GADD45β蛋白及其相关细胞因子在类风湿关节炎中的应用的制作方法

专利名称：GADD45β蛋白及其相关细胞因子在类风湿关节炎中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及GADD45β蛋白及其相关细胞因子在类风湿关节炎中的应用，尤其是涉及GADD45β蛋白及其相关细胞因子在生物检测和诊断方法的用途，具体地说，本发明涉及一种在类风湿关节炎的发病过程中起重要作用的蛋白-GADD45β蛋白及其相关的细胞因子、下游的激酶和抑制剂在诊断或治疗类风湿关节炎上的用途。本发明还提供了相应的诊断试剂盒。
背景技术：
虽然类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)病因和发病机制尚不明确，如II型胶原和热休克蛋白是类风关发病的自身抗原，虽然这些自身抗原在疾病病理过程中的作用并不十分清楚。但已公认T细胞介导的炎症在类风关滑膜病变过程中起了很重要的作用，特别是Th1细胞，和炎症有关的炎症细胞因子和趋化因子介导了RA组织的损伤。已报导TNF-α拮抗剂和其受体治疗RA有效。但类风关滑膜炎症T细胞的启动和持续存在的分子机制尚不清楚。
GADD45β属于GADD45(growth arrest and DNA damage-inducible生长阻断和诱导DNA损伤因子)家族，有三个成员GADD45α、GADD45β和GADD45γ，在进化上十分保守，产物也十分相似，但在体内功能各不相同。GADD45蛋白在转录水平受到调节，在一些重要的生理过程中发挥作用，包括G2/M期细胞周期检查点及DNA修复。现在的研究表明GADD45家族蛋白具有抗增殖活性，能直接与细胞周期蛋白如PCNA，cdc2，cyclinB和p21相互作用来诱导细胞凋亡。尽管过程与GADD45α类似，GADD45β显示了不同的生理活性。而GADD45β还有调节T细胞活化和分化的功能。有报导表明GADD45β通过丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)介导Th1细胞的分化。MAPKs是将胞外信号传导到细胞核内的重要蛋白细胞外各种应激条件，如高渗透压、热休克、紫外线以及细胞因子、病原微生物成分-脂多糖(LPS)等都能通过该途径来调节细胞功能、诱导分化及凋亡等生物效应，是细胞执行功能的重要机制。
已知GADD45β蛋白作为早期T淋巴细胞启动剂，并与一系列与炎症过程有关的前炎症细胞因子的产生有关。GADD45β蛋白是一种具有多种功能的细胞内蛋白。GADD45β蛋白属于调节T细胞生长、活化与分化的蛋白质，因为GADD45β蛋白具有促进Th1细胞分泌IFN-γ的作用。GADD45β蛋白可以通过活化胞内许多重要的激酶来介导细胞的功能，其中最主要的包括MAPK途径的ERK，和P-38。GADD45β蛋白可以与这些激酶相互作用并导致后者发生磷酸化，而促进T细胞向Th1型分化并分泌多种细胞因子，如IFN-γ等发挥其作用。
同时，GADD45β蛋白还是抗细胞凋亡的主要分子。GADD45β蛋白的表达上调可以通过抑制JNK的活化而抑制细胞的凋亡，这点已经在一些肿瘤发生和进展的研究中得到证实。
GADD45β蛋白与T细胞的活化，向Th1方向的分化及发挥其功能等方面的研究刚刚开始展开。关于GADD45β蛋白和类风关的关系至今表达尚未见报道。尤其，在本发明之前，类风关滑膜浸润T细胞和外周血中T细胞中GADD45β蛋白过表达和其在类风关中的功能关系尚未阐明。
由于类风湿关节炎的发病机理，尤其是类风关致病性CD4+T细胞的启动和持续性存在的分子机制尚不清楚，因此极大地阻碍了类风湿关节炎的诊断和治疗。因此，本领域长期以来一直迫切希望找到与RA的发病有关的物质，以便开发出具有辅助诊断类风湿关节炎及其它自身免疫疾病如红斑狼疮、多发性硬化症等的有效试剂盒或检测手段。

发明内容
本发明的目的就是提供一种GADD45β蛋白及其相关细胞因子在类风湿关节炎中的应用。
本发明目的是提供一种有效的辅助检测或辅助检测类风湿关节炎的方法和试剂盒。
本发明提供了一种GADD45β蛋白及其相关细胞因子和细胞凋亡的用途，用于制备检测或辅助检测类风湿关节炎的试剂，其中，所述的试剂包括GADD45β蛋白核酸和细胞因子、GADD45β蛋白下游激酶中的一种或其组合，所述相关细胞因子包括IFNr，TNFa，IL-12，18。
本发明提供了一种检测类风湿关节炎的试剂盒，它含有容器和位于容器内的检测GADD45β核酸或蛋白含量的试剂。优选的，所述检测GADD45β核酸和蛋白含量的试剂是特异性扩增GADD45β蛋白的寡核苷酸引物或特异性抗GADD45β蛋白的抗体，所述的引物见序列表，为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，其中，SEQID NO.1、SEQID NO.2分别为GAPDH的上游和下游引物；SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4为GADD45β的上游和下游引物，用于扩增GADD45β基因序列。
在一优选例中，所述的试剂盒还含有检测下游激酶状态的试剂，其中所述的激酶选自激酶包括MAPKs的ERK、P-38和JNK。而所述的检测下游激酶状态的试剂是特异性抗磷酸化激酶的抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有检测TNF-α或IFN-γ含量的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有检测IL-12，IL-18的试剂。
本发明机理及研究图1RA病人滑膜组织与正常人滑膜组织中基因U133A基因芯片表达谱。
