ID 28WT和E218A突变体)与fHbp ID 28突变体的结合。图31描述了野生型BLAB/c小鼠的血清杀菌性滴度，所述小鼠经fHbp ID I疫苗的指示突变体免疫，并用针对血清群B菌株H44/76 (fHbp ID I)检测滴度。图32描述了小鼠的血清杀菌性滴度，所述小鼠经fHbp ID 22的指示突变体免疫，并用针对血清群W-135菌株Ghana 7/04 (fHbp ID 23)检测滴度。上图，与野生型(WT) fHbpID22疫苗相比，滴度无显著性差异的突变疫苗(P>0. 10)。下图，与对照WT ID 22疫苗相比，引发滴度显著降低的突变疫苗(P〈0. 05)。图33描述了小鼠的杀菌性滴度，所述小鼠经fHbp ID 77的R41S/K113A/D121A三突变体免疫，并用针对血清群W-135菌株Ghana 7/04 (fHbp ID 23)检测滴度。图 34:fHbp ID I (SEQ ID NO: I), fHbp ID 22 (SEQ ID NO: 2) ,fHbp ID 77 (SEQ IDNO:4) ,fHbp ID 28 (SEQ ID NO: 3)、和 ID1/ID77 嵌合体(SEQ ID N0:8)氨基酸序列的比对。ID 28 作为 fHbp 变体群 3 的对照序列。如 Schneider et al. ((2009) Nature 458:890-3)所述，根据与fH片段复合的fHbp ID I的晶体结构，预测出的在H因子结合接触面形成氢键或离子间相互作用的残基(用灰色标出)。位置136至139的GEHT (SEQ ID NO: 27)(加粗)表示嵌合fHbp ID I与ID 77之间的结点。图 35:fHbp ID I (SEQ ID NO :1), fHbp ID 22 (SEQ ID NO :2) ,fHbp ID 77 (SEQ IDNO:4) ,fHbp ID 28 (SEQ ID NO: 3)、和 ID1/ID77 嵌合体(SEQ ID N0:8)氨基酸序列的比对。
用灰色标出的残基表示突变的残基，其汇总于表7。图36描述了在与fH片段形成的复合物中fHbp的模型。描述了已知影响抗fHbpmAb JAR 3和JAR 5(G121和K122)以及mAb 502 (R204)表位的氨基酸残基的位置。图37A-D描述了利用ELISA(列A)、等离子共振(列B)、针对活细菌的流式细胞术(列C，仅mAb ;和列D，存在20%已除去IgG的人血清中的mAb)检测的人IgGa小鼠嵌合的fHbp特异性mAb与fHbp的结合。图38A-B 描述了人 IgGl 小鼠嵌合抗-fHbp mAb JAR 3、JAR 5 和 mAb 502，在有包膜的血清群B菌株H44/76细菌上，激活补体而产生的Clq依赖性C4b沉积作用。列A，将去Clq的人血清作为补体来源；列B，反应前，将纯化的Clq蛋白添加到去Clq的血清。列C描述了各mAb的由人补体介导的杀菌性活性，针对血清群B菌株H44/76进行检测。图39A-C描述了将fHbp附着至酶标板各孔，通过ELISA检测抗fHbp mAb对fH结合的抑制作用(列A)，和使用血清群B菌株H44/76的活细菌，通过流式细胞术检测抗-fHbpmAb对fH结合的抑制作用(列B和列C)。图40A-C描述了 fH与血清群B H44/76突变体的结合，所述突变体使fHbp表达、或fHbp和NspA两者遗传失活。列A，对照抗-PorA mAb的结合；列B和列C，在已除去IgG的人血清中，fH的结合。图41A-E描述了人IgG小鼠嵌合抗-fHbp mAb的杀菌性活性，针对NspA遗传失活的血清群B H44/76突变体进行检测。列A、列B、和列C :分别为抗-fhbp mAb JAR 3、JAR 5和mAb 502 ;列D和列E :分别为对照抗-PorA和抗荚膜mAb。
图42描述了抗-NspA抗体针对荚膜群A菌株(Senegal 1/99)的杀菌性活性，所 述抗体针对fHbp敲除的血清群A菌株(上图)或对照抗-PorAmAb Pl. 9 (下图)。图43，列A-C描述了野生型小鼠的血清抗fHbp抗体应答，所述小鼠经重组fHbp疫苗或天然外膜囊泡疫苗免疫，所述疫苗来自fHbp过表达或fHbp敲除的血清群B菌株H44/76突变体。利用ELISA检测抗-fHbp抗体对免疫的应答(列A)，或血清抗-fHbp抗体抑制fH与fHbp结合的能力(列B和列C，也是利用ELISA检测)。小鼠经重组fHbp ID I疫苗(实心三角)、或NOMV疫苗免疫，所述疫苗来自fHbp ID I过表达(空心圈)或fHbp敲除(实心圈)的血清群B菌株H44/76突变体。图44表示奈瑟菌属表面蛋白A(NspA)多肽(SEQ ID NO: 15)的氨基酸序列。图45 :各种天然存在的H因子结合蛋白(fHbp)的氨基酸序列fHbp ID I、fHbpID 15、fHbp ID 22、fHbp ID 28、fHbp ID 77、和嵌合体 I (Beernink et al. (2008) Infec.Immun. 76:2568-2575)。显不的FHbp ID序列无前导序列。在嵌合体I的序列中，小写字母对应于衍生自fHbp ID I的氨基酸序列，而大写字母对应于衍生自ID 77的氨基酸。在描述本发明和发明的特定示例性实施方式之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方式，因为这显然可以变化。还应理解本申请中所用的术语仅旨在描述特定实施方式，而非意在限制，因为本发明的范围将仅被后附的权利要求所限制。当提到一个数值范围时，应理解为本发明包括了范围的上限和下限之间的每一个中间数值以及任何其他在所描述的范围内描述到的数值或者中间数值，所述中间数值小到下限单位的十分之一，除非上下文内容另有明示。本发明还包括这些可能被独立包括在较小范围之内的这些较小范围的上限和下限，在所描述到的范围中明确排除的端值除外。当所描述到的范围包括一个或两个端值时，本发明的范围也包括排除了这些包含在内的端值后的范围。为清楚起见，本发明的某些特征分别在不同的实施方式中描述，应理解，这些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为简要起见，本发明的多个特征在单个实施方式中描述，这些特征也可以单独提高或以任意适宜的亚组合形式提供。本发明特别包括并公开了与对照氨基酸序列相比，涉及氨基酸修饰，包括氨基酸取代，的实施方式的所有组合，就好像每一个组合均独立地和明确地公开，只要此类组合包含具有所需特征的多肽，例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID I的非天然存在的fHbp多肽。此外，在本发明中还明确包括且公开了在那些描述此类氨基酸修饰的实施方式中列出的此类氨基酸修饰的所有组合(包括氨基酸取代)，就好像此类氨基酸修饰的每一个此类组合均独立地和明确地在本申请中公开。除非另有说明，否则本申请所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本申请所述的任何类似或等同的方法和材料实施或测试本发明，但以下描述的是优选的方法和材料。本申请提及的所有出版物均通过参考并入本申请，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。必须注意到，本申请和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，指代“一种抗原”时也包括多个这样的抗原，指代“所述蛋白”时也包括一个或多个蛋白，等等。在本申请中讨论的出版物仅因为其在本申请的申请日之前公开。本申请中所有内容均不应解释为承认本发明不能通过发明在先的方式而早于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际
公开日期不同，可能需要单独确认。
发明详述本申请提供了 H因子结合蛋白及其使用方法，所述蛋白能够引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌性的抗体。定义“H 因子结合蛋白”(fHbp)，在文献中也称为 GNA1870、GNA 1870、0RF2086、LP2086(脂蛋白2086)和“741”，指的是一类脑膜炎奈瑟球菌多肽。发现它在自然界中是细菌表面的脂蛋白。根据氨基酸序列的可变性和免疫交叉反应性(Masignani et al. (2003)J Exp Med 197:789-99)，脑膜炎奈瑟球菌菌株已被细分为三个fHbp变体群(在一些报道(Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-99)中称为变体 I (V. I)、变体 2 (V. 2)和变体(V. 3)，在其他报道(参见，例如 Fletcher et al. (2004) Infect Immun72:2088-2100))中称为家族 A 和 B)。根据 neisseria, org 或者 pubmlst. org/neisseria/fHbp/ 网站,在脑膜炎奈瑟球菌中发现的各个唯一的fHbp均分配了一个fHbp肽ID。因为变体2 (v. 2) fHbp蛋白(来自菌株8047，fHbp ID 77)和变体3 (v. 3) fHBP (来自菌株Ml239，fHbp ID 28)的长度与MC58(fHbp ID I)的长度分别具有-I和+7氨基酸残基的差异，所以用来指代v. 2和V. 3fHbp蛋白质残基的编号与基于这些蛋白质实际氣基酸序列的编号不同。因此，例如，位于V. 2或V. 3fHbp序列166位的亮氨酸残基(L)分别对应于V. 2蛋白165位和V. 3蛋白173位的残基。本申请中使用的人H因子(“人fH”)指的是包含图9B(SEQ ID NO 9)所示氨基酸序列的蛋白，及其天然存在的人等位基因变体。术语“异源”或“嵌合”指的是由来自不同来源或祖源序列的结构定义的两种组分。例如，在嵌合多肽的上下文中使用“异源”时，所述嵌合多肽包含可操作性连接的氨基酸序列，所述氨基酸序列来自不同系统发生群的不同多肽(例如，来源于α祖源氨基酸序列的第一组分和来源于β祖源氨基酸序列的第二组分)。嵌合多肽含有两个或多个已定义的片段，每个片段分别来自不同的祖先，可以是天然存在的或人工制备的(非天然存在的)多肽。有关天然存在的嵌合体的更多细节，参见Beernink PT, Granoff DM(2009)Microbiology 155:2873-83。非天然存在的嵌合体指的是“人工制备的嵌合体”，其包含带有自然界中不存在的异种成分的fHbp。“异源”或“嵌合”多肽还可以包含两种或多种不同的组分，每种组分分别来自不同的fHbp (例如，变体1、2、或3)。所述组分可以操作性连接在沿fHbp多肽长度的任意位点。在编码任何如上文所述的嵌合多肽的多核苷酸的上下文中的“异源”包括来自不同基因的可操作地连接的核酸序列(例如，来源于编码fHbp V. I多肽核酸的第一组分和来源于编码fHbp V. 2多肽核酸的第二组分)或来自不同的祖氨基酸序列(α或β)的核酸序列。其他示例性“异源”核酸包括表达构建体，其中包含编码序列的核酸可操作地连接于调节元件(例如启动子)，所述调节元件的遗传来源不同于编码序列的遗传来源(例如，为提供在目标宿主细胞中表达，所述宿主细胞的遗传来源可能不同于启动子、编码序列或不同于二者)。例如，当Τ7启动子操作性连接于编码fHbp多肽或其结构域的多核苷酸时，T7启动子被称为是异源核酸。
重组细胞的上下文中的“异源”指的是宿主细胞中存在与之遗传来源不同的核酸(或基因产物，如多肽)。例如，一种奈瑟氏菌属菌株的氨基酸或核酸序列对于另一种奈瑟氏菌属菌株的宿主是异源的。氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，“衍生自”fHbp ID I的氨基酸序列)的上下文中的“衍生自”用来表示所述多肽或核酸的序列是基于某对照多肽或核酸的序列(例如，天然存在的fHbp蛋白或编码核酸)，而不用来限制制备所述蛋白质或核酸的来源或方法。氨基酸序列或多核苷酸序列可以“衍生自”的对照多肽和对照多核苷酸的非限制性例子包括，天然存在的fHbp、fHbp ID1、和非天然存在的fHbp。细菌菌株的上下文中的“衍生自”用来表示通过亲本菌株的体内或体外传代培养而获得的菌株，和/或通过修饰亲本菌株而获得的重组细胞。“保守性氨基酸取代”指氨基酸侧链上的一个氨基酸残基被其他化学和物理性质(例如，电荷、大小、疏水性/亲水性)类似的氨基酸所取代。“保守性取代”旨在包括下列氨基酸残基组内的取代gly、ala ;val、ile、leu ;asp、glu ;asn、gln ;ser、thr ;lys、arg ;和phe、tyr。通过对存在感兴趣表位多肽的氨基酸序列进行比对，以指导此类取代。术语“保护性免疫”指的是对哺乳动物给予疫苗或免疫方案，以诱导免疫应答，所述免疫应答防止、延迟由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的发展、或降低所述疾病的严重程度，或减少或一并消除所述疾病的症状。保护性免疫可伴随有杀菌性抗体的产生。应注意，在本领域中公认，产生针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体预示着疫苗在人中具有保护作用(Goldschneider et al. (1969) J. Exp. Med. 129:1307; Borrow et al. (2001) InfectTmmun. 69:1568)。短语“脑膜炎奈瑟球菌菌株所致疾病”包括人类感染脑膜炎奈瑟球菌所表现的任何临床症状或临床症状组合。这些症状包括但不限于脑膜炎奈瑟球菌病原菌株寄居在上呼吸道(例如，鼻咽和扁桃体粘膜)、细菌进入粘膜和粘膜下血管床、败血症、脓毒性休克、炎症、出血性皮肤损伤、激活血纤蛋白溶解和血液凝结、器官功能失调，例如肾、肺和心力衰竭，肾上腺出血和肌肉梗死、毛细血管渗漏、水肿、外周肢体缺血、呼吸窘迫综合征、心包炎和脑膜炎。在抗原(例如，多肽抗原)的上下文中，短语“与某抗体特异性结合”或发生“特异性免疫反应”指的是，在可能包含其他分子的异质群体的样品中，基于和/或检验其中存在的抗原的结合反应。因此，在指定的条件下，所述一种或多种特异性抗体能与样品中的一种或多种特定抗原结合，而不与样品中存在的其他分子大量结合。抗原的表位(例如，多肽的表位)“与某抗体特异性结合”或发生“特异性免疫反应”指的是，在可能包含其他表位的异质群体的抗原(例如，多肽)中，和在可能包含其他抗原的异质群体中，基于和/或检验其中存在的表位的结合反应。因此，在指定的条件下，所述一种或多种特异性抗体能与抗原中的一个特定表位结合，而不与抗原和/或样品中存在的其他表位大量结合。短语“用量足以引发免疫应答”表示在给予特定抗原制品前后检测到的免疫应答指示物之间存在可检测的差异。免疫应答指示物包括但不限于通过以下试验检测到的抗体滴度或特异性酶联免疫测定(ELISA)、杀菌试验、流式细胞术、免疫沉淀、Ouchterlony免疫扩散；例如斑点、Western印迹或抗原阵列的结合检测试验；细胞毒性试验等。“表面抗原”是存在于脑膜炎奈瑟球菌的表面结构(例如，外膜、荚膜、菌毛等)中的抗原。
