转化生长因子β1调控蛋白P311的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学治疗技术领域，具体涉及一种转化生长因子β UTGFβ 1)调 控蛋白Ρ311的应用。
【背景技术】
[0002] β型转化生长因子（TGF-β)超家族属于调节型细胞因子家族，包含至少30个 成员，大致可分为 TGF β/Activin/Nodal 亚家族和 BMP (bone morphogenetic protein)/ GDF(growth and differentiation factor)/MIS(muellerian inhibiting substance) 亚家族。哺乳动物TGF0分为TGF0 1、TGF0 2和TGF0 3三种异构体，其中TGF01的含 量最多，其研宄最为广泛而透彻。生物体内至少存在三种形式的TGF0 1蛋白：同源二聚 体存在的超大前体 TGF β I (proTGF β 1)、与 latent-associated protein (LAP)结合的 TGF0 1(LAP-TGF0 1)、活性 TGF0 1。只有活性 TGF0 I 可以与 TGF0 II 型受体结 合并使其激活，之后激活TGF β I型受体（Τ β RI)，后者可以使Smad2和Smad3磷酸化，进而 入核调控相关基因表达，这就是经典的TGF β /Smad通路。研宄表明，TGF β 1在调节细胞增 殖、分化、凋亡、自噬、粘附、细胞外基质合成与分泌、胚胎发生、组织修复、炎性反应、纤维化 和肿瘤中起着重要的作用。因此，调控TGF β 1的合成和生物学功能可能是各种以TGF β 1 为主要发病机制的相关疾病的另一治疗策略。
[0003] 目前关于TGF β 1的相关临床治疗主要为针对TGF β /Smad通路不同环节的的抑制 剂。这种治疗策略的缺点在于治疗时机偏晚，多在TGFM明显升高激活下游通路后，而此 时多种病理改变已经发生，甚至不可逆。因此，寻找一种TGF β 1的上游调控蛋白，对于及早 控制和抑制TGF β 1的合成，将TGF β 1消灭在"萌芽"阶段，从而减慢和改善病情进展具有 重要的临床意义。研宄表明，TGFM的合成和生物学功能受到多种因素的共同调节。这些 因素主要包括各种细胞因子（TGF^ 1、TNFa、INFy、INFa、TOGF-BB、bFGF等）、转录因子 (SPUAP1等）、化学物质（全反式维甲酸等）。但他们本身也可以产生其他生物学效应，甚 至引发过度炎症反应，因此并未在临床广泛应用。P311基因于1993年最初在小鼠脑和肌肉 组织中发现，表达产生8kDa大小的胞浆蛋白，N末端含有PEST结构域，并且其生物学功能 不明确，未能归入任何已知蛋白家族。最近研宄表明，P311可能参与了神经系统和呼吸系 统发育以及血压维持。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是为治疗以TGFf3 1为主要发病机制的相关疾病提供一 种新选择。
[0005] 本发明提供了调控蛋白P311在制备调控转化生长因子β 1表达的药物中的用途。
[0006] 具体的，所述的调控蛋白Ρ311具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列。
[0007] 具体的，编码调控蛋白P311的基因具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
[0008] 本发明还提供了特异调控转化生长因子β 1合成的药物，其主要活性成分为P311 蛋白。
[0009] 具体的，所述的P311蛋白具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列。
[0010] 具体的，编码P311蛋白的基因具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。
[0011] SEQ ID No. 1P311蛋白的氨基酸序列：
[0012] mvyypelfvw vsqepfpnkd megrlpkgrl pvpkevnrkk ndetnaaslt plgsseIrsp risylhff