本研究利用Afmetrix公司的人类全基因组基因芯片U133A对类风关组织的基因表达谱进行了全面分析，为本研究中类风关疾病的易感基因发展机制提供有意义的基因谱。病变滑膜组织来自膝关节置换手术。正常人滑膜组织来自于关节镜手术。将滑膜组织无菌取自手术台，置于无血清1640培养液中，尽快送至实验室。于超净台内剪成小块后立即进行mRNA并逆转录为cDNA并进行标记，然后与基因芯片杂交。由于在基因芯片的筛选研究中，杂交信号经计算机处理、分析，即可得到样本中的基因表达谱信息和样本之间的基因表达差异。鉴于基因芯片以上优点，该技术自建立以来，立即引起了学者们的广泛关注，并已成为当今生命科学研究中最受欢迎的技术之。
图1显示了用转录组学-基因表达-单色基因芯片技术对RA病人的滑膜组织约38000个基因的表达谱进行检测。并与正常人相同组织基因表达谱做对照。下图中，每个点代表一种基因红色点代表两者共同表达的基因，蓝色点代表有一种基因表达有差异，黄色点代表两者均无此基因的表达。结果提示RA患者与正常人相比有很多有显著差异表达的基因，但表达增高4倍以上的基因仅为30个左右(左侧纵坐标的log2-10区域内的蓝点所示)。
分析后发现有约30个基因在RA中表达增高4倍以上，其中GADD45β表达明显增高。
图2.基因芯片检测RA滑膜组织中GADD45β的表达情况将基因芯片中所检测的RA患者滑膜组织中的GADD45β的表达量与正常人的滑膜组织相比，可见RA的GADD45β的表达量增高，是正常人的9.6倍。
图3.不同来源的单个核细胞GADD45β的表达。从60例RA患者外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞抽提RNA，定量PCR分析。对照单个核细胞来自20个健康志愿者。GADD45β表达量用同一样本GAPDH的表达量标准化。相对量表达用ΔΔCT表示。GADD45β基因的相对含量用2-ΔΔCT计算。结果表明，在RA患者的单个核细胞的GADD45β基因的相对含量比正常人高，而在RA的组织中，以滑膜中的单个核细胞的GADD45β基因的相对含量最高。
图4.RA患者T细胞中GADD45β基因的相对含量表达格局。用磁珠从10例RA患者外周血来源的单个核细胞分离T细胞，采用特异性抗CD3单抗标记后，用流式细胞仪检测所分离T细胞纯度超过97％。抽提RNA，定量PCR分析。对照T细胞来自10个健康志愿者。GADD45β表达量用同一样本GAPDH的表达量标准化。相对量表达用ΔΔCT表示。GADD45β基因的相对含量用2-ΔΔCT计算。结果表明，在RA患者的T细胞的GADD45β基因的相对含量比正常人高至少3倍。
图5.RA患者T细胞亚群中GADD45β基因的相对含量表达格局用磁珠从RA和正常人外周血中分离出CD4+T细胞和CD8+T细胞，用采用特异性抗CD4和CD8单抗标记后，用流式细胞仪检测所分离CD4+T细胞和CD8+T细胞纯度超过97％。用定量PCR分析GADD45β蛋白表达量。A.结果表明，GADD45β主要表达在CD4+T细胞中，RA患者CD4+T细胞中GADD45β表达量十分明显，而CD8+T细胞中表达无明显变化。在所有图例中，星号代表在不同组别中比较具有统计学意义(p＜0.05)。B.在RA患者的CD4+T细胞的GADD45β基因的相对含量比正常人CD4+T细胞高，而在RA的组织中，以滑膜中的CD4+T细胞的GADD45β基因的相对含量最高。
图6.显示了用RA关节滑膜液刺激后单个核细胞和CD4+T细胞中GADD45β蛋白mRNA表达的分析结果。从RA患者关节中无菌抽取的滑膜液，经离心去除组织碎片之后，将3-5份滑膜液混匀之后加入至正常人外周血单个核细胞和CD4+T细胞中，分别在2小时、4小时、6小时、8小时、16小时、24小时检测GADD45β表达量，结果发现，当将滑膜液以1∶8比例的稀释加入上述细胞后，GADD45β表达从2小时开始增高，在8小时时达到高峰。然后缓慢下降，在24小时时基本恢复到初始水平。表明RA的关节滑液具有刺激正常人单个核细胞和CD4+T细胞中GADD45β表达上调的作用。
A.正常人的PBMC在不同浓度的RA-SF及相应的血清刺激下GADD45β蛋白表达的剂量曲线。当滑膜液被稀释为1∶16时，刺激作用基本消失。
B.磁珠分离外周血CD2+T细胞(纯度大于97％)，1∶8稀释的RA-SF经过滤后分别加到随机选择的10个正常人和10个RA病人(年龄、性别相对应)的PBMC中。在不同的时间收取细胞进行实时定量PCR检测GADD45β蛋白核酸的表达情况。图中所示数据代表了用不同病人的RA-SF进行的四个独立实验的结果。用RA病人和正常人的CD4+T细胞的实验也得到相同的结果。GADD45β蛋白表达的计算方法同图1说明所述。
图7.GADD45β蛋白mRNA表达增高与单个核细胞和CD4+T细胞在体外存活的时间呈正相关。从RA患者关节中无菌抽取的滑膜液，经离心去除组织碎片之后，将3-5份滑膜液混匀之后加入至正常人外周血单个核细胞和CD4+T细胞中，分别在下列时间检测GADD45β蛋白mRNA表达0h，2h，4h，8h，16h。在24小时、48小时、72小时、96小时、120小时用Avinnex V和PI染色细胞检测细胞凋亡的发生情况，同时以正常人血清作为对照。结果发现，加有以1∶8比例稀释的滑膜液的细胞，无论是正常人还是RA病人中，GADD45β蛋白mRNA表达在2h即明显表达，但是，正常人细胞中的GADD45β蛋白mRNA表达在2小时后即迅速下降，而RA病人细胞中GADD45β蛋白mRNA表达下降十分缓慢，在16小时仍然维持较高水平(图A)。细胞出现凋亡的比例明显低于对照组细胞。提示GADD45β蛋白mRNA表达增高与单个核细胞和CD4+T细胞在体外存活的时间呈正相关。而RA患者关节液通过上调GADD45β蛋白mRNA表达维持正常人外周血中单个核细胞及CD4+T细胞在体外存活的时间(图B)，同样的研究结果在RA病人的外周血细胞中也得到证实(图C)。
