一种用于清除血浆致病抗体的免疫吸附剂及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种用于清除血浆致病抗体的免疫吸附剂及其制备方法。

背景技术：

自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力等)的发生、发展与机体免疫耐受丢失后，异常存在的自身抗体和循环免疫复合物密切相关。免疫吸附疗法是近年发展起来的特异性清除体内致病抗体和免疫复合物，用于辅助缓解疾病症状和控制病情进程的治疗手段。

目前临床应用免疫吸附剂均采用生物亲和高分子材料固载吸附功能基合成免疫吸附材料，利用功能基的特性实现对致病抗体的吸附。如固载蛋白a和抗igg抗体的蛋白类功能基，由于其优良的生物亲和性，在临床应用中较为广泛，immunosorba(fresenius,germany)和ig-therasorb(miltenyi，germany)是目前临床应用较多的蛋白类功能基免疫吸附剂，国内也有相关研究(中国专利：200610035470.7)，这类吸附剂由于功能基与抗体之间较强的亲和识别能力，在临床应用中用于去除自身抗体，治疗相关自身免疫性疾病。但是由于这类吸附剂采用生物活性蛋白质为功能基，其在产品实现和使用过程中存在无法忽视的缺陷，如在产品合成、保存过程中功能基容易变性失活，同时存在难以灭菌和功能基易脱落、容易引发免疫反应的问题，且蛋白质类功能基生产成本高，纯化过程复杂。另一类应用较多的是固载疏水氨基酸为功能基的吸附剂，如immusorbaph和tr(asahi，janpan)为临床应用较多的以苯丙氨酸和色氨酸为功能基的吸附剂，国内专利(201210023961.5)也有相关研究，此类采用小分子化合物为功能基的吸附剂，优点在于结构相对稳定、价格便宜；但是由于电荷和疏水作用的相互制约，以及环氧活化密度和空间位阻的限制，导致其吸附容量较低，治疗效果有限。

目前市场上还没有通过高密度偶联小分子功能基，实现抗体快速吸附-洗脱，可以反复利用的医用吸附剂。现有的两种吸附剂：蛋白类功能基虽然可以通过反复再生实现致病抗体的大量去除，但是蛋白偶联取向复杂，且蛋白不同功能区对抗体亲和力不同，使其在应用过程中难以针对不同类型致病抗体实现全面去除；氨基酸类功能基吸附剂合成简单，但是与抗体亲和力有限，同时利用环氧活化固载配给密度较低，分子偶联柔性不够，导致吸附容量较低。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于清除血浆致病抗体的免疫吸附剂及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：一种用于清除血浆致病抗体的免疫吸附剂，其多羟基吸附载体上通过间隔臂高密度偶联有小分子功能配基，所述小分子功能配基的偶联密度为160～180μmol/g湿态载体。

具体地，本发明利用共价偶联的方式将小分子功能配基接枝于吸附载体材料上，活化方式为高密度活化，同时利用偶联间隔臂以实现小分子功能配基的柔性连接，增加小分子功能配基在吸附过程中的自由度和链的柔性，可以使小分子功能配基和致病抗体快速结合，减少整个吸附载体的空间位阻，提高功能配基稳定性、吸附容量和选择性。

作为上述方案的进一步改进，所述小分子功能配基为2-巯基-1-甲基咪唑；所述间隔臂选自3,3-二氨基二丙基胺或己二胺。

作为上述方案的进一步改进，所述多羟基吸附载体选自琼脂糖凝胶、纤维素凝胶、聚乙烯醇凝胶中的其中一种。具体地，本发明要求所述吸附载体材料具有良好的机械性能，耐受有机溶剂清洗，耐受灭菌条件。本发明中所述多羟基吸附载体的粒径范围为45～180μm，截留分子量为150000～4000000。

一种如上所述的用于清除血浆致病抗体的免疫吸附剂的制备方法，其包括如下步骤：

通过羰基二咪唑或溴化氰高密度活化处理多羟基吸附载体；

固载间隔臂分子；

间隔臂分子末端基团上固载小分子功能配基；

作为上述制备方法的进一步改进，所述通过羰基二咪唑高密度活化处理多羟基吸附载体过程中，先加入与多羟基吸附载体等质量体积的无水丙酮，悬浆搅拌均匀，再称取羰基二咪唑加入反应体系中，通过调节羰基二咪唑的用量在0.05～0.1g/g多羟基吸附载体之间，活化处理时间为2h。

作为上述制备方法的进一步改进，所述通过溴化氰高密度活化处理多羟基吸附载体过程中，先加入与多羟基吸附载体等体积的碳酸钠溶液，悬浆搅拌均匀，再按体积比为溴化氰：乙腈＝1:0.5配制好溴化氰的乙腈溶液，并缓慢滴加到反应容器中，至溴化氰与多羟基吸附载体的质量比为0.05～0.1之间，停止滴加，室温搅拌3～5min。