“分离的”指的是目标化合物的环境与其天然存在的环境不同。“分离的”旨在包括样品中的化合物，所述样品中充分富集了目标化合物，和/或其中的目标化合物部分或充分纯化。“富集”表示对样品进行非天然操作(例如，通过实验者或临床医生)，使目标化合物的浓度大于(例如，至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍或更多)起始样品中化合物的浓度，所述起始样品例如生物样品(例如，所述化合物天然存在的样品或在给药后存在于其中的样品)或制备所述化合物的样品(例如，在细菌多肽、抗体、嵌合多肽等中的情况)。靶基因“敲除”指的是导致靶基因功能降低的基因序列改变，例如，导致靶基因表达不可检测或不显著，和/或基因产物无功能或不具有显著功能。例如，将LPS合成中涉及的一个基因“敲除”后，基因功能大幅降低，导致基因表达不可检测，或仅处于不显著水平，和/或与修饰前相比，基因产品的生物学活性(例如，酶活性)显著降低或不可检测。“敲除”包括条件性敲除，例如当接触预先设定的条件(例如，温度、渗透压)时，以及当接触促进靶基因改变的物质等情形时，可以发生靶基因的改变。靶基因“敲入”指的是基因的遗传改变，所述改变导致所述靶基因产生的功能增强。FH结合特件改变的FHBP多肽在描述本发明拟公开的更多fHbp之前，描述一下一些天然存在的fHbp是很有帮助的。如neisseria, org和pubmlst. org/neisseria/fHbp的网站所示，在脑膜炎奈瑟球菌中发现的每一个独特且天然存在的fHbp均被分配一个fHbp肽ID。在本发明中将采用该fHbp命名规则。出于方便和清楚的考虑，对本申请中所有天然存在和非天然存在的fHbp氨基酸序列，包括本申请中描述的fHbp嵌合体和/或变体，选择fHbp ID I (脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58的V. IfHbp)的天然氨基酸序列作为对照序列。fHbp ID I的氨基酸序列见图45和下文fHbp ID ICSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ(SEQ ID NO:I)。在涉及fHbp中氨基酸残基的位置时，本申请中使用的位置编号与fHbp ID I的氨基酸残基编号对应。不同fHbp以及对应于fHbp ID I的各fHbp氨基酸残基的比对见图19。如图19和SEQ ID NO: I所示， 位置编号I指的是fHbp IDl中的第一个氨基酸残基，为半胱氨酸。在某些情况下，本申请中涉及的fHbp的N-末端可以包含附加的前导序列。例如，fHbp ID I 可以在 N-末端具有前导序列 MNRTAFCCLSLTTALILTA(SEQ ID NO: 16)。但是，在本申请中，仍将任何fHbp中的氨基酸位置编号I定义为，如上所示的在比对中位于fHbpID I的氨基酸位置I的半胱氨酸所对应的位置，如果存在前导序列，位置编号I为前导序列之后的第一个残基。详细情况见图19。本申请提供了 fHbp、包含fHbp的组合物、以及所述fHbp和组合物的使用方法。所述fHbp对人fH的亲和性低于相应的对照fHbp (例如,天然存在的fHbp ;或其他对照fHbp)。因为高亲和性fHbp与fH形成复合物的概率较高，而fH的结合能够掩盖fHbp上的一个或多个表位，不被宿主免疫系统识别。因而，与fH复合和/或结合的fHbp可能无法像未复合的fHbp那样作为有效的免疫原。相反地，对fH具有相对较低亲和性的fHbp作为免疫原(例如，在疫苗组合物中)给药时，能够向被免疫宿主的免疫系统提呈某些表位，而这些表位是与fH具有高亲和性的fHbp所不能提呈的，因为与fH的结合可能会掩盖此类表位。所述fHbp对人fH的亲和性较低，可用于引发针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体，和/或提供针对脑膜炎奈瑟球菌的保护性免疫。所述fHbp是非天然存在的fHbp。非天然存在的fHbp在自然界中无法找到，其由人工制备，和/或经过人工特意修饰。可以通过化学合成或重组方法制备非天然存在的所述fHbp。如本申请所用，“低亲和性”、“较低亲和性”、或“fH低结合蛋白”是指，fHbp与人fH的结合亲和性与fHbp ID I同样低，或比fHbp ID I更低。因而，对象fHbp包括fHbp ID14和fHbp 15，因为fHbp ID 14和fHbp ID 15对人fH的亲和性低于fHbp ID I。低亲和性fHbp与人fH的结合亲和性不超过约100%、不超过约95%、不超过约90%、不超过约85%、不超过约80%、不超过约75%、不超过约70%、不超过约65%、不超过约60%、不超过约50%、不超过约45%、或低于高亲和性fHbp(例如，fHbp ID I)与人fH的亲和性。例如，对象fHbp与人fH的亲和性低于fHbp ID I与人fH亲和性的约50%。在某些实施例中，对象非天然存在的fHbp与人fH的结合亲和性为野生型fHbp与人fH的结合亲和性的85%或更低。例如，在某些实施例中，对象非天然存在的fHbp与人fH的结合亲和性为野生型fHbp与人的fH结合亲和性的约85%至约75%、约75%至约65%、约65%至约55%、约55%至约45%、约45%至约35%、约35%至约25%、约25%至约15%、约15%至约10%、约10%至约5%、约5%至约2%、约2%至约1%、或约1%至约O. 1%、或低于O. 1%。例如，在某些实施例中，对象非天然存在的fHbp与人fH的结合亲和性为fHbp ID I与人fH的结合亲和性的约85%至约75%、约75%至约65%、约65%至约55%、约55%至约45%、约45%至约35%、约35%至约25%、约25%至约15%、约15%至约10%、约10%至约5%、约5%至约2%、约2%至约1%、或约1%至约O. 1%、或低于O. 1%。例如，在某些实施例中，对象fHbp IDl的突变体(例如，fHbp ID I的R41S、R41A、R130A、H119A、E218A、或E239A突变体)与人fH的结合亲和性为fHbp ID I与人fH的结合亲和性的约85%至约75%、约75%至约65%、约65%至约55%、约55%至约45%、约45%至约35%、约35%至约25%、约25%至约15%、约15%至约10%、约10%至约5%、约5%至约2%、约2%至约1%、或约1%至约O. 1%、或低于O. 1%。又例如，在某些实施例中，对象fHbp ID 4、ID 9、或ID 74的突变体(例如，fHbpID4、ID9、或ID74的R41S突变体)与人fH的结合亲和性为fHbp ID4、ID9、或ID74与人fH的结合亲和性、或fHbp ID I与人fH的结合亲和性的约85%至约75%、约75%至约65%、约65%至约55%、约55%至约45%、约45%至约35%、约35%至约25%、约25%至约15%、约15%至约10%、约10%至约5%、约5%至约2%、约2%至约1%、或约1%至约O. 1%、或低于01%。又例如，在某些实施例中，对象fHbp ID 22的突变体(例如，fHbp ID 22的R80A、D211A、E218A、E248A、G236I、或 T220A/H222A 突变体)与人 fH 的结合亲和性为 fHbp ID 22与人fH的结合亲和性、或fHbp ID I与人fH的结合亲和性的约85%至约75%、约75%至约65%、约65%至约55%、约55%至约45%、约45%至约35%、约35%至约25%、约25%至约15%、约15%至约10%、约10%至约5%、约5%至约2%、约2%至约1%、或约1%至约O. 1%、或低于O. 1%。 又例如，在某些实施例中，对象fHbp ID 77的突变体(例如，fHbp ID 77的R41S/K113A、R41S/K119A、R41S/D121A、或 R41S/K113A/D121A 突变体)与人 fH 的结合亲和性为fHbp ID 77与人fH的结合亲和性、或fHbp ID I与人fH的结合亲和性的约85%至约75%、约75%至约65%、约65%至约55%、约55%至约45%、约45%至约35%、约35%至约25%、约25%至约15%、约15%至约10%、约10%至约5%、约5%至约2%、约2%至约1%、或约1%至约O. 1%、或低于O. 1%。又例如，在某些实施例中，对象fHbp ID 28的突变体(例如，fHbp ID 28的E218A突变体；fHbp ID 28的K199A突变体)与人fH的结合亲和性为fHbp ID 28与人fH的结合亲和性、或fHbp ID I与人fH的结合亲和性的约85%至约75%、约75%至约65%、约65%至约55%、约55%至约45%、约45%至约35%、约35%至约25%、约25%至约15%、约15%至约10%、约10%至约5%、约5%至约2%、约2%至约1%、或约1%至约O. 1%、或低于O. 1%。可以用术语解离常数(Kd)描述结合亲和性。低亲和性fHbp与人fH的解离常数(KD ；M)至少高于约80%、至少高于约100%、至少高于约120%、至少高于约140%、至少高于约160%、至少高于约200%、或高于高亲和性fHbp(例如，fHbp ID I)与人fH的KD。也可以将低亲和性fHbp的Kd描述为fHbp ID I的Kd的约2X(2倍)、约3X、约5X、约10X、约15X、约20X、高达约50X或更多倍。如本申请所用，“与人fH的亲和性低于相应的fHbp”用于描述结合亲和性低于相应的对照fHbp的fHbp。在很多情况下，用于比较对象fHbp结合亲和性的相应fHbp( “对照f’ Hbp")为fHbp ID I。能够作为典型对照的其他相应fHbp包括变体2fHbp(例如，fHbp ID 22或77)、变体 3(例如，fHbp ID 28) (Masignani et al(2003)J Exp Med 197:789-99 和 Pajon R etal (2010) Vaccine28:2122-9)、其它变体 IfHbp (例如，fHbp ID 4、9、或 94)、天然存在的嵌合、或人工制备的嵌合fHbp。天然存在的fHbp的某些例子和人工制备的嵌合体的氨基酸序列如下文所示，以及参见图45。
FHbp ID 22CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:2)FHbp ID 28CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:3)FHbp ID 77
CSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:4)FHbp ID 15CSSGGGGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAERTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IVGEHTSFGKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDEKHHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ(SEQ IDNO:5)FHbp ID 6CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVNGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEHSRKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPK⑶SATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGYGKIEHLKSPELNVDLAAAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVKTANGIRHIGLAAKQ(SEQ ID NO:6)FHbp ID 14CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSGKMVAKRRFKI⑶IAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQ ID NO :7)嵌合体Icssggggvaadigagladaltapldhkdkglqsltldqsv f kneklklaaqgaektygngdslntgkIkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqvykqshsaltafqteqiqdsehsgkmvakrqfrigdiaGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO:8)(Beernink et al. (2008)Infec.Immun. 76:2568-2575)。如图45所示，小写字母对应于衍生自fHbp ID I的氨基酸序列，而大写字母对应于衍生自fHbp ID 77的氨基酸。在fHbp ID I中对应于R41的位置为粗体的小写字母“r”。所述对应的fHbp可以是天然存在的和/或非天然存在的(例如，人工制备的嵌合)fHbp,对象fHbp由其衍生。天然存在的嵌合fHbp具有衍生自不同祖原(α或β)的可变片段。由于所述可变片段，分子架构显示为模块化，根据五个可变片段的不同组合，可以将fHbp变体再以模块群分类，每种变体均衍生自命名为α-或型的两个遗传谱系之一 (Pajon R et al. (2010)Vaccine28:2122-9 ；Beernink PT,GranoffDM(2009)Microbiologyl55:2873-83)。命名为I至VI的六个模块群可以涵盖全部已知fHbp变体的>95%(PajonR et al. (2010)Vaccine28:2122-9)。天然存在的 fHbp 模块群的架构参见图16。所述对应的fHbp可以在片段(例如，在模块架构中定义的可变片段)或全长成熟蛋白中与对象fHbp具有较高氨基酸序列同一性的fHbp(例如，具有至少约99%、至少约95%、至少约90%、至少约85%、至少约80%、或至少约75%的氨基酸序列同一性)。在对象fHbp的结合亲和性比较中用作对照的相应fHbp还可以包含，在一个或多个片段中，与对象fHbp的相应片段具有相同祖源(α或β)的fHbp。对象fHbp可以包含与对照fHbp具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约 90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且与对照fHbp的氨基酸序列有I个氨基酸(aa)至10个氨基酸的不同，例如，与对照fHbp的氨基酸序列有I个aa、2个aa、3个aa、4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、或10个aa的不同。因此，例如相对于对象fHbp衍生自的天然存在的和/或非天然存在的(例如，嵌合)fHbp,对象fHbp具有至多一个、至多两个、至多三个、至多四个、高达至多10个或更多的修饰(例如，取代、删除、或插入)。与未改变的fHbp相比，一个或多个氨基酸改变可以降低fHbp与人fH的亲和性。如上文所示，对象fHbp衍生自的fHbp包含天然存在的fHbp和非天然存在的fHbp。非天然存在的fHbp可以包含人工制备的嵌合体，如本领域公知的嵌合体和在PCT申请号WO 2009/114485中描述的嵌合体，其公开的内容通过参考并入本申请。因此，在某些实施例中，对象fHbp包含相对于对照fHbp (例如，其中对照fHbp是天然存在的fHbp(例如，fHbp ID1，或人工制备的嵌合体))的单氨基酸取代。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于天然存在的fHbp (例如，fHbp ID 6、fHbp ID 14, fHbp ID 15、fHbp ID 22、fHbp ID 28、fHbp ID 77、或其他天然存在的fHbp)的单氨基酸取代(即，仅有一个氨基酸取代)。fHbp ID UfHbp ID 15,fHbp ID 22,fHbp ID 28、和 fHbp ID 77 的氨基酸序列如图19和图45所示；fHbp ID 6和fHbp ID 14的氨基酸序列如上文所述。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于fHbp ID I的单氨基酸取代(即，仅有一个氨基酸取代)。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于对照fHbp的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸取代。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于fHbp IDl的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸取代。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于天然存在的 fHbp(例如，fHbp ID 6、fHbp ID 14、fHbp ID 15, fHbp ID 28，如图 19所示，或其他天然存在的fHbp)的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸取代。