用密度梯度离心分离到的外周血单个核细胞后，用磁珠分离外周血CD4+T细胞(纯度大于97％)，1∶8稀释的RA-SF经过滤后分别加到随机选择的6个正常人和6个RA病人(年龄、性别相对应)的PBMC和CD4+T细胞中。在不同的时间收取细胞进行Avinnex V和PI染色观察细胞凋亡情况。图中所示数据代表了用不同病人的RA-SF进行的三个独立实验的结果。
图8.RA患者关节液具有上调正常人外周血中单个核细胞及CD4+T细胞Fas蛋白的表达，而对FasL的表达无明显影响。从RA患者关节中无菌抽取的滑膜液，经离心去除组织碎片之后，将3-5份滑膜液混匀之后加入至正常人外周血单个核细胞和CD4+T细胞中，分别在24小时、48小时用实时定量PCR法检测Fas和FasL表达，同时以正常人血清作为对照。结果发现，加有以1∶8比例稀释的滑膜液的细胞中，细胞内的Fas基因转录出现在刺激后的4小时，在48小时达到高峰(图A)，而FasL在早期无明显变化，在与滑膜液共同孵育48小时后，FasL表达开始增加(图B)。用Fas和FasL的特异性单抗染色也证实了同样结果。
图9.GADD45β蛋白mRNA表达增高与外周血中单个核细胞及CD4+T细胞合成IL-12、IFN-r和IL-10的表达呈正相关，即对外周血中单个核细胞及CD4+T细胞中IL-12、IFN-r具有上调作用，但是对IL-10的表达没有明显作用。从RA患者关节中无菌抽取的滑膜液，经离心去除组织碎片之后，将3-5份滑膜液混匀之后加入至正常人外周血单个核细胞和CD4+T细胞中，用密度梯度离心分离到的外周血单个核细胞后，用磁珠分离外周血CD4+T细胞(纯度大于97％)，1∶8稀释的RA-SF经过滤后分别加到随机选择的6个正常人和6个RA病人(年龄、性别相对应)的PBMC和CD4+T细胞中。分别在2小时、4小时、6小时、8小时、16小时、24小时、48小时收取细胞进行实时定量PCR检测细胞因子的表达情况。结果发现，加有以1∶8比例稀释的滑膜液的细胞中，IL-12，TNF-α，IFN-γ的表达量随着细胞与滑膜液孵育的时间增加而表达，在24小时时达到高峰。而相比之下，IL-10的表达无明显变化。在本发明中，试验结果提示RA患者关节液通过刺激正常人GADD45β蛋白mRNA表达，促进外周血中单个核细胞及CD4+T细胞合成IL-12、IFN-r和IL-10的合成与表达，从而达到介导炎症反应的作用。
图10显示了用GADD45β特异性SiRNA干扰后，伴随着GADD45β表达的降低，IFN-γ和其它炎症因子如TNF-α、IL-12明显降低。将新鲜分离的人单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cells，PBMC)重悬到2.5×107、/ml的浓度，取40μl的细胞悬液(即1×106的细胞)放在24孔培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养。
GADD45β特异性SiRNA的转染转染试剂为脂质体geneporter和含抗生素的无血清成分1640溶液，转染体系(以24孔板为例)为250μl。
将12μl geneporter与113μl的1640(体积比为1∶6，总体积是125μl)轻轻混匀，室温静置3-5min；然后将2μl siRNA与123μl 1640轻轻混匀，(总体积125μl)室温静置3-5min；然后将混匀后的两种液体再轻轻混匀，室温静置约20-25min(不超过30min)。再将混匀的液体加到细胞悬液中，充分吹打使RNA-geneporter复合体与细胞充分混匀。在37℃，5％CO2培养箱中培养5-7小时后，加含等体积的20％FBS和含抗生素的1640营养液继续培养，24-48小时后，取培养的细胞做实时定量PCR，检测干扰的效果。结果表明，伴随着GADD45β表达的降低，IFN-γ和其它炎症因子如TNF-α、IL-12明显降低。
图10表明在用GADD45β特异性SiRNA干扰后，随着GADD45表达降低(图10A)，炎症因子IL-12，TNF-α，IFN-γ表达降低(图10B)，同时淋巴细胞凋亡明显增加(图10C)，Fas/FasL表达降低(图10D)。这些试验证实了GADD45β控制滑膜浸润炎性细胞分泌产生炎性因子，GADD45β的活化与否与局部炎症环境有非常大的关系。GADD45β在滑膜浸润T细胞中的持续性活化并通过Fas/FasL介导的途径抑制凋亡、外周血致病性T细胞的分化、极化、抑制凋亡、及其效应紧密相关。通过下调GADD45β可以起到抑制致病性T细胞活化的作用。RA患者的滑膜液和外周血IL-12，IL-18能刺激T细胞中GADD45β的表达增高，进而向Th1型分化、抑制IL-10分泌和T细胞凋亡、并刺激分泌IFN-γ和IL-12，引起炎症反应。使用RNA干扰的方法可以阻断此过程.这为以后的基因治疗和新药物的筛选提供了坚实的基础。