作为上述制备方法的进一步改进，所述间隔臂分子为3,3-二氨基二丙基胺或己二胺。

作为上述制备方法的进一步改进，所述小分子功能配基为2-巯基-1-甲基咪唑。

本发明的有益效果是：本发明采用非氨基酸类的、对自身抗体和免疫复合物有较好选择性和较高吸附容量的小分子化合物，通过高密度活化和利用间隔臂克服疏水氨基酸功能配基吸附容量低、不能再生重复利用的缺点。同时，利用抗体类物质的亲硫作用原理，在合成过程中利用生成的硫醚键，进一步增加该免疫吸附剂对致病抗体的吸附容量。本发明所述制备的免疫吸附剂可以一次性使用也可以再生多次使用。

附图说明

图1为实施例1～4试样igg浓度与吸附时间的关系；

图2为实施例1～4试样重复使用性能测试结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。

本发明所述的免疫吸附剂可按如下步骤实现：

(1)对多羟基吸附载体的活化处理

a、采用羰基二咪唑(cdi)活化

将多羟基吸附载体用丙酮清洗干净，待多羟基吸附载体中水分完全置换干净后，用砂芯漏斗抽干，称取一定质量的多羟基吸附载体置于圆底烧瓶中，按质量体积比1:1加入无水丙酮，悬浆搅拌均匀；称取羰基二咪唑加入反应体系中，通过调节cdi的用量在0.05～0.1g/g多羟基吸附载体之间，活化2h，反应完成后用丙酮清洗干净未反应的活化剂；

b、采用溴化氰活化多羟基吸附载体

称取一定量的多羟基吸附载体于通风橱中，用2mol/l的碳酸钠溶液清洗多羟基吸附载体后用砂芯漏斗抽干，置于圆底烧瓶中，将体积比1:1称量加入2mol/l的碳酸钠溶液，悬浆搅拌均匀，将配制好的溴化氰的乙腈溶液(溴化氰：乙腈＝1:0.5)，缓慢滴加到反应容器中，至溴化氰与多羟基吸附载体的质量比为0.05～0.1之间，停止滴加；室温搅拌3～5min，用冷水清洗活化后凝胶，去除残留活化剂和乙腈。

(2)以3,3-二氨基二丙基胺(dadpa)或己二胺为间隔臂

a、无水环境cdi活化的多羟基吸附载体清洗干净后，按质量体积比1:1加入无水丙酮，悬浆搅拌均匀，以0.2g/ml多羟基吸附载体的比例加入间隔臂分子，在丙酮环境中搅拌反应3h；

b、水溶液中溴化氰活化的多羟基吸附载体以0.2g/ml多羟基吸附载体的比例加入间隔臂分子，在ph8.5、0.1mol/l的碳酸钠缓冲液中反应3h；

(3)将间隔臂末端氨基与溴乙酸反应

利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐实现溴乙酸和末端氨基的缩合反应，获得末端溴乙酰基团。用ph4.5mes缓冲液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为终浓度10mg/ml的溶液，将上述连接间隔臂的交联琼脂糖凝胶按体积比1:1，悬浮于反应液中，以0.1g/g载体的比例加入溴乙酸，搅拌反应4h，反应完成后依次用ph4.5mes缓冲液、水、1mol/lnacl和水清多羟基吸附载体；

(4)偶联mmi

配制0.1g/ml的mmi水溶液，避光条件下，将载体材料按1:1的比例加入到mmi水溶液中，悬浆搅拌4h。利用末端溴乙酰基团与mmi巯基反应，将功能基固载于载体上。

实施例1

(1)羰基二咪唑活化交联琼脂糖凝胶

在100ml丙酮溶液中，加入5g羰基二咪唑溶解完全后，搅拌下加入50g交联琼脂糖凝胶，搅拌悬浮载体，反应2h；反应完成后用丙酮充分清洗。

(2)连接间隔臂

10g的3,3-二氨基二丙基胺(dadpa)溶于100ml丙酮中，加入活化后交联琼脂糖凝胶50g，搅拌反应3h。

(3)偶联2-巯基-1-甲基咪唑

用ph4.5的mes缓冲液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为终浓度10mg/ml，加入5g溴乙酸，将上述连接间隔臂的交联琼脂糖凝胶悬浮于反应液中，反应4h；注射水清洗干净后，加入到0.1g/ml的mmi水溶液中，搅拌反应4h，注射水清洗干净。

实施例2

(1)羰基二咪唑活化交联琼脂糖凝胶

在100ml丙酮溶液中，加入10g羰基二咪唑溶解完全后，搅拌下加入50g交联琼脂糖凝胶，搅拌悬浮载体，反应2h；反应完成后用丙酮充分清洗。

(2)连接间隔臂

10g的3,3-二氨基二丙基胺(dadpa)溶于100ml丙酮中，加入活化后交联琼脂糖凝胶50g，搅拌反应3h。

(3)偶联2-巯基-1-甲基咪唑

用ph4.5的mes缓冲液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为终浓度10mg/ml，加入5g溴乙酸，将上述连接间隔臂的交联琼脂糖凝胶悬浮于反应液中，反应4h；注射水清洗干净后，加入到0.1g/ml的mmi水溶液中，搅拌反应4h，注射水清洗干净。