在某些实施例中，对象fHbp包含相对于fHbp ID UfHbp ID 15、fHbp ID 22、fHbpID 28 JPfHbp ID 77中的一个氨基酸序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸取代。通过比较fH低结合蛋白的氨基酸序列(例如，fHbp ID 14和/或fHbp ID 15)，和对人fH的亲和性与，例如，fHbp ID I相当的fHbp的氨基酸序列，可以确定引入氨基酸残基改变的位置。在本申请中，与人fH的亲和性和fHbp ID I相当或比fHbp ID I更高的fHbp，被称为“fH高结合蛋白”。fH高结合蛋白的某些例子包括fHbp ID l、fHbp ID 6、和fHbp ID28。可以在序列比对中比较共享一个或多个祖源片段的低fH结合蛋白和fH高结合蛋白。图19是序列比对的例子，所述序列比对用于确定天然存在的fHbp可以进行哪些氨基酸改变，从而获得对象fHbp。对象fHbp变体可以衍生自变体IfHbp、变体2fHbp、或变体3fHbp(例如，与之相比，可以包含一个或多个氨基酸取代)。对象f Hbp变体可以衍生自模块群I f Hbp、模块群11fHbp、模块群III fHbp、模块群IVfHbp、模块群V fHbp、模块群VI fHbp、模块群VII fHbp、模块群VIII fHbp、模块群IX fHbp、或模块群X fHbp (例如，与之相比，可以包含一个或多个氨基酸取代)。与对照fHbp相比，可能降低fHbp与fH的亲和性的氨基酸取代包括，在fHbp氨基酸中与fH结合的接触残基的氨基酸取代；在fHbp氨基酸中表面暴露的氨基酸取代；在fHbp氨基酸中位于氨基末端和羧基末端结构域界面处的氨基酸取代；以及在fHbp氨基酸 中与fH结合残基邻近的氨基酸取代，其中与fH结合氨基酸“邻近的”氨基酸是指，与fH结合氨基酸的氨基末端或羧基末端距离一至十个残基的氨基酸。在某些实施例中，使得与fH的亲和性降低的氨基酸取代不是fH接触残基。某些接触残基见图19中的加粗部分。当fHbp包含相对于天然存在的或相对于fHbp ID I的氨基酸取代时，氨基酸取代可以相对于所述氨基酸取代保守。例如，如果R41被修饰为S，产生R41S取代，并且特别是R41S取代使得其对人fH的亲和性降低，则本申请的公开内容还包括相对于S的保守氨基酸取代，由此也包括R41T的氨基酸取代。本申请提供了相对于fHbp ID I在位置41具有氨基酸取代的非天然存在的fHbp，其中氨基酸取代的结构干扰fHbp与人H因子之间的相互作用，但前提是fHbp突变体保留免疫原性。适于相对于fHbp IDl在位置41进行取代的氨基酸包括，疏水性残基(例如，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro);小的极性残基(例如，Ser、CyS、Thr、Met、Asn、Gln);小的带电残基(例如，Asp、Glu);以及大的疏水性残基(例如，Phe，Trp)。预计某些取代不会明显干扰fHbp与人H因子之间的相互作用，因此应避免使用，这样的取代的例子包括，大的带电残基(例如，Lys)。在某些实施例中，一个或多个下述残基的氨基酸取代被特别地排除R41、Q38、Q87、Q113、K113、K119、D121、G121、Q126、Q128、R130、D201、E202、E218、A235、E239JP K241。在某些实施例中，例如，当对象fHbp包含相对于对照fHbp的单氨基酸取代时(例如，当对照fHbp是天然存在的fHbp或fHbp ID I时)，单氨基酸取代可以位于位置E218或E239。对象fHbp中的氨基酸改变包括，图19中用阴影标出的残基和/或在框中的残基，并在下文列出。在序列分析的一个例子中，比较了低结合蛋白fHbp ID 15的片段A(Va;S基8-73)与fH高结合蛋白fHbp ID 28中具有相同祖源序列的\。这样，除位置41和60以夕卜，fHbp ID 15和fHbp ID 28的Va片段的氨基酸序列相同。如图19所示，fHbp 15的Va具有S41和R60 ；fHbp ID 28的Va具有P41和K60。在这项分析的基础上，将对应于fHbpID 15的位置41和60的氨基酸残基位置作为通过引入改变以获得对象fHbp的候选位置。换言之，在对应于fHbp 15位置41和60的残基位置分别不具有S和R的对照fHbp可以突变为在对应于fHbp 15的位置41和60具有S和/或R。包含一个或多个氨基酸取代的对象fHbp与人fH的亲和性可能低于未取代的fHbp (例如，S41P、S41A、R41P、或R41A)。对象fHbp中包括了此类fHbp，其在所需对象中用作引发杀菌性抗体的免疫原。在下文的例子中讨论可以引入氨基酸改变的其它候选残基位置。例如，本发明的fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbpID I 的 41、60、114、113、117、119、121、128、130、147、148、149、178、195、218、 239、241、或247 (例如，基于成熟fHbp的编号)的氨基酸残基。本发明的fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID I的41、60、80、113、114、117、119、121、128、130、147、148、149、178、195、199、211、220、222、236、241、247、或 248 的氨基酸残基，基于成熟fHbp的编号。本发明的fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自 fHbp ID I 的 87、109、115、118、126、138、197、201、202、203、209、217、225、235、或245的氨基酸残基，基于成熟fHbp的编号。当对应的fHbp为变体2或变体3fHbp (或分别对应的模块群)时，可以在位置113、119、和/或121，或其任意组合处引入修饰。例如，变体2fHbp (例如，fHbp ID 77)可以在位置113、119、和/或121的一个或多个位置处含有取代，以及在位置41含有丝氨酸取代，或在位置41含有上文所述的其他 适宜取代。当对应的fHbp为ID 22变体时，可以在位置80、211、218、220、222、236、或248、 或其任意组合处引入修饰。本发明的变体H因子结合蛋白(fHbp)还可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID I的60、114、117、147、148、149、178、195、或247的氨基酸残基。与上文中讨论的fHbp ID 15的Va相似，通过对fH低结合蛋白与fH高结合蛋白之间进行序列比对研究，可以确定其他位置。本发明的变体fHbp可以是fHbp ID I的变体，并且可以包括一个、两个、三个、或四个下述取代R41S、R41A、R130A、H119A、E218A、和E239A。如上文所讨论的，本发明的变体fHbp可以包括单氨基酸取代。本发明的变体fHbp还可以包括双氨基酸取代。例如，本发明的变体fHbp可以包括R41S、R41A、R130A、H119A、E218A、和E239A中的两个取代。本发明的变体fHbp还可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID I的80、211、218、220、222、236、和248的氨基酸残基。fHbp变体中的对应位置易于确定，例如通过图19、34、和35中的比对确定。作为非限制性例子，本发明的变体fHbp可以是fHbp ID 22的变体，并且可以包括一个、两个、三个、或四个下述取代R80A、D21 ΙΑ、E218A、T220A、H222A、G236I、和E248A。如上文所讨论的，本发明公开的变体fHbp可以包括单氨基酸取代。本发明的变体fHbp还可以包括双氨基酸取代。例如，本发明的变体fHbp可以包括在R80、D211、E218、T220、H222、G236、和E248中的两个位置的取代。作为一个非限制性例子，变体fHbp可以包括T220A/H222A双取代。本发明的变体fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 77的41、113、119、121的氨基酸残基。作为非限制性例子，本发明的变体fHbp可以是fHbp ID 77的变体，并且可以包括一个、两个、三个、或四个下述取代R41S、K113A、K119A、D121A。如上文所讨论的，本发明的变体fHbp可以包括单氨基酸取代。本发明的变体fHbp还可以包括双氨基酸取代。例如，本发明的变体fHbp可以包括R41S、Kl 13A、K119A、和D121A中的两个的取代。作为一个非限制性例子，变体fHbp可以包括R41S/K113A双取代、R41S/K119A双取代、或R41S/D121A双取代。本发明的变体fHbp可以在一个或多个位置具有氨基酸取代，所述位置对应于一个或多个选自fHbp ID 28的113、121、199、和218的氨基酸残基。当本发明的fHbp的位置41被丝氨酸取代时，其对应的fHbp属于图16所示的模块群之一。例如，对应的fHbp可能来自于模块群I，所述模块群I的所有可变片段均为α谱系。此类对象fHbp的例子包括fHbp ID 1、4、9、和94的R41S突变体。在某些实施例中，对象fHbp不包括相对其对应的fHbp，与人fH的亲和性没有降低的突变体。例如，对象fHbp不包括fHbp ID 19和22的R41S突变体。嵌合fHbp如上文所示，天然存在的fHbp或人工制备的fHbp (例如，人工制备的嵌合fHbp)可以引入一个或多个修饰。修饰可以包括一个片段或一个结构域中的修饰，而其他片段和 /或结构域可以衍生自任何fHbp (例如，不同变体群的天然存在的fHbp)。在已描述具有模块架构\、\、V。、VD、和Ve片段的fHbp中，可以将修饰引入α谱系的Va中(例如，在fHbp ID I的VA中引入R41S)，而fHbp的其他片段(例如，VB、Vc, VD、和乂^均可以独立地衍生自任意谱系、任意变体群、或任意fHbp ID。在另一个例子中，对象€册？的￥4、^、和￥￡片段可以衍生自α谱系(谱系I)，而Vb和Vd可以衍生自β谱系。当修饰为使用丝氨酸取代位置41的精氨酸时，所述修饰被引入到α祖源的VA(VAa)处。所述Va片段是指起始于残基位置7并终止于残基位置73的连续氨基酸序列，其位置编号对应于对照序列fHbp ID I的位置编号。本发明的fHbp可以在VAci片段中包含R41S突变，所述Vaci片段包含与下述序列具有至少约90%、至少约92%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约98%、至少约99%、直至100%同一性的氨基酸序列VAADIGAGLA DAL1APLDHK DKSLQSLTLD QSV 置 KNEKLK LAAQGAEK1YGNGDSLNTGKLKNDKV(SEQ ID N0:17^VAa序列列于此处，R41S突变以粗体表示。因此，包含R41S修饰的fHbp在Va a片段中具有R4IS突变，并且可以具有VB、Ve、VD、和Ve片段，所述片段分别独立地衍生自任意其他fHbp (例如，不同的谱系、不同的变体群、或fHbp的突变体)。还可以将本发明的嵌合fHbp描述为在fHbp的N-末端结构域(fHbpN)具有修饰，而C-末端结构域(fHbpC)可以衍生自不同的fHbp (例如，不同的变体群或不同的谱系)。“fHbpN”是指起始于约残基位置8并终止于约残基位置136的连续氨基酸序列。“fHbpC”是指起始于约残基位置141并终止于约残基位置255的连续氨基酸序列。fHbpN和fHbpC之间的插入序列是两个结构域之间的连接子。例如,对象fHbp的fHbpN可以在衍生自fHbpID I的序列中包含R41S突变，而fHbpC衍生自变体2或变体3fHbp (例如，fHbp ID 77)。对应的嵌合fHbp可以是任意已知的人工制备的嵌合体，如Beernink etal. (2008) Infec. Immun. 76:2568-2575 和 WO 2009/114485 中所描述的那些嵌合体，其公开的内容通过引用并入本申请。包含修饰的嵌合体相对于嵌合fHbp对人fH的亲和性降低，但仍保留了对引发杀菌性应答具有重要作用的表位，例如在对应的嵌合fHbp中发现的表位。可以保留在修饰的嵌合体中的fHbp表位包括在对应嵌合fHbp中发现的表位，如在WO2009/114485中所描述的表位，其公开的内容通过引用并入本申请。例如，修饰的嵌合fHbp可以包含对引发杀菌性应答具有重要作用的表位，所述杀菌性应答针对含有变体IfHbp的菌株(例如，在N-末端结构域的表位，如mAb JAR4和/或JAR 5定义的表位)和/或含有变体2或3fHbp的菌株(例如，mAb JAR 10,JAR IUJAR 13、和/或JAR 36定义的表位)。例如，如图19和图45所示，R41S突变是可以弓I入嵌合fHbp的修饰，以降低与人fH的结合，但仍保留JAR 4和JAR 5表位。对象fHbp的一个特征为，当给予宿主(例如，哺乳动物如小鼠或人)时，对象fHbp可以引发与fHbp ID I、或其他相应的对照(例如，fHbp ID 4、9、22、28、74、或77)所引发的杀菌性应答水平相当或略高的杀菌性应答。确 定杀菌性应答水平的方法是本领域所公知的，参见下文实施例部分的描述。例如，经对象fHbp免疫小鼠的杀菌性滴度几何平均数为经fHbp ID I免疫小鼠的杀菌性滴度几何平均数的至少约70%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约100%、至少约110%、至少约120%、至少约150%、至少约175%、至少约200%、或200%以上。在某些情况下，经对象fHbp免疫的小鼠的杀菌性滴度几何平均数比经fHbp ID I免疫对照小鼠杀菌性滴度几何平均数高至少2倍、至少2. 5倍、至少5倍、至少10倍、或10倍以上。对象fHbp可以排除那些引发的杀菌性应答显著低于fHbp ID I的fHbp。对象fHbp可以排除在残基位置218和239均有突变(例如，E218A/E239A双突变体)的fHbp。在某些实施例中，对象fHbp仅包含非天然存在的fHbp ;因此，在某些实施例中，对象fHbp排除天然存在的fHbp。在很多情况下，对象fHbp变体保持并存在与杀菌性抗体结合的构型表位，所述抗体对一种或多种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌活性。因此，此类fHbp突变体可以保持在天然存在的fHbp中发现的表位，并且与天然存在的fHbp对fH的结合亲和性相比，此类fHbp突变体与fH的结合降低。对fHbp的构型具有最小影响或无影响，从而使得突变疫苗能够引发杀菌性抗体的变体被认为是良好的疫苗候选物。可以通过多种途径确定变体是否对fHbp的构型有影响，包括列于表9中的抗体结合。本发明的fHbp可能具有其他的特征，详见下文所述。偶联物本发明的对象fHbp可以在多肽的N-和/或C-末端含有一个或多个附加元件，如多肽(例如，具有与对象fHbp异源的氨基酸序列)和/或载体分子。可以融合附加的异源氨基酸序列，例如，作为在细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)中的表达结果以提供N-末端甲硫氨酸或其衍生物(例如，焦谷氨酸盐)，和/或提供在其N-末端或C-末端具有融合伴侣的嵌合多肽。目标融合伴侣包括，例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His6-标签等，以及来自其他蛋白，特别是脂蛋白的前导肽。融合伴侣可以提供附加特征，例如便于对象fHbp的分离、纯化、检测、发挥免疫原性。可以连接至对象fHbp的其他元件包括载体分子(例如，载体蛋白，例如，钥孔戚血蓝蛋白(KLH))。其他元件可以通过连接子连接至肽，例如，柔性连接子。载体包含免疫调节齐U，一种直接或间接修饰免疫应答的分子。特定的一类免疫调节剂包括刺激或辅助刺激免疫应答的免疫调节剂。例子包括抗原和抗原载体，例如毒素或其衍生物，包括破伤风毒素。还包括其他载体，其可便于给药和/或在针对脑膜炎奈瑟球菌免疫或治疗的对象中增加免疫原性。载体分子也可以促进向目标细胞或组织的递送。附加部分也可能有助于免疫原性或与疫苗中的组分形成复合物。载体分子可能起支架蛋白的作用，以便于展示膜表面抗原(例如，囊泡疫苗)。在一个例子中，对象fHbp在其N-和/或C-末端修饰以引入脂肪酸(例如，脂肪族的羧酸基团)。