本发明阐明了GADD45β蛋白在RA炎症过程和其它自身免疫条件中的作用机制。研究表明，类风关外周血单个核细胞和CD4+T细胞的GADD45β蛋白表达明显增高，而正常人的外周血单个核细胞和CD4+T细胞的GADD45β蛋白表达能被炎症关节滑膜液所诱导。GADD45β蛋白表达增高提供了一种在类风关患者体内致病性T细胞持续活化过程中，起放大炎症的功能机制。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，首次发现GADD45β蛋白在病变的滑膜组织与细胞中的高表达，而且用体外病变滑膜液刺激的方法表明外周血T细胞上的过表达与局部炎症环境有非常大的关系，GADD45β蛋白作为一种重要介质在类风湿关节炎患者病程中起了非常重要的作用。研究表明，GADD45β蛋白mRNA在RA患者关节滑膜液CD4+T细胞上高表达，与患者的病情严重程度相关联。GADD45β蛋白在CD4+T细胞上的持续性高表达与关节局部滑膜液中的高水平的炎症因子(IL-12，18)有关。RA患者的SF和IL-12均能刺激T细胞使GADD45β蛋白表达增高。GADD45β蛋白可以通过活化上调IFN-γ、IL-12和抑制IL-10分泌的方式，诱导Th1细胞分化并分泌IFN-γ来介导致病性T细胞的功能。
本发明的主要优点在于(a)为类风湿关节炎的诊断或辅助诊断提供准确、高效的检测方法。
(b)提供了有效筛选类风湿关节炎治疗药物的新方法。


图1.RA病人滑膜组织与正常人滑膜组织中基因U133A基因芯片表达谱。
图2.基因芯片检测RA滑膜组织中GADD45β的表达情况。
图3.不同来源的单个核细胞GADD45β的表达图4.RA患者T细胞中GADD45β基因的相对含量表达格局。
图5.RA患者T细胞亚群中GADD45β基因的相对含量表达格局图6.显示了用RA关节滑膜液刺激后单个核细胞和CD4+T细胞中GADD45β蛋白mRNA表达的分析结果。
图7.GADD45β蛋白mRNA表达增高与单个核细胞和CD4+T细胞在体外存活的时间呈正相关。
图8.RA患者关节液具有上调正常人外周血中单个核细胞及CD4+T细胞Fas蛋白的表达，而对FasL的表达无明显影响。
图9.GADD45β蛋白mRNA表达增高与外周血中单个核细胞及CD4+T细胞合成IL-12、IFN-r和IL-10的表达呈正相关，即对外周血中单个核细胞及CD4+T细胞中IL-12、IFN-γ具有上调作用，但是对IL-10的表达没有明显作用。
图10显示了用GADD45β特异性SiRNA干扰后，伴随着GADD45β表达的降低，IFN-γ和其它炎症因子如TNF-α、IL-12明显降低，淋巴细胞凋亡明显增加，Fas/FasL表达降低。
具体实施例方式
基于上述研究，本发明提供了一种检测GADD45β蛋白表达状态的用途，所述的GADD45β蛋白表达用于制备检测或辅助检测类风湿关节炎的试剂。
本发明还提供了一种检测类风湿关节炎的试剂盒，它含有容器和位于容器内的检测GADD45β蛋白含量的试剂，如特异性扩增GADD45β蛋白的寡核苷酸引物或特异性抗GADD45β蛋白的抗体。
此外，所述的检测试剂盒还含有检测IL-12，18、TNF-α或IFN-γ含量的试剂。
在本发明的试剂盒中，还可含有相应的特异性探针和/或PCR缓冲液等。
另一方面，本发明还涉及对GADD45β蛋白及其相关的炎性细胞因子，即IL-12，18、TNF-α或IFN-γ，或IL-12/18及其特异性的抗体，尤其是单克隆检测的抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
以GADD45β蛋白为例，“特异性”是指抗体能结合于GADD45β蛋白或片段。较佳地，指那些能与GADD45β蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
以GADD45β蛋白为例，“特异性”核酸或探针是指能与GADD45β蛋白mRNA特异性互补结合的片段。较佳地，指那些只能与GADD45β蛋白mRNA核酸或片段结合但不识别和结合于其它非相关蛋白核酸和mRNA分子的核酸或探针。本发明的核酸或探针可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
一种检测样品中是否存在GADD45β蛋白的方法是利用GADD45β蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与GADD45β蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在GADD45β蛋白。根据抗体复合物的数量，可以定量确定GADD45β蛋白的数量。
一种检测样品中是否存在GADD45β蛋白核酸mRNA的方法是利用GADD45β蛋白核酸的特异性探针或引物进行检测，它包括将样品与GADD45β蛋白特异性探针接触；观察是否形成复合物，形成了复合物就表示样品中存在GADD45β蛋白特异性核酸。根据核酸复合物的含量，可以定量确定GADD45β蛋白核酸的表达数量。
对于IL-12，18、TNF-α或IFN-γ的抗体，也都是本领域中已知的，可用常规方法制备，也可从在市场上购得。
在本发明中，还可以通过常规的核酸定量检测技术，如荧光实时PCR技术，来检测样品中GADD45β蛋白及其相关炎性因子IL-12，18、TNF-α或IFN-γ的水平。
以GADD45β蛋白为例，GADD45β蛋白的多核苷酸也可用于类风湿关节炎的早期辅助诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微数组(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)或者聚苯烯板上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用GADD45β蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GADD45β蛋白的转录产物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1RA检测方法患者和实验材料本研究共收集60例RA患者。所有患者均符合美国风湿病学会的诊断标准。RA患者性别比为女42人，男18人；疾病年限为15±12年。患者年龄为54±19岁。完整配对样本有25例，每位患者有外周血、关节液和关节滑膜组织。另外一组20例配对样本有关节液和血清(不含细胞)。对照外周血单个核细胞和血清来自20个健康志愿者，性别和年龄与RA组相似。在样本采集前1个月，患者没有用过免疫抑制剂和免疫调节剂。在样本收集前患者均签署知情同意书。研究流程符合研究公约。