实施例3

(1)溴化氰活化交联琼脂糖凝胶

用2mol/l的碳酸钠溶液清洗载体后抽干，将50ml载体以体积比1:1悬浮于2mol/l的碳酸钠溶液中，加入溴化氰的乙腈溶液，(溴化氰：乙腈＝1:0.5)，室温搅拌3～5min，用冷水清洗活化后凝胶。

(2)连接间隔臂

10g的3,3-二氨基二丙基胺(dadpa)溶于100ml丙酮中，加入活化后交联琼脂糖凝胶50g，搅拌反应3h。

(3)偶联2-巯基-1-甲基咪唑

用ph的4.5mes缓冲液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为终浓度10mg/ml，加入5g溴乙酸，将上述连接间隔臂的交联琼脂糖凝胶悬浮于反应液中，反应4h；注射水清洗干净后，加入到0.1g/ml的mmi水溶液中，搅拌反应4h，注射水清洗干净。

实施例4

(1)溴化氰活化交联琼脂糖凝胶

用2mol/l的碳酸钠溶液清洗载体后抽干，将50ml载体以体积比1:1悬浮于2mol/l的碳酸钠溶液中，加入溴化氰的乙腈溶液，(溴化氰：乙腈＝1:0.5)，室温搅拌3～5min，用冷水清洗活化后凝胶。

(2)连接间隔臂

10g己二胺溶于100ml丙酮中，加入活化后交联琼脂糖凝胶50g，搅拌反应3h。

(3)偶联2-巯基-1-甲基咪唑

用ph4.5的mes缓冲液溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为终浓度10mg/ml，加入5g溴乙酸，将上述连接间隔臂的交联琼脂糖凝胶悬浮于反应液中，反应4h；注射水清洗干净后，加入到0.1g/ml的mmi水溶液中，搅拌反应4h，注射水清洗干净。

实施例5：血浆igg的快速吸附测试

分别取上述实施例1～4所制得的免疫吸附剂3g，加入30ml血浆中，摇床振荡吸附(37℃，100±10rpm)，分别于吸附开始后10min、20min、30min、60min和120min取样检测igg浓度，结果附图1。由附图1测试结果可以看出，本发明制备得的免疫吸附剂在与血浆接触吸附30min即可达到吸附平衡，吸附速度快。

实施例6：静态吸附免疫球蛋白g(igg)试验

分别取上述实施例1～4所制得的免疫吸附剂3g，加入30ml血浆中，摇床振荡吸附30min(37℃，100±10rpm)，检测血浆igg浓度，计算吸附剂对其清除率。

表1免疫吸附剂对免疫球蛋白g的清除率

由表1数据可以看出，本发明制备得的免疫吸附剂均对igg有高容量吸附，去除效果明显，活化率提高吸附量增加。

实施例7：静态吸附类风湿因子(rf)试验

分别取4份类风湿因子超标的人血浆样品30ml，加入上述实施例1～4所制得的免疫吸附剂3g，摇床振荡吸附30min(37℃，100±10rpm)，检测吸附前后血浆rf含量变化。

表2静态吸附类风湿因子(rf)试验

由表2试验结果表明，本发明制备得的免疫吸附剂对类风湿因子具有高效吸附能力。

实施例8：静态吸附抗核抗体(ana)试验

分别取4份抗核抗体滴度超标的人血浆样品30ml，加入上述实施例1～4所制得的免疫吸附剂3g，摇床振荡吸附30min(37℃，100±10rpm)，检测吸附前后血浆抗核抗体滴度含量变化。

表3静态吸附抗核抗体(ana)试验

由表3数据可以看出，本发明制备得的免疫吸附剂对血浆抗核抗体吸附效果明显。

实施例9：吸附剂重复使用性能

分别取上述实施例1～4所制得的免疫吸附剂3g，加入30ml血浆中，摇床振荡吸附30min(37℃，100±10rpm)，取样检测血浆igg浓度，然后离心上述吸附剂，弃去上清，按体积比1:1加入ph2.3柠檬酸缓冲液(含0.9％nacl)，振荡5～10min，抽滤，重复上述操作3次后用生理盐水清洗吸附剂，至ph为中性，抽干；加入30ml血浆中，摇床振荡吸附2h(37℃，100±10rpm)，取样检测血浆igg浓度。如此反复吸附—解吸6次，考察吸附剂再生使用性能，结果如附图2所示，其结果表明本发明所制备得的免疫吸附剂在重复使用6次吸附性能下降较少，平均下降2.0％，可以重复再生使用。

实施例10：吸附剂灭菌后吸附性能测试

分别取上述实施例1～4所制得的免疫吸附剂3g，加入30ml注射水，密封；高压蒸汽灭菌(121℃，60min)，清洗干净，抽干；加入30ml血浆摇床振荡吸附30min(37℃，100±10rpm)，取样检测igg浓度，与实施例6结果对比如下表4：

表4吸附剂灭菌后吸附性能测试

由表4数据可以看出，本发明制备得的免疫吸附剂可以耐受高压蒸汽灭菌，保持吸附能力。

上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。