脂肪酸可以通过柔性连接子与fHbp共价连接。可以用于修饰对象fHbp末端(例如，N-末端，例如在N末端)的脂肪酸的例子为月桂酸。当共价连接至其他分子时，月桂酸是指月桂酰基团(例如，月桂酰硫酸酯)。月桂酸含有十二个碳原子，有十个亚甲基，分子式为CH3-(CH2) 10-C00Ho可以连接至对象肽的其他脂肪酸包括辛酸(IOC)、肉豆蘧酸(14C)、和掠榈酸(16C)。详细情况,参见Westerink MA et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92:4021-4025。也可以预期，本申请还包括能够将对象fHbp锚定至细菌外膜的任意疏水性部分，其可用于偶联至本发明的fHbp的N-和/或C-末端(例如，在N-末端)，其中所述疏水性部分可以通过连接子，例如如本申请所述的柔性连接子，操作性地偶联至肽。例如，疏水性五肽FLLAV (SEQ ID NO: 18)，如 Lowell GH et al. (1988) J. Exp. Med. 167:658-6 3所述。如上文所示，脂肪酸以及上文所述的其他附加元件连接至fHbp的一种方法为通过连接子(例如，月桂酰-Gly-Gly)。适用于修饰本发明的fHbp的连接子包括“柔性连接子”。可以容易地选择适宜的连接子，连接子可以是任意适宜的不同长度，例如I个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，以及可以是I个、2个、3个、4个、5个、6个、或7个氨基酸。柔性连接子的例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO: 19)和 GGGSn(SEQ ID NO: 20)，其中 η 是至少为 I 的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、以及本领域公知的其他柔性连接子。优选甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物，因为这些氨基酸均是相对未结构化的，因此可以作为组分之间的中性连接。特别优选甘氨酸聚合物，因为与平坦的丙氨酸相比，甘氨酸能够进入具有显著更大的Ramachandran(或phi-psi)空间，并且与带有更长侧链的残基相比具有更低的限制(参见 Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992))。不例性的柔性连接子包括，但不限于，GGSG(SEQ ID NO: 21)、GGSGG(SEQ ID NO: 22)、GSGSG(SEQ ID NO: 23)、GSGGG (SEQ ID NO: 24)、GGGSG (SEQ ID NO: 25) ,GSSSG (SEQ ID NO: 26)，等等。普通技术人员将会意识到，偶联至上文所述的任意元件的fHbp的设计，可以包括全部或部分柔性的连接子，从而连接子可以包括柔性连接子以及一个或多个具有较低柔性结构的部分。天然fHbp通常含有N-末端半胱氨酸，其上可以共价附着脂质基团。该半胱氨酸残基在天然存在的蛋白中通常是脂质化的，其在本发明的对象fHbp中可以是脂质化的。因此，在本申请所述的氨基酸序列中，涉及在该特定位置的“半胱氨酸”或“C”包括指未经修饰的半胱氨酸和被脂质化的半胱氨酸(例如，由于翻译后修饰)。因此，对象fHbp可以是脂质化或非脂质化的。在体外(参见，例如 Andersson et al. (2001) J. Immunological Methods255:135-48)或体内生产脂质化蛋白的方法是本领域公知的。例如，通过去垢剂提取的方法，已经从大肠杆菌蛋白的膜成分中纯化得到脂质化的fHbp (Fletcher et al. (2004)Infection and Immunity 72:2088-100),该方法可能适于生产脂质化的fHbp。可以优选脂质化的蛋白，因为其与可溶性蛋白相比具有更高的免疫原性(参见，例如Fletcher etal. (2004)Infection and Immunity 72:2088-100)。
可以理解的是，可以修饰编码异源性fHbp的核苷酸序列，以优化使用的密码子，从而促进在目标宿主细胞(例如，大肠杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、人(基于DNA的疫苗的情况)等)中的表达。生产优化的密码子序列的方法是本领域公知的。编码fHbp的核酸本申请提供了一种编码对象fHbp的核酸。在某些实施例中，对象核酸存在于重组表达构建体中。还提供了包含对象核酸的遗传修饰的宿主细胞。本发明的fHbp多肽和编码核酸可以衍生自任意适宜的脑膜炎奈瑟球菌菌株。正如本领域所公知的，根据与不同的表面抗原发生相互作用的多克隆(Frasch，C. E. andChapman, 1973，J. Infect. Dis. 127:149-154)或单克隆抗体的反应，将脑膜炎奈瑟球菌菌株分为血清群(荚膜群)、血清型(PorB表型)和亚型(PorA表型)。通常根据荚膜多糖中免疫学可检测的差异进行荚膜分群，但该检测方法正被编码特异性酶基因的PCR取代，所述基因负责结构不同的荚膜多糖的生物合成。已知约有12种荚膜群(包括A、B、C、X、Y、Z、29-E、和W-135)。荚膜群A、B、C、Y和W-135的菌株可导致几乎所有的脑膜炎球菌疾 病。习惯上可根据单克隆抗体确定的称为通道蛋白B(PorB)的外膜蛋白的抗原性差异区分血清型。目前已知的抗体可以确定约21种血清型(Sacchi et al. , 1998, Clin. Diag. Lab.Immunol. 5:348)。已将称为通道蛋白A(PorA)的外膜蛋白通过抗体确定其抗原性差异，由此区分血清亚型。血清分型和血清亚型分型正被PCR和/或DNA测序所替代，其分别鉴别编码与mAb反应性有关的PorB和PorA可变区的基因(例如，Sacchi, Lemos et al.,同上;Urwin et al. , 1998, Epidem. and Infect. 120:257)。尽管可以使用脑膜炎奈瑟球菌菌株的任意荚膜群，但是特别优选将荚膜群B型的脑膜炎奈瑟球菌菌株作为编码fHbp的核酸来源，及其结构域的衍生来源。编码fHbp多肽的核酸可用于构建本申请所包括的对象fHbp，这些核酸为本领域内公知。不同 fHbp 及其序列可以在 neisseria, org 和 pubmlst. org/neisseria/fHbp网站获得。fHbp多肽的举例也可以参见，例如，US专利申请号61/174，424、PCT申请号PCT/US09/36577、WO 2004/048404 ；Masignani et al. (2003)J Exp Med 197:789-799 ；Fletcher et al. (2004)InfectImmun 72:2088-2100 ；ffelsch et al. J Immunol2004172:5606-5615 ;和冊99/57280。fHbp变体和亚变体的核酸(及氨基酸序列)也可见于GenBank，其登记号为NC_003112，GeneID:904318 (NCBI Ref. NP_274866)，来自脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58的fHbp ID I ;AY548371 (AAT01290. I)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株CU385)；AY548370 (AAT01289. I)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株 H44/76) ；AY548377 (AAS56920. I)fHbp ID 4，来自脑膜炎奈瑟球菌菌株M4105;AY548376(AAS56919. 1)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株M1390) ；AY548375 (AAS56918. I)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254)；AY548374(AAS56917. I)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株 M6190) ；AY548373 (AAS56916. I)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株4243) JPAY548372(AAS56915. I)(来自脑膜炎奈瑟球菌菌株BZ83)。为了鉴定本发明的对象fHbp中预期使用的相关氨基酸序列，应注意未成熟的fHbp包括约19个残基的前导序列。此外，当提供了一个氨基酸序列时，本领域的普通技术人员很容易想到能够编码并表达具有此氨基酸序列的多肽的核酸序列。除了本申请提供的特定氨基酸序列和核酸序列以外，本发明还涵盖了与这些多肽和核酸序列例子具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同一性的多肽和核酸序列。在两个或多个多核苷酸序列，或两个或多个氨基酸序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分率是指在指定区域范围内，例如，Ve或对照氨基酸或核苷酸序列中的长度至少为约40、45、50、55、60、65或以上，直至全长的氨基酸或核苷酸区域(例如，全长fHbp)，当比较或以最大对应情况进行比对时，两种或多种序列或子序列相同，或具有特定百分率的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，在特定区域内至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%相同)。本发明特别包括天然以多种形态存在的和合成产生的氨基酸序列及其编码核酸。在进行序列比较时，通常将一个序列作为对照序列(例如，天然存在的fHbp多肽序列或其片段)，将待测序列与之比较。当使用序列比较算法时，将待测和对照序列输入计算机程序，如有必要，设定序列坐标，并设定序列算法程序的参数。随后，序列比较算法将根据设定的程序参数计算待测序列与对照序列的序列同一性百分率。适于确定序列同一性百分率的算法示例为BLAST和BLAST 2. O算法，Altschul et al. (1990)J. Mol. Biol. 215:403-410 和 Altschul et al. (1977)NucleicAcids Res. 25:3389-3402分别对其有所描述。公众可以从美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)获得进行BLAST分析的软件。进一步的示例性算法包括 Clustalff (Higgins D., et al. (1994)Nucleic Acids Res 22:4673-4680),可以从www. ebi.ac. uk/Tools/clustalw/index, html 获得。某些残基不同的位置，其区别在于保守性氨基酸。保守性氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有酸性侧链的一组氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸；具有碱基侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。两个核酸之间的序列同一性也可以利用两个分子之间在严格条件下的杂交情况进行描述。杂交条件选自本领域的下述标准方法(参见，例如，Sambrook, et al. , MolecularCloning:A Laboratory Manual,第 2版，(1989) Cold Spring Harbor, N. Y.) 严格杂交条件的一个例子为，在50° C或以上以及O. I XSSC (15mM氯化钠/I. 5mM柠檬酸钠)条件下杂交。严格杂交条件的另一个例子为，42° C在下述溶液中孵育过夜50%甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7. 6)、5XDenhardt氏溶液、10%葡聚糖硫酸盐以及20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA，随后在约65° C条件下使用O. IXSSC洗涤滤器。严格杂交条件为严格程度至少与上述代表性条件相同的杂交条件，其中当严格程度至少为上述特定严格条件的约80%，典型的至少为90%时，认为其至少为严格条件。牛产方法可以采用任意适宜的方法生产本发明的fHbp，包括重组和非重组方法(例如，化学合成)。当采用重组技术生产对象fHbp时，该方法可以涉及任何适宜的构建体和任何适宜的宿主细胞，可以是原核细胞或真核细胞，常用的是细菌或酵母宿主细胞，更常用的是细菌细胞。将遗传物质引入宿主细胞的方法包括，例如，转化、电穿孔、偶联和磷酸钙法，等等。可以选择转移的方法，使得拟导入的fHbp编码核酸稳定表达。所述fHbp编码核酸可以作为可遗传的游离体元件(例如，质粒)提供或被整合至基因组。在组合物中，用于转移fHbp编码核酸的适宜载体可以发生改变。整合载体可以有条件地复制，或是自杀性质粒、噬菌体，等等。构建体可以包括多种元件，包括例如，启动子、选择性遗传标记(例如，对抗生素(例如卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素)具有抗性的基因)、复制起点(启动宿主细胞中的复制，例如，细菌宿主细胞)，等等。载体的选择依赖于多种因素，例如期望用于繁殖的细胞类型和繁殖目的。某些载体可用于扩增和制备大量的目标DNA序列。其他载体适用于在培养细胞中表达。还有其他载体适用于在整体动物细胞中转移和表达。选择适宜的载体属于本领域公知的技术。很多此类载体可以购买获得。在一个例子中，所述载体是基于附加型质粒的表达载体，所述附加型质粒含有可选择药物抗性标记和元件，并可以在不同宿主细胞中提供自我复制(例如大肠杆菌和脑膜炎奈瑟球菌)。这种“穿梭载体”的一个例子是质粒pFPIO (Pagotto et al. (2000)Gene244:13-19)。可通过，例如，将目标多核苷酸插入到构建体主链中，一般通过采用DNA连接酶连接到载体中切割的限制性酶位点，来制备构建体。或者，可通过同源重组或位点特异性重组插入目标核苷酸序列。通常通过将同源区域与载体在目标核苷酸序列的侧翼连接来完成同源重组，而通过采用促进位点特异性重组的序列(例如,cre_lox、att位点等)来完成位点 特异性重组。可通过，例如，以下方法加入含有此序列的核酸连接寡核苷酸，或使用引物的聚合酶链反应，所述引物包含同源区域和目标核苷酸序列的一部分。载体可在宿主细胞中保持处于染色体外，或可整合到宿主细胞基因组中。本领域技术人员公知的大量出版物详细描述了载体，包括，例如，Short Protocols in MolecularBiology, (1999) F. Ausubel, et al.，eds.，Wiley&Sons。载体可表达编码对象 fHbp 的核酸，可扩增所述对象核酸，或二者皆可。 可采用的示例性载体包括，但不限于，衍生自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的载体。例如，可采用质粒载体，如PBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp系列载体。PET21也是可采用的表达载体。噬菌体载体可包括AgtlO、AgtlU λ gtl8_23、λ ZAP/R和EMBL系列噬菌体载体。可利用的其他载体包括，但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、C0S202、C0S203、pWE15、pffE16 和卡隆粒 9 系列载体。对于对象fHbp的表达，可采用表达盒。因此，本发明提供包含对象核酸的重组表达载体。所述表达载体提供转录和翻译调节序列，并可提供诱导型或组成型表达，其中在转录起始区、以及转录和翻译终止区的转录控制下操作性连接编码区。这些控制区可以是对象fHbp衍生自的fHbp所先天具有的，或衍生自外部来源。