滑膜组织来自滑膜切除术或关节镜手术。关节液3000rpm离心3分钟收集上清立刻-80℃保存。Ficoll分离RA患者关节液和外周血得单个核细胞，立即进行细胞培养。组织切成小块，立即匀浆抽提RNA。
RNA抽提和定量PCR用Qiagen公司Rneasy Mini试剂盒抽提总RNA。在纯化RNA过程中用DNA酶消化基因组DNA。RNA-80℃保存。用Qiagen公司Sensiscript RT试剂盒逆转录RNA样本。在cDNA合成中用随机引物。
用定量PCR SYBR方法检测GADD45β蛋白的mRNA表达，其特异性引物序列见表1。
表1.用于实时PCR分析的特异性引物

热循环条件包括起始50℃ 2分钟，随后95℃ 10分钟，2步PCR循环包括95℃ 15秒，60℃ 60秒，40个循环。数据收集，ABI 7900对资料作定量分析。GAPDH基因作为内参使不同标本总RNA量得以标准化。标本定量以GAPDH表达倍数表示。每个标本复孔平均值以阈值计算和表达(CT，每个PCR反应达到预定荧光阈值的循环数)。基因表达量用样本CT值和内参GAPDHCT值的差值来表示。相对量表达以ΔΔCT计算。基因相对表达量为2-ΔΔCT。滑膜组织单细胞悬液制备手术取下的滑膜组织立即放入含有10％胎牛血清和1％青链霉素的完全RPMI介质中，剪成小块。用Teflon Resin棒撵磨，用含有10％胎牛血清和1％青链霉素的完全RPMI介质反复冲洗，用70μm尼龙网过滤得到单细胞悬液。
CD4+和CD8+T细胞的分离和纯化将收集的细胞用含2％FCS(胎牛血清)的PBS洗涤一次，并按1×107cell/ml的浓度重悬在含2％FCS的PBS中。然后用Dynal beads阳选出CD2+，CD4+和CD8+T细胞。分离后，用流式分析阴性细胞，检测这些细胞中含CD2+，CD4+和CD8+T细胞的比例。阳选出的细胞一部分用来作纯度分析，其余的用来抽提RNA并做实时PCR检测。在所有实验中，阳选效率都在97％以上。CD2+，CD4+和CD8+T细胞的纯度也在97％以上。
T细胞刺激RA和正常人的PBMC，磁珠分离T细胞和CD4+T细胞后按每孔1×106个的数量放在24孔板上培养，用含10％的FBS和100U/ml青霉素和链霉素的RPMI 1640进行培养。在用RA-SF的刺激实验中，在培养液中加入RA-SF(1∶8稀释)。使用时，所有的RA-SF都要用Millex过滤器(Millipore公司)除菌。细胞在37℃，5％CO2的培养箱中培养2、4、8、16、24小时后收集。细胞收集后做实时PCR分析。在阻断实验中，抗人IL-12的单克隆抗体和同型对照抗体以10μg/ml的浓度加到用SF刺激的PBMC的培养液中。然后按照上面所述的过程处理。在研究特异性核酸和抗体阻断时，也采用相同的操作流程。
特异性SiRNA干扰试验为检测GADD45β蛋白特异性SiRNA对GADD45β蛋白核酸表达的抑制和相应的炎性因子及对细胞凋亡的作用，用GADD45β特异性SiRNA对细胞进行干扰。将新鲜分离的人单个核细胞(human peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)用GADD45β特异性SiRNA的转染后，在37℃，5％CO2培养箱中培养5-7小时，然后加含等体积的20％FBS和含抗生素的1640营养液继续培养24-48小时。取培养的细胞做实时定量PCR，检测干扰的效果。
统计分析各组之间基因表达的差异情况采用曼-惠特尼U检验(TheMann-Whitney U Test)分析。P值小于0.05表示有显著性差异。
结果结果如图1-9和表1所示。
(a)类风关滑膜中GADD45β蛋白mRNA和蛋白水平的表达状态用转录组学-基因表达-单色基因芯片技术对RA病人的滑膜组织约38000个基因的表达谱进行检测。并与正常人相同组织基因表达谱做对照。分析后发现有约30个基因在RA中表达增高4倍以上，其中GADD45β表达明显增高(图1)。将基因芯片中所检测的RA患者滑膜组织中的GADD45β的表达量与正常人的滑膜组织相比，可见RA的GADD45β的表达量增高，是正常人的9.6倍(图2)。外周血单个核细胞(PBMC)，滑膜液单个核细胞(SFMC)和滑膜组织来自临床RA患者，同时以健康人PBMC为对照。定量PCR检测SFMC中单个核细胞和同一RA患者滑膜组织单个核细胞GADD45β蛋白的表达与其自身PBMC和健康对照PBMC上GADD45β蛋白的表达，如图3所示在RA患者的单个核细胞的GADD45β基因的相对含量比正常人高，而在RA的组织中，以滑膜中的单个核细胞的GADD45β基因的相对含量最高(p＜0.01)。
如图4所示，用磁珠从10例RA患者外周血来源的单个核细胞分离T细胞，抽提RNA，定量PCR分析。对照T细胞来自10个健康志愿者。结果表明，在RA患者的T细胞的GADD45β基因的相对含量比正常人高至少3倍。进一步用磁珠从RA和正常人外周血中分离出CD4+T细胞和CD8T细胞，分析RA患者T细胞亚群中GADD45β基因的相对含量表达格局，结果表明，GADD45β主要表达在CD4+T细胞中，RA患者CD4+T细胞中GADD45β表达量十分明显(p＜0.05)，而CD8+T细胞中表达无明显变化。而在RA患者的CD4+T细胞的GADD45β基因的相对含量比正常人CD4+T细胞高，而在RA的组织中，以滑膜中的CD4+T细胞的GADD45β基因的相对含量最高(图5)。
(b)关节滑液和细胞因子能诱导GADD45β蛋白表达为了阐述T细胞上GADD45β蛋白的表达能否被含有不同细胞因子的关节液所诱导，随机抽取RA患者和健康志愿者外周血分离PBMC用于功能实验。首先体外分离PBMC，然后加入不同稀释倍数的关节液，随后分离CD4+T细胞，用定量PCR方法分析GADD45β蛋白mRNA的表达。研究中用RA关节滑膜液刺激后，分析单个核细胞和CD4+T细胞中GADD45β蛋白mRNA表达。结果发现，当将滑膜液以1∶8比例的稀释加入上述细胞后，GADD45β表达从2小时开始增高，在8小时时达到高峰。然后缓慢下降，在24小时时基本恢复到初始水平。表明RA的关节滑液具有刺激正常人单个核细胞和CD4+T细胞中GADD45β表达上调的作用(图6)。由于关节滑液中含有丰富的IL-12和IL-18，而IL-12和IL-18是GADD45β表达的有效诱导剂。此外，关节滑液中还含有TNF-α，IFN-γ，这些细胞因子均具有上调GADD45β表达的作用。因此，病变的关节滑液通过多种混合的细胞因子，诱导GADD45β的表达。
试验中，为了阐明GADD45β蛋白的过表达是否和类风关滑膜组织及外周血的炎症环境和细胞因子的关系，首先用用ELISA方法检测5种细胞因子浓度，在RA患者关节液和自身配对血清及正常对照血清中检测IL-18、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ。RA关节液和血清中IL-18和IL-12浓度比正常对照血清明显增高(p＜0.01)，而关节滑液中的TNFa和IFNr比RA患者血清高，即正常人血清要高。这一结果首先提示RA患者关节液中2种细胞因子的表达与T细胞GADD45β蛋白的表达相关，即；IL-12/18能刺激GADD45β蛋白的表达。IL-12/18刺激GADD45β蛋白的表达也主要在CD4+T细胞而不是CD8+T细胞。IL-12/18刺激CD4+T细胞，ELISA检测培养上清中IFN-γ浓度显著增加，与GADD45β蛋白的表达水平相关。IL-12/18刺激GADD45β蛋白表达的呈剂量依赖的方式并能部分被抗IL-12/18抗体所阻断，说明关节液中的IL-12/18的确或至少部分能诱导GADD45β蛋白的表达。
由于类风关患者外周血中IL-12/18的水平也比正常人显著增高，试验结果与滑膜液刺激的相似.这说明在中，晚期病人体内，全身性的炎症因子的增高，对于T细胞，尤其是CD4+T细胞的活化和效应的发挥是必需的。GADD45β蛋白起到衔接和放大作用，也是类风关全身症状产生的机制之一。
(c)诱导GADD45β蛋白表达能够延长T细胞在体外存活的时间在上述试验中，除了分析关节滑液对GADD45β表达上调的作用之外，还分析了与GADD45β表达上调的作用的相应结果，即细胞在体外存活的时间和相关蛋白表达。
将1∶8稀释的RA-SF分别加到随机选择的6个正常人和6个RA病人(年龄、性别相对应)的PBMC和CD4+T细胞中。在不同的时间收取细胞进行Avinnex V和PI染色观察细胞凋亡情况，同时以正常人血清作为对照。结果发现，加有以1∶8比例稀释的滑膜液的细胞中，细胞出现凋亡的比例明显低于对照组细胞。提示RA患者关节液具有维持正常人外周血中单个核细胞及CD4+T细胞在体外存活时间的作用。而对于目前公认的与细胞凋亡有关的基因表达情况进行分析，发现加入RA患者关节液具有上调正常人外周血中单个核细胞及CD4+T细胞Fas蛋白的表达，而对FasL的表达无明显影响。用Fas和FasL的特异性单抗染色也证实了同样结果。这一结果被用GADD45βSiRNA特异性干扰后的结果得到了验证。图10表明在用GADD45β特异性SiRNA干扰后，Fas表达也几乎消失，但FasL表达无明显变化。表明关节滑膜液可能通过上调细胞Fas表达，活化炎性细胞，而不促进其FasL表达结果，使其维持活化状态而持续在局部的存活，导致局部炎症和组织损伤。
(d)诱导GADD45β蛋白表达具有上调RA病人炎症因子表达的作用在上述试验中，伴随着关节液刺激RA患者外周血中单个核细胞及CD4+T细胞诱导GADD45β蛋白表达，这些细胞中的IL-12、IFN-r的表达上调，而IL-10的表达没有明显变化。如图9所示，加有以1∶8比例稀释的滑膜液的细胞中，IL-12，TNF-α，IFN-r的表达量随着细胞与滑膜液孵育的时间增加而表达，在24小时时达到高峰。而相比之下，IL-10的表达无明显变化。但是，当用关节液刺激正常人外周血中单个核细胞及CD4+T细胞诱导GADD45β蛋白表达时，这些细胞中的IL-10表达上调，而IL-12、IFN-r的表达没有明显变化。提示，正常人单个核细胞或CD4+T细胞在受到病灶滑膜液的刺激时，可以通过合成释放IL-10而抵抗炎症因子的作用，起到保护机体不受滑膜液的活化的作用。而RA病人的单个核细胞或CD4+T细胞对滑膜液的刺激作用十分敏感，表现为迅速合成释放炎症因子，加剧病灶的炎症作用。这种不同的反应格局，提示RA病人的调控发生紊乱。而炎症因子的合成增加直接与GADD45β的表达呈正相关，这点在GADD45β SiRNA特异性试验中得到证实。图10表明在用GADD45β特异性SiRNA干扰后，炎症因子IL-12，TNF-α，IFN-γ表达降低，淋巴细胞凋亡增加。
GADD45β蛋白是与细胞生存，分化和死亡密切相关的蛋白质.尤其在应激状态下，可以活化细胞内许多激酶，包括MAPKs途径的ERK，P38，以及JNK，来调节细胞的生长阻滞，损伤后修复.同时也是介导TGF-β功能的主要分子。在不同细胞中的功能也不相同。在T细胞中，是介导T细胞向Th1分化，分泌IFN-γ的关键分子。本发明结果证实了这一点。