通常，所述转录和翻译调节序列包括，但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。启动子可以是组成型或诱导型，并且可以是强组成型启动子(例如，T7，等等)。表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以便插入编码目标蛋白质的核酸序列。在表达宿主中可存在可操作的选择性标记，以促进对包含所述载体的细胞进行选择。此外，所述表达构建体可包含其他元件。例如，所述表达载体可具有一个或两个复制系统，从而使其能保持于用于表达的生物中，例如哺乳动物或昆虫细胞，和用于克隆和扩增的原核宿主中。此外，所述表达构建体可包含选择性标记基因，以允许对转化的宿主细胞进行选择。选择基因是本领域的公知常识，随采用的宿主细胞而变化。应注意，本发明的fHbp可包含其他元件，如可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记、生物素标记和免疫可检测标记(例如，HA标签、多组氨酸标签)，等等。可提供fHbp的其他元件，以便于通过多种方法(例如，亲和捕获等)进行分离(例如，生物素标签、免疫可检测标签)。对象fHbp可以通过共价或非共价连接可选地固定于支持物。可根据本领域已知的方法完成fHbp的分离和纯化。例如，可以通过免疫亲和纯化从经遗传修饰能够表达fHbp的细胞裂解产物或合成反应混合物中分离fHbp，免疫亲和纯化通常涉及使所述样品接触抗fHbp抗体(例如,抗fHbp mAb,如JAR 5MAb或本领域公知的其他适宜的JAR MAb)，洗涤以除去非特异性结合的材料，并洗脱特异性结合的fHbp。可通过透析和其他通常用于蛋白质纯化的方法来进一步纯化分离的fHbp。在一个例子中，可以采用金属螯合色谱法分离fHbp。宿丰细朐多种适宜的宿主细胞均可用于生产fHbp。一般情况下，根据常规技术，本发明所述的fHbp可以在原核细胞或真核细胞中表达，常用的是细菌，更常用的是大肠杆菌或奈瑟菌属(例如，脑膜炎奈瑟球菌)。因此，本发明进一步提供了经过基因修饰的宿主细胞，其包 含编码对象fHbp的核酸。用于生产(包括大规模生产)对象fHbp的宿主细胞可以选自多种可用的宿主细胞中的任何一种。用于表达的宿主细胞例子包括原核或真核单细胞生物的细胞，例如细菌(例如，大肠杆菌菌株)、酵母菌(例如，酿酒酵母、毕赤酵母，等等)，以及可以包括来源于更高等的生物，例如昆虫、脊椎动物，特别是哺乳动物(例如，CH0、HEK，等等)的宿主细胞。通常，在对象fHbp的生产中，特别优选细菌宿主细胞和酵母菌。对象fHbp可以被制成充分纯化或充分分离的形式(B卩，从其他奈瑟菌属或宿主细胞多肽中充分分离)或充分分离的形式。对象fHbp可以存在于组合物中，在组合物中与其他可能存在的成分相比(例如，其他多肽或其他宿主细胞成分)，所述多肽是富集的。可以提供纯化的对象fHbp，使得多肽存在于组合物中，而所述组合物基本上不含有其他表达的多肽，例如，所述组合物的90%以下、通常为60%以下和更通常为50%以下由其他表达的多肽组成。用于牛产囊泡的宿主细胞当在膜囊泡中提供对象fHbp时(将在下文中详细讨论)，将对奈瑟菌属宿主细胞进行遗传修饰以表达对象fHbp。在本发明公开的方法中，可以使用多种奈瑟菌属菌株中的任何一种，其能够被修饰以产生对象fHbp，以及任选地，能够产生或能够经修饰后产生其他目标抗原，如PorA。对奈瑟菌属菌株进行遗传修饰以及表达目标多肽的方法和载体均为本领域的公知常识。载体和方法的例子，请参见WO 02/09746和O’Dwyer et al. (2004) InfectImmun72:6511-80。特别优选强启动子,特别是强组成型启动子。启动子的例子包括porA、porB、lbpB、tbpB、pllO、hpuAB、lgtF、opa、pllO、1st、hpuAB 和 rmp 的启动子。为用于膜囊泡生产，优选致病性奈瑟菌属菌株或衍生自奈瑟菌属的菌株，特别是对人具有致病性的菌株或衍生自对人具有致病性或共生性的菌株。奈瑟菌属的例子包括，脑膜炎奈瑟球菌、金黄奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、乳酸奈瑟球菌、多糖奈瑟球菌、灰色奈瑟球菌、粘膜奈瑟球菌、浅黄奈瑟球菌、干燥奈瑟球菌、长形奈瑟球菌，等等。特别优选用脑膜炎奈瑟球菌菌株进行遗传修饰，以表达对象fHbp和生产囊泡。可以根据多种不同的目标特征选择用于囊泡生产的菌株。例如，可以根据以下方面选择菌株目标PorA的类型(“血清亚型”，如上文所述)、荚膜群、血清型，等等；荚膜多糖的产生减少，等等。例如，生产菌株可以生产任何目标PorA多肽，并且可以表达一种或多种PorA多肽(天然的或经遗传工程改造的)。这样的菌株的例子包括，生产能赋予血清亚型 Pl. 7，16 ；P1. 19，15 ；P1. 7，I ；P1. 5，2 ；P1. 22a, 14 ；P1. 14 ；P1. 5，10 ；P1. 7，4 ；PI. 12，13的PorA多肽的菌株；以及生产这种PorA多肽变体的菌株，所述变体可以保留或不保留与在血清亚型分型中使用的常规血清学试剂的反应性。还优选的是，根据PorA可变区(VR)而鉴别的 PorA 多肽(参见，例如，Russell et al. (2004)Emerging InfectDislO:674-678 ；Sacchi CT et al. (1998)Clin Diagn Lab Tmmunol 5:845-55 ;Sacchi etal (2000) J. InfectDisl82:1169-1176)。已鉴定出了大量不同的VR类型，这些类型可分类为VRl和VR2家族“原型”。描述此术语及其与以前分型方案之间关系的网络访问数据库见 neisseria, org/nm/typing/pora。某些 VRl 和 VR2 型 PorA 的比对，请参见 Russell etal. (2004)Emerging Infect DislO:674-678。可选地或另外，生产菌株可以是荚膜缺陷型菌株。荚膜缺陷型菌株可以提供囊泡疫苗，可以在疫苗给药对象中降低引发显著自身抗体应答的风险(例如，由于产生了能与 宿主细胞表面的唾液酸交叉反应的抗体)。本申请所用的“荚膜缺陷”或“缺乏荚膜多糖”表示细菌表面的荚膜多糖水平低于天然存在的菌株，或者，当菌株经遗传修饰时，细菌表面的荚膜多糖水平低于衍生所述荚膜缺陷型菌株的亲代菌株。荚膜缺陷型菌株包括，表面荚膜多糖产生降低至少10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%或更多的菌株，也包括在细菌表面检测不到荚膜多糖的菌株(例如，通过使用抗荚膜多糖抗体的全细胞酶联免疫吸附试验(ELISA))。荚膜缺陷型菌株包括因天然存在的或重组产生的遗传修饰而缺乏荚膜的菌株。天然存在的荚膜缺陷型菌株(参见，例如，Dolan-Livengood et al. (2003)J. Infect. Dis. 187:1616-28)，以及鉴定和/或产生荚膜缺陷型菌株的方法(参见，例如，Fisseha et al. (2005)Infect. Tmmun. 73:4070-4080 ；Stephens et al. (1991)InfectImmun59:4097-102 ；Frosch et al. (1990)Mol Microbiol. 4:1215-1218)均为本领域的公知常识。修饰奈瑟菌属宿主细胞以降低荚膜多糖产生可包括，修饰涉及荚膜合成的一个或多个基因，与修饰前的亲代细胞相比，所述修饰可以降低荚膜多糖的水平。这种遗传修饰包括，改变一个或多个荚膜生物合成基因的核苷酸和/或氨基酸序列，使得该菌株缺乏荚膜(例如，由于一个或多个荚膜生物合成基因中有一个或多个插入、缺失、取代，等等)。荚膜缺陷型菌株可缺乏一个或多个荚膜基因，或所述基因无功能。特别优选的是在唾液酸的生物合成中有缺陷的菌株。这种菌株可以产生囊泡，所述囊泡可降低引发与人唾液酸抗原起交叉反应的抗唾液酸抗体的风险，这种菌株还可改进生产安全性。具有唾液酸生物合成缺陷(因天然产生的修饰或工程改造的修饰)的菌株可以在唾液酸生物合成途径中的许多不同基因中的任意基因中有缺陷。特别优选的是N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-差向异构酶基因(称为synX AAF40537. I或siaA AAA20475)编码的基因产物有缺陷的菌株，尤其优选的是该基因灭活的菌株。例如，在一个实施例中，通过破坏功能性synX基因产物的产生来生成荚膜缺陷型菌株(参见，例如，Swartley et al. (1994)JBacteriol. 176:1530-4)。
也可采用非重组技术，从天然存在的菌株获得荚膜缺陷型菌株，例如用杀菌性抗荚膜抗体来选择荚膜多糖减少的菌株。当本发明涉及采用两种或两种以上菌株时(例如，为产生抗原性组合物，所述抗原性组合物包含来自不同菌株的带有对象fHbp的囊泡)，可选择在一个或多个菌株特征上有所不同的菌株，例如，使提供的囊泡具有不同的对象fHbp，PorA等。
_0] 囊泡的制备本发明所述的抗原性组合物通常包括由表达对象fHbp的奈瑟菌属细胞制备的囊泡。本申请所述的“囊泡”包括外膜囊泡以及微囊泡(也称为细胞泡(blebs))。所述抗原性组合物可以包含外膜囊泡(OMV)，所述外膜囊泡由经遗传修饰以表达对象fHbp的脑膜炎奈瑟球菌属培养菌株的外膜制备。可通过以下途径获得OMV :将脑膜炎奈瑟球菌培养在肉汤或固体培养基中，优选地通过分离细菌细胞与培养基(例如，通过过滤或低速离心来沉淀细胞，等等)、裂解细胞(例如，通过加入去垢剂、渗透休克、超声波处 理、空腔化、匀浆，等等)以及从细胞质分子中分离外膜组分(例如，通过过滤；或通过差别性沉淀或使外膜和/或外膜囊泡聚集；或通过使用配体的亲和分离方法，所述配体可以特异性识别外膜分子；或通过高速离心来沉淀外膜和/或外膜囊泡，等等)；可以利用外膜组分制备0MV。所述抗原性组合物可以包含含有对象fHbp的微囊泡(MV)(或“细胞泡”)，其中经遗传修饰以表达对象fHbp的脑膜炎奈瑟球菌菌株在培养期间释放所述MV或细胞泡。例如，可通过以下途径获得MV :将脑膜炎奈瑟球菌培养在肉汤培养基中，从肉汤培养基中分离出完整的细胞(例如，通过过滤或低速离心，从而只沉淀细胞，但不沉淀较小的细胞泡，等等)，然后收集无细胞培养基中的MV (例如，通过过滤、差别性沉淀或使MV聚集，或通过高速离心来沉淀细胞泡，等等)。通常可以根据培养基中产生的细胞泡数量来选择用于制备MV的菌株(例如，可培养合理数量的细菌来制备适合于本申请所述方法中分离和给药的细胞泡)。能产生高水平细胞泡的示例性菌株在PCT公开号WO 01/34642中有所描述。除了根据细胞泡产量，也可根据NspA产量选择用于制备MV的菌株，特别优选的是，能产生较高NspA水平的菌株(具有不同NspA产生水平的脑膜炎奈瑟球菌的例子可参见，例如，Moe et al. (1999Infect. Immun. 67:5664)。用于生产细胞泡的其他目标菌株包括，具有无活性GNA33基因的菌株，该基因编码细胞分离、膜结构和毒性所需的脂蛋白(参见，例如，Adu-Bobie et al. (2004)Infect Immun. 72:1914-1919)。本发明所述的抗原性组合物可以含有来自一种菌株，或2种、3种、4种、5种或更多种菌株的囊泡，这些菌株彼此可以是同源性的或异源性的，通常是异源性的。例如，就PorA和/或对象fHbp衍生自的fHbp而言，所述菌株可以是同源性或异源性的。可以采用表达一种以上对象fHbp (例如，I种、2种、3种或更多种对象fHbp)的菌株制备囊泡，所述对象fHbp可以由不同变体(V. I、V. 2或V. 3)或亚变体(例如，V. I、V. 2或V. 3的亚变体)fHbp的氨基酸序列组成。抗原性组合物可以包含提供相同或不同对象fHbp的OMV和MV的混合物，其中所述对象fHbp可以任选地提供来自fHbp变体和/或亚变体的不同组合的表位，且其中所述OMV和/或MV可以来自相同或不同的菌株。不同菌株的囊泡可以作为混合物给药或顺续给药。
需要时(例如，用于产生囊泡的菌株伴有内毒素或特别高水平的内毒素)，可以任选地处理所述囊泡以减少内毒素，例如，以降低给药后的毒性。可用合适的去垢剂(例如，BRIJ-96、脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠、Empigen BB、Triton X-100、吐温20 (聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯)、吐温80，浓度O. 1-10%，优选O. 5-2%，以及SDS)提取来减少内毒素，虽然如下文所述这可能存在不足。使用去垢剂提取时，最好使用除脱氧胆酸盐以外的去垢剂。可以不使用去垢剂制备抗原性组合物的囊泡，例如，不使用脱氧胆酸盐。虽然可用去垢剂处理除去内毒素活性，但在囊泡产品制备期间，通过提取的步骤可能会去除天然fHbp脂蛋白和/或对象fHbp (包括脂化的fHbp)。因此，特别需要采用无需去垢剂的技术来降低内毒素活性。在一个方法中，使用产生内毒素(脂多糖，LPS)较少的菌株，从而避免在用于人体前从最终制品中除去内毒素。例如，可以用奈瑟菌属突变体制备囊泡，在所述突变体中，脂寡糖或在疫苗中可能有害的其他抗原(例如，Rmp)被降低或清除。可以采用包含遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株制备囊泡，使得脂质A的毒活性降低或不可检测。例如，可对所述菌株进行脂质A生物合成的遗传修饰 (Steeghs et al. (1999)Infect Immun67:4988-93 ;van der Ley et al. (2001)InfectImmun69:5981-90 ；Steeghs et al. (2004)J Endotoxin ReslO: 113-9 ;Fissha etal, (2005) Infect Immun 73:4070)。通过修饰 LPS,例如分别使得编码 IpxLl 或 lpxL2 的酶下调和/或失活，可以使免疫原性组合物脱毒。在IpxLl突变体中产生五酰化脂质A，提示由IpxLl编码的酶在GlcN II的2’位将C12加入N连接的3-0H C14。在lpxL2突变体中，主要的脂质A种类为四酰化物，提示由lpxL2编码的酶在GlcN I的2位加入其他的C12，即加入到N-连接的3-0H C14。突变导致这些基因的表达降低(或不表达)(或这些基因的产物减少或无活性)，并改变脂质A的毒性(van der Ley et al. (2001) InfectImmun69:5981-90)。四酰化(lpxL2突变体)和五酰化(IpxLl突变体)脂质A的毒性低于野生型脂质A。脂质A 4’-激酶编码基因(IpxK)突变也能够降低脂质A的毒活性。对于囊泡(例如，MV或0MV)生产，特别优选的是经遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌，使得功能性LpxLI编码的蛋白减少或不可检测，例如，对奈瑟菌属(例如，脑膜炎奈瑟球菌菌株)进行遗传修饰，使得IpxLl基因产物的活性降低或无活性。例如，可以对奈瑟菌属进行遗传修饰，以敲除IpxLl基因，例如，破坏所述IpxLl基因。参见，例如，美国专利公开号2009/0035328。可以对奈瑟球菌菌属进行遗传修饰，使得lpxL2基因产物的活性降低或无活性。可以对奈瑟球菌菌属进行遗传修饰，使得IpxLl基因和lpxL2基因产物的活性降低或无活性。与能够产生LPS的野生型脑膜炎奈瑟球菌菌株相比，此类囊泡的毒性降低，但仍能保持fHbp的免疫原性。也可以通过在涉及多粘菌素B耐药(这种耐药与脂质A的4’磷酸基上加入氨基阿拉伯糖有关)的基因/基因座中引入突变来改变LPS的毒性。这些基因/基因座可以是编码UDP-葡萄糖脱氢酶的pmrE，或者是许多肠菌素共有的抗微生物肽抗性基因的某一区域，所述肠菌素涉及氨基阿拉伯糖合成和转移。存在于该区域的PmrF基因编码多萜醇-磷酸酯甘露糖基转移酶(Gunn J. S., Kheng, B. L. , Krueger J. , Kim K. , Guo L., Hackett M. , MillerS. I. 1998. Mol. Microbiol. 27:1171-1182)。PhoP-PhoQ调节系统中的突变，所述系统是磷酸化两组分调节系统(例如，PhoP组成型表型，PhoPc)，或低Mg++环境或培养条件(所述条件激活PhoP-PhoQ调节系统)，可导致在4’磷酸上加入氨基阿拉伯糖和以2-羟基肉豆蘧代替肉豆蘧(肉豆蘧羟基化)。