讨论到目前为止，RA的病原和发病机制仍然不完全清楚。除了T细胞、B细胞和补体等因素的参与之外，在RA关节滑膜液中还存在许多促炎症因子和细胞凋亡抑制因子。它们相互作用形成一个复杂的调控网络，在RA的形成和发展中起重要作用。针对TNF-α的治疗在临床所取得的疗效已经充分证实了炎症因子的重要性。在RA关节滑膜液中找出一个维持这种调控网络的关键性的炎症因子对于认识RA的发病过程和开发新的治疗手段是有重要意义的。本研究首次对GADD45β在RA病人的表达情况作了系统研究，并对GADD45β与其它细胞因子间的作用和炎性细胞的凋亡作了深入研究。这些发现既有助于认识GADD45β在RA中的作用，也有助于认识它在其它炎症反应中的作用。
至今由于对自身反应性Th1细胞的早期活化研究较少，人们只是粗略知道T细胞被自身抗原活化而最终导致自身免疫病，但是究其调节机制知之甚少。如哪些蛋白或调控基因控制着自身反应性T细胞活化？是什么导致了自身反应性T细胞向Th1方向极化而导致了Th1/Th2平衡失调？调节Th1细胞早期活化因子是什么？这些活化的T细胞是如何在体内维持的？这些问题我们至今不能回答。而研究回答这些问题对于不仅对阐明RA乃至自身免疫病的发病机理有重要的理论意义，并且对于寻找RA生物治疗的靶点、新型药物的研发均具有重大的理论意义和应用价值。
本发明中，首先设计实验来估计GADD45β蛋白的异常表达与RA患者滑膜与外周血中CD4+T细胞活化，分化和效应间的关系，以及和细胞因子的关系。然后阐明在类风关滑膜中诱导GADD45β蛋白过表达的细胞因子和GADD45β蛋白在介导T细胞分泌IFN-γ等中的作用。
研究结果表明GADD45β蛋白在RA病人滑膜和外周血T细胞中的表达显著升高，与病程相关，并CD4+T细胞的表达较CD8+T细胞高，可以作为病情判断和预后评价的依据。在RA患者外周血和滑膜液中单个核细胞中检测到GADD45β表达量比正常人外周血中的GADD45β表达量高出8倍以上。更有意义的是，因为外周血的获取和检查更加实际，这为类风关的监测提供了可能。与类风关相关的炎症因子IL-18和IL-12在滑膜和血清中的表达均增加，且与GADD45β蛋白的增加水平相关。更为阻断GADD45β蛋白的表达和其介导的炎症因子的产生以及其它的众多功能，提供了可能。
序列表<110>上海交通大学医学院<120>GADD45β蛋白及其相关细胞因子在类风湿关节炎中的应用<130>demo<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>RNA<213>合成的<220>
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权利要求
1.一种GADD45β蛋白及其相关细胞因子在类风湿关节炎中的用途，用于制备检测或辅助检测类风湿关节炎的试剂，其中，所述的试剂包括GADD45β蛋白和细胞因子、GADD45β蛋白下游激酶中的一种或其组合，所述相关细胞因子包括上调GADD45β表达的作用IFNγ、TNFα和GADD45β表达的有效诱导剂IL-12，IL-18。
2.利用权利要求1所述的用途制备的一种试剂盒，它含有容器和位于容器内的检测GADD45β核酸或蛋白含量的试剂，所述的检测GADD45β核酸和蛋白含量的试剂是特异性扩增GADD45β蛋白的寡核苷酸引物或特异性抗GADD45β蛋白的抗体，所述引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEO ID NO.4，其中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2分别为GAPDH的上游和下游引物；SEQID NO.3、SEQ ID NO.4为GADD45 β的上游和下游引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，含有检测下游激酶状态的试剂，其中所述的激酶选自激酶包括MAPKs的ERK、P-38和JNK，而所述的检测下游激酶状态的试剂是特异性抗磷酸化激酶的抗体。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有检测IL-12/18，TNF-α或IFN-γ中一种或其组合含量的试剂。
5.利用权利要求1所述的用途检测类风湿关节炎的方法第一，患者和实验材料准备收集RA患者，所有患者均符合美国风湿病学会的诊断标准；完整配对样本中，每位患者有外周血、关节液和关节滑膜组织，另外一组例配对样本有关节液和血清，但不含细胞；对照T细胞和血清来自健康志愿者，性别和年龄与RA组相似；滑膜组织来自滑膜切除术或关节镜手术，组织切成小块，分离单个核细胞或立即匀浆抽提RNA；关节液3000rpm离心3分钟收集上清立刻-80℃保存；Ficoll分离RA患者关节液和外周血得单个核细胞，立即进行细胞培养，或直接用于RNA抽提；第二，RNA抽提和定量PCR用Qiagen公司Rneasy Mini试剂盒抽提总RNA，在纯化RNA过程中用DNA酶消化基因组DNA，RNA-80℃保存，用RT试剂盒逆转录RNA样本，在cDNA合成中用随机引物；用定量PCR SYBR方法检测GADD45β蛋白的mRNA表达，其特异性引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4；热循环条件包括起始50℃ 2分钟，随后95℃ 10分钟，2步PCR循环包括95℃ 15秒，60℃ 60秒，40个循环；数据收集，ABI7900对资料作定量分析；以GAPDH基因作为内参，标本定量以GAPDH表达倍数表示；每个标本复孔平均值以阈值计算和表达；基因表达量用样本CT值和内参GAPDH