该修饰的脂质A具有降低的刺激人内皮细胞表达E-选择素的能力和刺激人单核细胞分泌TNF的能力。多粘菌素B耐药菌株也适用，因为这些菌株的LPS毒性降低(参见，例如，van derLey et al. (1994)In:Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseriaconference. The Guildhall, Winchester, England)。可选地，可将能模拟多粘菌素B结合活性的合成肽加入所述抗原性组合物以降低LPS毒活性(参见，例如，Rustici et al. (1993)Science 259:361-365;Porro et al. (1998)ProgClin Bi ol Res. 397:315-25)。也可通过选择培养条件来减少内毒素。例如，将菌株培养在每升含O. Img-IOOmg氨基阿拉伯糖的生长培养基中来降低脂质毒性(参见，例如，WO 02/097646)。鉬合物和制剂本申请所用的“组合物”、“抗原组合物”、“抗原性组合物”或“免疫原性组合物” 一般情况下均为对包含本发明所述对象fHbp组合物的简称，对象fHbp可以任选地偶联以进一步增强免疫原性。在本发明中特别包括用于在人体中引发抗体的组合物，例如针对脑膜炎奈瑟球菌的抗体，例如针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌抗体。抗原性组合物可以包含I种、2种或多种不同的对象fHbp。当存在一种以上类型的fHbp时,各对象fHbp可以提供来自fHbp变体和/或亚变体的不同组合的表位。抗原性组合物含有免疫有效量的对象fHbp，如有需要，可以进一步包含其他相容性组分。本发明的组合物可以含有作为fH低结合蛋白的fHbp。对象组合物中的fH低结合蛋白包括上文所述的任何fHbp，例如非天然存在的或天然存在的fHbp (例如，fHbp ID 14和/或fHbp ID 15)。所述组合物含有一种或多种fHbp，其中至少一种fHbp是fH低结合蛋白。当组合物中有一种以上的fHbp时，各fHbp可以不同(例如，氨基酸序列和/或偶联物不同)。本发明的免疫原性组合物包括，但不限于，包含以下内容的组合物I)非天然存在的fHbp (例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID I的非天然存在的fHbp);以及2) fHbp (例如,非天然存在的fHbp,例如,对fH的亲和性低于fHbp ID I的非天然存在的fHbp)和NspA ；其中所述fHbp和/或NspA可以作为重组蛋白和/或在囊泡组合物(例如，0MV)中提供。应注意的是，当所述组合物包括NspA和fHbp时,通过组合物给药引发的抗体的杀菌活性是针对一种或两种抗原的抗体共同作用的结果。本发明提供的免疫原性组合物的例子包括a)包含上文所述的非天然存在的fHbp变体的免疫原性组合物(例如，针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性抗体应答的非天然存在的fHbp)；b)包含上文所述的非天然存在的fHbp变体的免疫原性组合物(例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID I的非天然存在的fHbp);以及重组NspA蛋白；c)包含分离的fHbp的免疫原性组合物，所述分离的fHbp与fHbp ID 14或fHbpID 15具有至少85%的氨基酸序列同一性，其中所述fHbp对人H因子(fH)的亲和性低于fHbp ID I ；d)包含分离的fHbp的免疫原性组合物，以及重组NspA蛋白；所述分离的fHbp与fHbp ID 14或fHbp ID 15具有至少85%的氨基酸序列同一性，其中所述fHbp对人H因子(fH)的亲和性低于fHbp ID I ；e)包含来自经遗传修饰的奈瑟菌属宿主细胞的天然OMV的免疫原性组合物，所述宿主细胞采用核酸进行遗传修饰，所述核酸编码如上文所述的非天然存在的fHbp变体(例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID I的非天然存在的fHbp)，使得经遗传修饰的宿主细胞产生编码的非天然存在的fHbp，其中所述OMV包含编码的非天然存在的fHbp ;以及f)包含来自经遗传修饰的奈瑟菌属宿主细胞的天然OMV的免疫原性组合物，所述宿主细胞采用核酸进行遗传修饰，所述核酸编码如上文所述的非天然存在的fHbp变体，(例如，对人fH的亲和性低于fHbp ID I的非天然存在的fHbp)，使得经遗传修饰的宿主细胞产生编码的非天然存在的fHbp，其中所述OMV包含编码的非天然存在的fHbp ;并且所述奈瑟菌属宿主细胞也产生高水平的NspA，使得所述OMV还含有NspA。例如，所述奈瑟菌属 宿主细胞可以经遗传修饰，使得NspA表达增加。“免疫有效量”表示将所述量给予个体时，不管是作为单一剂量或作为相同或不同免疫原性组合物连续给药的一部分，能够有效引发用于治疗或预防由例如奈瑟菌属感染导致的症状或疾病的有效抗体应答，所述菌属特别是脑膜炎奈瑟球菌，更特别地是脑膜炎奈瑟球菌B群。该用量根据以下因素而不同待治疗个体的健康和身体状况、年龄、个体的免疫系统产生抗体的能力、目标保护程度、疫苗制剂、主治医师对医疗状况的评估以及其他相关因素。预期所述用量可以在相对较宽的范围，其能通过常规试验测定。NspA多肽的氨基酸序列是本领域公知的。参见，例如，WO 96/29412 ;和Martin etal. (1997) J. Exp. Med. 185:1173 ;GenBank 登录号 U52066 ;以及 GenBank 登录号 AAD53286。“NspA多肽”可以包含一氨基酸序列，其与图44中所示的氨基酸序列中的约75个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约150个氨基酸、或约150个氨基酸至约174个氨基酸的连续链具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%的氨基酸序列同一性。“NspA多肽”可以包含一氨基酸序列，其与图44中所示的氨基酸序列中的20至174个氨基酸中的约75个氨基酸至约100个氨基酸、或约100个氨基酸至约155个氨基酸的连续链具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%的氨基酸序列同一性。在某些情况下，所述NspA多肽缺少信号序列；在其他情况下(例如，在宿主细胞中表达)，所述NspA多肽包括信号序列。剂量方案可以是单剂量方案或多剂量方案(例如，包括加强剂量)，所述多剂量方案在不同时间给予单位剂型的抗原性组合物。本申请中所用的术语“单位剂型”是指适用于人和动物对象的可作为单位剂量的物理上不连续的单位，各单位含有足以产生目标效果的预定含量的本发明抗原性组合物，所述组合物与药学上可接受的辅料(例如，药学上可接受的稀释剂、载体或溶剂)结合提供。所述抗原性组合物可与其他免疫调节剂联合给药。在药学上可接受的辅料，或粉末中提供抗原性组合物，所述辅料可以是溶液，如无菌水性溶液，通常是生理盐水溶液。如有必要，所述辅料基本上是惰性的。在某些实施例中，对象免疫原性组合物包含存在于囊泡中的对象fHbp。在某些实施例中，对象免疫原性组合物包含存在于MV中的对象fHbp。在某些实施例中，对象免疫原性组合物包含存在于OMV中的对象fHbp。在某些实施例中，对象免疫原性组合物包含含有对象fHbp的MV与OMV的混合物。上文中已描述了囊泡，例如如MV和0MV。抗原性组合物可以进一步包含佐剂。可用于人体的已知适宜佐剂的例子包括，但不一定限于明帆、磷酸招、氢氧化招、MF59 (4. 3%w/v角藍烯、O. 5%w/v吐温80 、0. 5%w/v司盘85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶未甲基化)、QS21、MPL、3DMPL、Aquilla提取物、ISC0MS、LT/CT突变体、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白介素，等等。对于实验动物，可使用弗氏佐剂、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2- (Γ -V -二-棕榈酰-sn-甘油基_3_羟基磷酰氧基)_乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)、以及RIBI，所述RIBI含有在2%角鲨烯/吐温80乳液中提取自细菌的三种组分单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。可通过检测针对免疫原性抗原或其抗原表位的抗体量来测定佐剂的效力。能够提高所述组合物效力的进一步示例性佐剂包括，但不限于(I)水包油乳剂(含有或不含其他特异性免疫刺激剂，例如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁组 分)，例如例子(a)MF59 ，含有5%角鲨烯、O. 5%吐温80和O. 5%司盘85 (任选地含有MTP-PE)(W0 90/14837 ；Chapter IOin Vaccine design: the subunit and adjuvantapproach, eds. Powell&Newman, Plenum Press 1995),利用微流化仪制成亚微米颗粒；(b) SAF，含有10%角鲨烯、O. 4%吐温80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121、以及thr_MDP，微流化为亚微米乳液，或旋振产生粒径较大的乳液，和(c)RIBI 佐剂系统(RAS) (RibiImmunochem, Hamilton, Mont.)，含有2%角藍烯、O. 2%吐温80、以及一种或多种细菌细胞壁组分，例如单磷脂酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选 MPL+CWS (Detox ) ； (2)皂苷佐剂，例如可以使用 QS21 或 Stimu I on (CambridgeBioscience, Worcester, Mass.)或由其产生的颗粒，例如ISC0M(免疫刺激复合物),所述ISCOMS可缺乏额外的去垢剂，例如WO 00/07621 ； (3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA) ；(4)细胞因子，例如白介素(例如，IL- I、IL-2、IL_4、IL_5、IL_6、IL-7、IL-12(W099/44636)等)、干扰素(例如，Y干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A (MPL)或3_0_脱酰基MPL(3dMPL)，例如见GB-2220221、EP-A-0689454，任选地，当与肺炎球菌糖联用时，基本上不含明矾，例如WO 00/56358 ；
(6)3dMPL与，例如，QS21和/或水包油乳液的组合物，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231 ； (7)含有 CpG 基序的寡核苷酸(Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622;KriegCurr opin Mol Ther20013:15-24;Roman et al. , Nat. Med, 1997, 3, 849-854;Weiner etal. , PNAS USA, 1997，94，10833-10837;Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 810-876;Chuet al.，J. Exp. Med, 1997，186，1623-1631; Lipford et al, Ear. J. Immunol.，1997，27,2340-2344;Moldoveami e/al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al.,Nature,1995，374，546-549;Klinman et al.,PNAS USA, 1996，93，2879-2883;Ballas etal,J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845;Cowdery et al,J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575;Halpern et al,Cell Immunol, 1996, 167, 72-78;Yamamoto et al,Jpn. J. CancerRes. , 1988, 79, 866-873;Stacey et al, J. Immunol.，1996，157，2116-2122;Messina etal, J. Immunol, 1991，147，1759_1764;Yi et al, J. Immunol, 1996，157，4918-4925;Yietal, J. Immunol, 1996，157，5394-5402;Yi et al, J. Immunol, 1998，160，4755-4761;和Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906;国际专利申请 WO 96/02555、WO 98/16247、W098/18810, WO 98/40100、WO 98/55495、TO 98/37919 和 WO 98/52581)，即含有至少一个CG 二核苷酸，其中胞嘧啶未甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如W099/52549 ；
(9)聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇的组合物(W0 01/21207)，或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其他非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的组合物(W001/21152) ；(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(W0 00/62800) ；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒，例如WO 00/23105 ； (12)皂苷和水包油乳剂，例如WO 99/11241 ；
(13)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+M2(任选+激素)，例如WO 98/57659 ； (14)用作免疫刺激剂来提高所述组合物效力的其他物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(正-MDP)、N_乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(Γ -2' -二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。特别优选的是适于向人给药的佐剂。
抗原组合物可以包含其他成分，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐，等等。所述组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质来模拟生理条件，例如PH调节和缓冲剂、毒性调解剂，等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠，等等。制剂中对象fHbp的浓度可以在大范围内变动(例如，以体重计,从小于约O. 1%，通常是或至少是约2%到多达20%至50%或更高)，主要按照所选择的具体给药方式和患者的需要，根据液体体积、粘度、以及基于患者的因素来选择。包含fHbp的制剂可以以溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、乳膏、洗剂、
软膏、气雾剂等形式提供。已知口服给药时需要保护组合物以免其被消化。一般通过将组合物制成耐酸解和酶解的制剂，或使用适宜的抗性载体对组合物进行包衣来保护组合物。保护不被消化的方法为本领域的公知常识。还可以提供包含fHbp的制剂，使得fHBP的血清半衰期在给药后增加。例如，当将单独的fHbp制成注射剂时,所述fHbp可以制成脂质体制剂,制成胶体,或其他能够延长血清半衰期的传统制剂。可以采用多种方法制备脂质体，参见，例如Szoka et al. , Ann. Rev.Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)，U. S.专利号 4，235，871,4, 501，728 和 4，837，028。所述制剂还可以制成控释或缓释制剂。免疫接种本发明提供了一种在哺乳动物宿主中诱导至少针对一种奈瑟菌属菌株产生免疫应答的方法。所述方法通常涉及给予所需个体有效量的对象免疫原性组合物。一般向处于获得奈瑟菌属疾病风险的人给药包含fHbp的抗原性组合物，以预防或至少部分阻止疾病及其并发症的发展。将足以实现此目的的用量定义为“治疗有效量”。治疗有效量取决于，例如抗原性组合物、给药方式、患者的体重和总体健康状况，以及处方医师的判断。所述抗原性组合物是单剂量给药还是多剂量给药，取决于患者所需和可耐受的剂量和频率，以及给药途径。通常给予宿主有效量的包含fHbp的抗原性组合物以引发免疫应答，特别是体液免疫应答，例如杀菌性抗体应答。如上文所述，免疫接种的量可以发生改变，其通常用量范围为约I μ g至100 μ g/70kg患者，更常见5 μ g至50 μ g/70kg。口服、鼻部或局部给药基本上可采用较高的剂量(例如，IOmg至IOOmg或更高)。初次给药后可用相同或不同的包含fHbp的抗原性组合物进行加强免疫。通常疫苗接种至少加强一次，更常见加强两次。一般情况下，免疫接种可以通过任何适宜的途径给药，包括口服、鼻部、鼻咽部、胃肠外、肠道、胃部、局部、皮下、肌肉内，以片剂、固体、粉末、液体、气雾剂形式，局部或全身性给药组合物，可以加入或不加入辅料。有关本领域技术人员已知或明白的制备可胃肠外给药的组合物的实际方法的更详细描述，参见，例如Remington' sPharmaceutical Science,第 15 版，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)。可以通过已知方法评估抗fHbp的免疫应答(例如，分别于首次免疫接种前后收集个体的血清，通过例如免疫沉淀检测，或ELISA、或杀菌试验、或Western印迹、或流式细胞检测等，证明个体的免疫状况改变)。可以向人对象给药所述抗原性组合物，所述人对象没有经脑膜炎奈瑟球菌免疫(immunologicallynaive)。在一个特定实施例中，所述对象为约5岁或更小的儿童,优选 约两岁或更小的儿童，所述且所述抗原性组合物在一个或多个以下时间给药出生后两周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，或I年或15、18或21个月，或在2岁、3岁、4岁或5岁时。一般希望在疾病症状首次体征出现前，或在首次出现可能或实际接触感染或疾病(例如，由于接触或感染奈瑟菌属)的体征时进行首次免疫接种。筛诜方法在一个例子中，评估对象fHbp在疫苗组合物中有效性的方法包括(a)使用包含本发明fHbp的组合物免疫宿主动物(例如，非人哺乳动物宿主动物，例如啮齿类，例如小鼠)；以及(b)检测宿主中杀菌性抗体的水平。所述对象方法还可以包括评估宿主动物对细菌性病原体的易感性，向所述宿主动物给药包含对象fHbp的疫苗。在另一个例子中，所述方法可以包括制备和鉴定所述对象fHbp引发的抗体。所述方法包括，从宿主动物中分离对fHbp具有结合亲和性的抗体，将细菌细胞与所述分离的抗体接触；以及评估所述抗体与所述细菌细胞的结合。附加步骤可以包括，评估针对fHbp的抗体与人H因子的竞争性结合；当向具有细菌性病原体的动物给药所述抗体时，评估针对细菌性病原体的杀菌活性。在某些实施例中，抗体在抗体群中，并且所述方法可以进一步包括从与所述抗体群中分离一种或多种结合所述细菌细胞的抗体。一个具有特色的方面是，分离的抗体对细菌细胞具有杀菌性，例如，通过补体介导的杀菌活性和/或噬菌细胞活性，所述活性能够降低细菌在人血液中的生存能力。特别优选的细菌性病原体为脑膜炎奈瑟球菌多种荚膜群的任何或全部变体群，如脑膜炎奈瑟球菌血清群B、脑膜炎奈瑟球菌血清群C、脑膜炎奈瑟球菌血清群X、脑膜炎奈瑟球菌血清群Y、脑膜炎奈瑟球菌血清群W-135，等等。评估对FHBP应答的方法本发明提供了确定fHbp在个体中引发杀菌性应答可能性的方法；以及评估适于加入免疫原性组合物的fHbp变体的方法。确定fHbp弓I发杀菌性应答的可能性本发明提供了一种确定fHbp (例如，存在于奈瑟菌属疫苗中的fHbp)在个体中针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性应答可能性的方法。所述方法通常包括，确定抗体抑制fH与fHbp结合的能力，所述抗体存在于从已免疫fHbp的个体获得的血清中。所述抗体对fH与fHbp结合的抑制水平比对照抗体对fH与fHbp结合的抑制水平至少高约10%、至少高约25%、至少高约50%、至少高约75%、至少为约2倍、至少为约10倍、至少为约50倍、至少为约100倍、或高于100倍，所述对照抗体抑制fH与fHbp的结合，但不产生杀菌性应答，则表明fHbp可能针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发出杀菌性应答。在某些实施例中，如上文所述，所述fHbp是非天然存在的fHbp，其对人H因子(fH)的亲和性低于fHbp ID I。可以采用本申请所述的检测方法，或任何其他已知的检测方法确定fHbp变体引发的抗体抑制fH与fHbp结合的程度。例如，所述fH和/或所述fHbp可以包含可检测标记，通过检测在fH/fHbp复合物中存在的标记组分的量，和/或检测在游离fH和/或游离fHbp (例如，不在fH/fHbp复合物中的fH或fHbp)中存在的标记的量，可以确定fH/fHbp结合的抑制。在一个例子中，评估fH与fHbp结合的检测方法包括，使用固定于支持物上的 fHbp (例如，固定于酶标板孔中的fHbp)。在孔中加入混合物，所述混合物含固定浓度的人fH与待测抗体的稀释物(例如，抗血清，例如，来自接受过抗体激发剂量的免疫原性组合物的人或非人受试动物(例如，小鼠))，并孵育足够长的时间以供抗体结合。洗涤孔后，使用含有标记组分的特异性抗fH抗血清(例如，山羊或驴)，或第二标记抗体(例如，家兔抗山羊或抗驴抗血清)检测结合的fH。通过未加入人或小鼠抗体时结合fH的量，可以计算结合fH的抑制百分率。在此类检测的另一个变化方式中，利用流式细胞术评估在待测抗血清存在或不存在时，fH与活细菌的结合。将细菌细胞与固定浓度的fH(例如，可检测的标记fH)和含有抗体的待测血清的不同稀释物共同孵育。洗涤细菌并检测结合的fH(例如，如上文所述)。因此，评估来自经fHbp免疫的个体的抗血清抑制fH/fHbp结合的能力，可以代替直接评估所述抗血清的杀菌性活性。本发明中用于确定fHbp在个体中引发杀菌性应答可能性的方法，可以向临床医师或其他医疗人员提供信息，确定特定免疫原性组合物是否已在个体中引发有效的杀菌性应答。用ELISA测定免疫个体，他们具有相似的血清IgG抗fHbp抗体滴度。如果抗血清在总体上提供更好的fH结合抑制，则表明产生了更为有效、质量更高的抗-fHbp抗体应答，并且会提供更好的保护。因此，例如，在比较两个个体产生的抗奈瑟菌属抗体应答时(通过比较抗-fHbp抗体，即，将1:10，000血清稀释物的抑制与其他个体1:3000稀释物相比)，抑制活性更高的个体具有的抗fHbp抗体质量更高，将提供更好的保护。因此，可以将fH抑制检测用于替代补体介导的杀菌性滴度检测，与fH抑制相比，补体介导的杀菌性滴度检测通常需要花费更多时间，且其检测难度也更大。评估fHbp变体本发明提供了评估或预测fHbp变体在个体中有效引发杀菌性抗体应答可能性的方法。所述方法通常包括评估对fHbp变体具有特异性的抗体抑制fH与fHbp结合的能力。由fHbp变体免疫引发的抗体对fH与fHbp结合的抑制强度，与所述fHbp变体引发的抗体的杀菌活性呈正相关。如果fHbp变体引发的抗体能在较高的血清稀释度下抑制fH与fHbp结合，则可以考虑作为适宜的疫苗候选物，用于引发针对一种或多种奈瑟菌属菌株的保护。
例如，本发明提供了一种确定非天然存在的fHbp在个体中针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性抗体的可能性的方法，所述fHbp对人fH的亲和性低于fHbp IDI。所述方法通常包括，确定在非人受试动物中由非天然存在的fHbp引发的抗体抑制fH与fHbp结合的能力。所述由非天然存在的fHbp引发的抗体对fH与fHbp结合的抑制水平比在非人受试动物中由fHbp ID I引发的抗体对fH与fHbp结合的抑制水平至少高约10%、至少高约25%、至少高约50%、至少高约75%、至少为约2倍、至少为约10倍、至少为约50倍、至少为约100倍、或高于100倍，表明所述非天然存在的fHbp有可能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌性应答。 适宜的非人受试动物包括，例如，小鼠、大鼠、家兔，等等。可以采用本申请所述的检测方法，或任何其他已知的检测方法确定fHbp变体引发的抗体抑制fH与fHbp结合的程度。采用本申请所述的检测方法，或任何其他已知的检测方法可以很容易地确定抗体的杀菌活性。对某给定的与人fH的亲和性低于fHbp ID I的非天然存在的fHbp，确定其在个体中针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性抗体可能性的方法，可以在例如疫苗开发过程中，用于鉴定适宜的免疫原(和/或消除不适宜的免疫原)。实施例应该理解，本申请所述的例子和实施例只是为了说明目的，本领域技术人员鉴于这些例子和实施例可提出各种改进或变化，这些改进和变化应包括在本申请的构思和权限以及附加的权利要求书的范围内。本申请引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的而整体参考并入。实施例概述H因子(fH)在血清中以较高浓度Γ200至800 μ g/ml)存在。fH与fHbp的结合对人fH具有特异性(Granoff et al. (2009) Infect Immun 77:764)。一种含意为，当使用fHbp对人进行免疫时，分子能够与fH形成复合物。相反地，当非人灵长类或其他实验动物被免疫时，抗原存在于免疫系统，但不与fH结合。在人类中，fH与fHbp的复合物可能影响fHbp的免疫原性(例如，通过覆盖表位和影响抗原呈递)。本申请提供了证据表明，人fH的存在会降低与fH结合的fHbp疫苗的保护性抗体应答。而且，虽然具有一个或两个氨基酸取代的某些突变疫苗不与fH结合(例如，E218A和/或E239A)，但是用于改变分子的特异性突变导致了改变，即降低了疫苗引发血清杀菌性抗体的能力。已确定，其他的单氨基酸突变体(例如，fHbp ID I的R41S或R41A突变体；fHbp ID 4、9、74 或嵌合 fHbp I 的 R41S 突变体；fHbp ID I 的 Rl30A 突变体；fHbp ID 22的 R80A、D211A、E218A、E248A、或 G236I 突变体；fHbp ID 22 的 T220A/H222A 突变体；fHbpID 77 的 R41S/K113A、R41S/K119A、R41S/D121A、或 R41S/K113A/D121A 突变体；以及 fHbpID 28的K199A或E218A突变体)与fH的结合降低。具有R41S突变的fHbp疫苗引发杀菌性抗体的能力不会降低，并且在存在人fH时，其比与fH结合的野生型fHbp ID I疫苗具有更高的保护性抗体应答。其他突变，例如fHbp ID I的K24IE或来自于fHbp ID I晶体结构的fHbp ID 15的E241K，预计将与fH接触，但对fH结合没有影响。此外，R41S突变，在fHbp ID 1、4、9、和74中减少fH结合，在fHbp ID 22或77中不会减少fH结合。减少fH结合但对fHbp的构型具有极小影响或无影响的突变(如fHbp ID I中的R41S，以及下文中讨论的其他突变)，使得突变体疫苗引发杀菌性抗体，可以作为非常好的疫苗候选物。因此，fHbp变体维持并呈递构型表位，所述表位与杀菌性抗体结合，所述抗体具有针对一种或多种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌性活性。揭示本发明的研究的详细情况如下文所示。材料和方法人fH转基因小鼠模型。将3. 9kbp人补体fH(cfh) cDNA克隆至质粒pCAGGS (Niwaet al. (1991)Genel08:193-9)。将 6kbp SalI-PstI 限制性片段显微注射至 BALB/c 小鼠的胚胎，并植入假性妊娠雌性BALB/c小鼠。通过Western印记检测胎仔血清中人fH的表达。血清中人fH的浓度。为区分人与小鼠的fH，使用了特异性与人fH结合的fHbp捕 获酶联免疫吸附试验(ELISA)。将在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中的重组fHbp (2 μ g/ml)加入酶标板的各孔中。经1%牛血清白蛋白(BSA)封闭后，加入未经免疫的小鼠或人血清的稀释物。使用绵羊抗人fH抗血清(Lifespan Biosciences, Seattle, WA ; 1:2000稀释)检测结合的人fH。使用与碱性磷酸酶偶联的抗绵羊IgG对ELISA显色。加入磷酸酶底物P-硝基苯磷酸酯(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO),然后室温条件下孵育30min,在405nm处测定光密度。通过与含471 μ g/ml fH的人对照血清稀释物进行比较确定fH的浓度。作为对照，对旧金山湾地区成人受试者的25份血清中的fH进行检测，这些受试者参与了经IRB批准的一项试验，以筛选作为血清杀菌性检测补体来源的正常血清。重组fHp疫苗。按照已描述的方法对野生型fHbp和R41S突变蛋白重组体进行纯化(Beernink PT et al. (2008) Infect Immun76:2568-2575)。米用已经过马萨诸塞大学医学院动物饲养和使用委员会批准的试验方案，在六至八周龄的BALB/c野生型或人fH转基因小鼠中评估疫苗的免疫原性。腹腔注射给予三剂量含20μ gfHbp的疫苗，每次间隔三周，所述fHbp吸附于600 μ g氢氧化招。对照脑膜炎球菌群C偶联疫苗(Meningitec; Wyeth, Montreal, Canada)含有吸附于100 μ g磷酸招上的2 μ g多糖和3 μ gCRM197。统计学分析。采用双侧学生氏t检验比较两个独立的小鼠组之间血清抗体应答几何平均滴度(GMT)的倒数。还使用了单侧t检验以检验，经野生型fHbp疫苗免疫的转基因小鼠的抗fHbp抗体应答是否不低于经免疫的野生型小鼠。采用一般线性回归模型检验fHbp疫苗的类型和人fH的浓度是否影响血清杀菌性抗体应答。为符合正态假设，在回归和相关性分析中，对血清杀菌性抗体检测结果和fH的浓度进行了 Iogltl转换。双侧P值小于或等于O. 05被认为具有统计学意义。实施例I :人3的结合降低疫苗的免疫原性。fH与fHbp的结合可能会覆盖表位，并削弱针对细菌表面暴露的fHbp分子部分的抗体应答，该部分对杀菌活性最为有效。因为人fH与fHbp的结合特异性针对人fH，所以使用人fH转基因动物模型研究fH对疫苗免疫原性的影响。使用上文所述的fHbp捕获ELISA检测转基因小鼠的血清中人fH的浓度，所述检测对人fH具有特异性。对照孔中含有浓度范围为O. 15至5μ g/ml的纯化人fH(图1，列A)。实验孔含有转基因小鼠的不同血清稀释物(从1:100开始以2倍的比例倍比稀释)。转基因小鼠的血清中，人fH的浓度>100yg/ml。血清H因子阴性的同窝小鼠中的浓度<12yg/ml，其低于检测限。已知野生型小鼠中的人fH也〈12 μ g/ml。相比之下，成人补体供体的储存血清样品中fH浓度>100 μ g/ml (图1，列B)。在下文所述的实验中，<12yg/ml的转基因小鼠的同窝小鼠或已知的野生型小鼠将被称为“野生型”小鼠。在研究I中，使用与人fH结合的重组fHbp疫苗免疫人fH转基因或野生型小鼠(下表I)。第三次疫苗注射三周后，转基因小鼠的血清杀菌性抗体应答比血清fH与疫苗不结合的野生型小鼠低8倍(GMT的倒数为59对比野生型小鼠的453，P=O. 03)。研究I中未包括不与fH结合的对照疫苗。因此，应确定转基因小鼠中的fHbp疫苗免疫原性降低是不是疫苗抗原与人fH结合的结果，或者小鼠是不是可能对一般性的疫苗抗原具有更低的血清抗体应答。在研究2中，重复接种fHbp，其中包括使用对照脑膜炎球菌群C多糖-CRM197偶联疫苗免疫的转基因和野生型小鼠组，所述疫苗不与人fH结合。经脑膜炎球菌偶联疫苗免疫的转基因小鼠的代表性血清IgG和杀菌性抗体应答与在野生型小鼠中得到的结果相比不存在显著性差异(图2)。如在研究I中所观察到的，在研究2中使用与人fH结合的fHbp疫苗免疫的转基因小鼠具有更低的血清杀菌性抗体应答(GMT的倒数为31对比野生型小鼠的115，P=O. 05，单侧T检验)。而且，转基因小鼠血清中的人fH浓度与同人fH结合的fHbp疫苗的血清杀菌性抗体应答之间呈负相关(图3，列A ;皮尔森相关系数，r=-0. 65 ； P=O. 02)。因此，人fH血清浓度越高，对疫苗的血清杀菌性应答越低。在这两项研究中，转基因小鼠的血清IgG抗fHbp抗体应答低于野生型小鼠(研究I,GMT 的倒数为 30，000 对比 97，000，P=O. 03 ;研究 2，GMT 的倒数为 107，000 对比 190，000，P=O. 025)。总的数据表明，人fH与fHbp疫苗的结合同时削弱了 IgG抗fHbp抗体的滴度和杀菌性抗体应答。表I.经与人fH结合的重组fHbp疫苗免疫的野生型小鼠或人fH转基因小鼠的补