CT值的差值来表示，相对量表达以ΔΔCT计算，基因相对表达量为2-ΔΔCT；第三，ELISA检测外周血与关节液细胞因子蛋白含量用ELISA Kit定量检测血清和关节液中的细胞因子浓度；首先用纯化的抗细胞因子小鼠抗体包板，洗涤后用含10％胎牛血清的PBS封闭非特异性结合位点1小时，随后洗涤；关节液或血清和标准品一起用PBS稀释后加入，每份标本均作双复孔；板孵育2小时，随后用PBS-T洗涤；加入生物素结合的检测抗体孵育2小时；洗涤后，加入Avidin结合的辣根过氧化物酶和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine)显色，以合适波长检测，用计算机软件定量分析细胞因子浓度；第四，滑膜组织单细胞悬液制备手术取下的滑膜组织立即放入含有10％胎牛血清和1％青链霉素的完全RPMI介质中，剪成小块后撵磨，用含有10％胎牛血清和1％青链霉素的完全RPMI介质反复冲洗，用70μm尼龙网过滤得到单细胞悬液；第五，CD4+和CD8+T细胞的分离和纯化将收集的细胞用含2％胎牛血清(FCS)的PBS洗涤一次，并按1×107cell/ml的浓度重悬在含2％FCS的PBS中；然后用Dynal beads阳选出CD2+，CD4+和CD8+T细胞；分离后，用流式细胞仪，检测这些细胞中含CD2+，CD4+和CD8+T细胞的比例；阳选出的细胞一部分用来作纯度分析，其余的用来抽提RNA并做实时PCR检测；第六，T细胞刺激RA和正常人的PBMC，磁珠分离T细胞和CD4+T细胞后按每孔1×106个的数量放在24孔板上培养，用含10％的FBS和100U/ml青霉素和链霉素的RPMI 1640进行培养；再用RA-SF的刺激实验中，在培养液中加入RA-SF，以1∶8稀释；使用时，所有的RA-SF都要用过滤器除菌；细胞在37℃，5％CO2的培养箱中培养2、4、8、16、24小时后收集；细胞收集后做实时定量PCR分析；在阻断实验中，抗人IL-12的单克隆抗体和同型对照抗体以10μg/ml的浓度加到用SF刺激的PBMC的培养液中；然后按照上面所述的过程处理；第七，特异性SiRNA干扰试验，用GADD45β特异性SiRNA对细胞进行干扰将新鲜分离的人单个核细胞(human peripheral blood mononuclearcells，PBMC)用GADD45β特异性SiRNA转染后，在37℃，5％CO2培养箱中培养5-7小时，然后加含等体积的20％FBS和含抗生素的1640营养液继续培养24-48小时。取培养的细胞做实时定量PCR，检测干扰的效果；最后，各组之间基因表达的差异情况采用曼-惠特尼U检验分析，P值小于0.05表示有显著性差异。
6.利用权利要求1建立的一种筛选治疗类风湿关节炎和抗肿瘤的药物的方法，其特征在于，包括步骤(a)设立实验组和对照组，所述的实验组由2-50个非人哺乳动物类风湿关节炎模型构成，而对照组由1-50个非人哺乳动物类风湿关节炎和模型构成，并且对于对照组不施用候选物质；(b)将候选物质施用于实验组，并观察实验组动物中GADD45β核酸和蛋白的水平，并与对照组的动物中的GADD45β核酸和蛋白进行比较，其中与对照组相比实验组动物中GADD45β核酸和蛋白水平下降不小于30％，就表示该候选物质是潜在的治疗类风湿关节炎的药物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于其中与对照组相比实验组动物中GADD45β核酸和蛋白水平下降不小于50％，就表示该候选物质是较佳的治疗类风湿关节炎的药物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于其中与对照组相比实验组动物中GADD45β核酸和蛋白水平下降不小于60％，就表示该候选物质是更佳的治疗类风湿关节炎的药物。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于其中与对照组相比实验组动物中GADD45β核酸和蛋白水平下降不小于70％，就表示该候选物质是最佳的治疗类风湿关节炎的药物。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中还包括进一步比较实验组动物和对照组蛋白中GADD45β蛋白或IL-12的表达水平，所述的GADD45β蛋白下游激酶选自MAPKs途径的ERK、P-38和JNK，其中与对照组相比实验组动物中激酶活化水平或IFN-γ，或IL-12水平下降不小于30％，就表示该候选物质是潜在的治疗类风湿关节炎的药物。
全文摘要
本发明涉及GADD45β蛋白及其相关细胞因子在类风湿关节炎中的应用，尤其是涉及GADD45β蛋白及其相关细胞因子在生物检测和诊断方法的用途，具体地说，本发明涉及一种在类风湿关节炎的发病过程中起重要作用的蛋白－GADD45β蛋白及其相关的细胞因子、下游的激酶和抑制剂在诊断或治疗类风湿关节炎上的用途。本发明还提供了相应的诊断试剂盒。一种GADD45β蛋白及其相关细胞因子在类风湿关节炎中的用途，用于制备检测或辅助检测类风湿关节炎的试剂，其中，所述的试剂包括GADD45β蛋白和细胞因子、GADD45β蛋白下游激酶中的一种或其组合，所述相关细胞因子包括上调GADD45β表达的作用IFNγ、TNFα和GADD45β表达的有效诱导剂IL－12，IL－18。
文档编号C07K14/435GK101093221SQ200710004549
公开日2007年12月26日 申请日期2007年1月8日 优先权日2006年3月13日
发明者李宁丽, 张冬青, 王利, 何东仪, 沈佰华 申请人:上海交通大学医学院