体介导的血清杀菌性抗体应答
权利要求
1.一种非天然存在的H因子结合蛋白(fHbp)，所述蛋白对人H因子(fH)的亲和性低于fHbp ID I,其中所述非天然存在的fHbp存在供抗体结合的构象表位,所述抗体对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌活性。
2.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp,其中所述fHbp与天然存在的对照fHbp相比，包含至少一个氨基酸取代。
3.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp与人fH结合的亲和性为fHbp ID I与人fH亲和性的50%或更低。
4.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp,其中所述fHbp与人fH结合的亲和性为fHbp ID I 与人 fH 亲和性的 40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%、0. 1%、或 0. 1% 以下。
5.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp引发的杀菌性抗体的血清水平至少与fHbp ID I引发的水平一样高。
6.根据权利要求5所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp引发的杀菌性抗体的血清水平至少比fHbp ID I引发的水平高2倍。
7.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp,其中所述fHbp衍生自变体lfHbp。
8.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp,其中所述fHbp衍生自变体2fHbp。
9.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp,其中所述fHbp衍生自变体3fHbp。
10.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含可变片段\、Vc,、和Ve，其全部衍生自谱系I。
11.根据权利要求7所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp衍生自模块群IfHbp或模块群IV fflbp。
12.根据权利要求8所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp衍生自模块群IIIfHbp或模块群VI fHbp。
13.根据权利要求9所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp衍生自模块群IIfHbp或模块群V fHbp。
14.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp衍生自模块群VII、VIIII、IX、或 X fHbpo
15.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp为人工制备的嵌合体。
16.根据权利要求15所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp衍生自嵌合体I的氨基酸序列。
17.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp在对应于氨基酸残基41、60、80、113、114、117、119、121、128、130、147、148、149、178、195、199、211、220、222、236、241、247、或248的位置处包含氨基酸取代，所述编号基于成熟fHbp ID I的编号。
18.根据权利要求I所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp在对应于氨基酸残基87、109、115、118、126、138、197、201、202、203、209、217、225、235、或 245 的位置处包含氨基酸取代，所述编号基于成熟fHbp ID I的编号。
19.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp在对应于氨基酸残基41的位置处包含氨基酸取代。
20.根据权利要求19所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含R41S作为所述氨基酸取代。
21.根据权利要求19所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含R41A作为所述氨基酸取代。
22.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含R130A作为所述氨基酸取代。
23.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含H119A作为所述氨基酸取代。
24.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含E218A或E239A作为所述氨基酸取代。
25.根据权利要求19-24任一项所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp衍生自fHbpID I。
26.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含fHbpID14，所述fHbp ID 14含有R41S作为所述氨基酸取代。
27.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含fHbpID4，所述fHbp ID 4含有R41S作为所述氨基酸取代。
28.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含fHbpID9，所述fHbp ID 9含有R41S作为所述氨基酸取代。
29.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含fHbpID74，所述fHbp ID 74含有R41S作为所述氨基酸取代。
30.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp是fHbpID15，所述fHbp ID 15含有S41P作为所述氨基酸取代。
31.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含R80A作为所述氨基酸取代。
32.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含D211A作为所述氨基酸取代。
33.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含E218A作为所述氨基酸取代。
34.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含E248A作为所述氨基酸取代。
35.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含G236I作为所述氨基酸取代。
36.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp在220和222中的一个或两个位置处包含氨基酸取代。
37.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含T220A和H222A作为所述氨基酸取代。
38.根据权利要求31-37任一项所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp衍生自fHbpID 22。
39.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp在41、113、119、和121中的一个或多个位置处包含氨基酸取代。
40.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含R41S和K113A作为所述氨基酸取代。
41.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含R41S和K119A作为所述氨基酸取代。
42.根据权利要求12所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含R41S和D121A作为所述氨基酸取代。
43.根据权利要求12所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp包含R41S、K113A、和D121A作为所述氨基酸取代。
44.根据权利要求39-43任一项所述的非天然存在的fHbp,其中所述fHbp衍生自fHbpID 77。
45.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp衍生自嵌合体I的氨基酸序列，并且包含R41S作为所述氨基酸取代。
46.根据权利要求17所述的非天然存在的fHbp，其中所述fHbp为fHbpID28，所述fHbp ID 28包含E218A和/或K199A作为所述氨基酸取代。
47.一种免疫原性组合物，包含 a)根据权利要求1-46任一项所述的fHbp;以及 b)药学上可接受的辅料。
48.一种免疫原性组合物，包含 a)一种分离的H因子结合蛋白(fHbp)，其包含与fHbp ID 4,fHbp ID 14,fHbp ID 15的至少85%的氨基酸序列同一性，其中所述fHbp对人H因子(fH)的亲和性低于fHbp IDI ;以及 b)药学上可接受的辅料。
49.根据权利要求47或48所述的免疫原性组合物，其中所述fHbp在由脑膜炎奈瑟球囷囷株制备的囊泡制剂中。
50.根据权利要求47或48所述的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的辅料包含佐剂。
51.根据权利要求47或48所述的免疫原性组合物，进一步包含NspA。
52.—种在哺乳动物中引发抗体应答的方法，所述方法包括向哺乳动物给药根据权利要求1-46任一项所述的fHbp，或根据权利要求47或48的免疫原性组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述给药用于产生针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体。
55.—种核酸,所述核酸编码根据权利要求1-46任一项所述的fHbp。
56.—种重组体表达载体,其中包含权利要求55所述的核酸。
57.—种经遗传修饰的宿主细胞,其中包含权利要求55所述的核酸或权利要求56所述的重组体表达载体。
58.一种免疫原性组合物，包含 a)来自经遗传修饰的奈瑟菌属宿主细胞的囊泡，所述细胞经一种核酸遗传修饰，所述核酸编码根据权利要求1-46任一项所述的fHbp，使得所述经遗传修饰的宿主细胞产生所述编码的非天然存在的fHbp，其中所述囊泡包含所述编码的非天然存在的fHbp ;以及b)药学上可接受的辅料。
59.根据权利要求58所述的免疫原性组合物，其中所述囊泡是天然外膜囊泡。
60.根据权利要求58所述的免疫原性组合物，其中所述fHbp与人fH结合的亲和性为fHbp ID 1与人邡亲和性的40%、30%、20%、10%、5%、2%、或1%。
61.根据权利要求58所述的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞经遗传修饰，以提供IpxLl基因和/或lpxL2基因的活性降低或无活性的多肽产物。
62.根据权利要求58所述的免疫原性组合物，其中所述宿主细胞经遗传修饰，以使得NspA表达增加。
63.—种在哺乳动物中引发抗体应答的方法，所述方法包括向哺乳动物给药根据权利要求58所述的免疫原性组合物。
64.一种确定H因子结合蛋白(fHbp)在个体中针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性应答可能性的方法，所述方法包括 确定抗体抑制人H因子(fH)与fHbp结合的能力，所述抗体存在于从已免疫fHbp的个体获得的血清中，其中所述抗体对fH与fHbp结合的抑制水平比对照抗体对fH与fHbp结合的抑制水平至少高约25%，所述对照抗体抑制fH与fHbp的结合，但不产生杀菌性应答，则表明fHbp可能针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发出杀菌性应答。
65.根据权利要求64所述的方法,其中所述fHbp是非天然存在的fHbp,其对fH的亲和性低于fHbp ID I。
66.一种确定非天然存在的H因子结合蛋白(fHbp)在个体中针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株引发杀菌性抗体的可能性的方法，所述fHbp对人H因子(fH)的亲和性低于fHbpID I,所述方法包括 确定在非人受试动物中由非天然存在的fHbp引发的抗体抑制fH与fHbp结合的能力， 其中所述由非天然存在的fHbp引发的抗体对fH与fHbp结合的抑制水平比在非人受试动物中由fHbp ID I引发的抗体对fH与fHbp结合的抑制水平至少高约25%，表明所述非天然存在的fHbp有可能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株的杀菌性应答。
全文摘要
本发明提供了H因子结合蛋白及其使用方法，所述蛋白能够引发针对至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌性的抗体。
文档编号C07K14/00GK102834410SQ201180017429
公开日2012年12月19日 申请日期2011年3月29日 优先权日2010年3月30日
发明者P·T·伯尼克, D·M·格拉诺夫, R·帕乔菲特 申请人:奥克兰儿童医院及研究中心, 诺华疫苗和诊断公司