[0013] SEQ ID No. 2编码P311蛋白的核甘酸序列：
[0014] atggtttatta cccagaactc tttgtctggg tcagtcaaga accatttcca aacaaggaca tggagggaag gcttcctaag ggaagacttc ctgtcccaaa ggaagtgaac cgcaagaaga acgatgagac aaacgctgcc tccctgactc cactgggcag cagtgaactc cgctccccaa gaatcagtta cctccacttt ttttaa
[0015] 本发明的P311蛋白可通过常规的蛋白表达和纯化技术获得。可以常规制成胶囊、 喷雾，也可交联于各种生物材料，也可搭载于经过基因改造后的细胞和生物载体，这些制作 工艺可通过商业化途径或标准的制作流程获得。搭载所述P311蛋白的各种药物载体，只需 按照常规使用，无需特殊操作，本领域的临床医生能够结合本产品特点正确使用。
[0016] 首先，通过P311腺病毒转染使表皮干细胞高表达P311，发现P311蛋白可以降低 TGFI3 ImRNA的水平，但升高LAP-TGFI3 1和活性TGFI3 1蛋白水平（图1)。然后通过分子 生物学技术，发现P311可以通过结合于TGF β 13' -UTR区来促进TGF β 1的蛋白翻译（图 2)。然后，体外证实Ρ311可以发挥类似于TGFf3 1的促进表皮干细胞向肌成纤维细胞转分 化的作用，并且可被TGF β 1的特异抑制剂所抑制（图3)。最后，通过恢复实验发现，外源性 TGFf3 1可以恢复Ρ311敲除引起的细胞功能缺陷（图4)。综上，发明人发现并证实了 Ρ311 蛋白可以促进TGFf3 1的蛋白表达，并可发挥类似于TGFf3 1的生物学效应。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明发现了一种新的TGFf3 1调控蛋白Ρ311，高表达于增生性瘢痕的小分子蛋 白。Ρ311蛋白仅有8kda，易于进行药物搭载。Ρ311分子结构中含有PEST结构，易于在发 挥效应后及时降解，避免过度刺激引发的副反应。因此，P311蛋白是一种理想的用于调控 TGFf3 1的小分子药物。本发明发现并证实了 P311蛋白可以促进TGFf3 1的合成，并发挥与 TGF β 1类似的生物学效应。本发明从调控具有多种生物学特性的TGF β 1入手，发现了新的 特异调控蛋白Ρ311蛋白。本发明发现的Ρ311蛋白将会为各种以TGFf3 1为主要发病机制 的疾病尤其是纤维化和肿瘤提供一种新的治疗策略，将为各种纤维化患者和肿瘤患者等带 来福音，具有广阔的应用和市场前景。
【附图说明】
[0019] 图1、Ρ311对小鼠表皮干细胞中TGFβ 1的影响。Α、免疫印迹检测细胞内TGFβ 1 前体和活性TGFf3 1蛋白的水平。Β、活性TGFf3 1蛋白灰度值分析。**，Ρ〈0. 01，与空载体组 相比。C、前体TGFM蛋白灰度值分析。**，Ρ〈0. 01，与空载体组相比。D、酶联免疫法检测 细胞培养上清内总TGFI3 1水平。*，Ρ〈0. 05,与野生型组相比。Ε、实时定量PCR检测TGF0 1 mRNA水平。*，Ρ〈0. 05,与空载体组相比。F、实时定量PCR检测TGF0I型受体mRNA水平。 *，P〈0. 05,与空载体组相比。G、实时定量PCR检测TGF0II型受体mRNA水平。**，P〈0. 01， 与空载体组相比。
[0020] 图2、P311调控TGF0 1合成的机制。A、P311对TGF0 1启动子活性的影响。*， P〈0. 05,与空载体组和空白对照组相比。B、P311对TGF0 1 mRNA稳定性的影响。C、P311 对TGF β 15' /3' -UTR活性的影响。*，P〈0. 05,与空载体组相比。
[0021] 图3、P311发挥类似TGF β 1的转分化作用并可被TGF β 1抑制剂阻断。A、相差显 微镜观察表皮干细胞形态变化。LY2109761是T β RI和T β RII的特异抑制剂。Β、免疫荧光 染色观察α-平滑肌肌动蛋白和上皮细胞钙粘蛋白的表达。C、定量分析α-平滑肌肌动蛋 白阳性细胞比例。**，Ρ〈〇. 01，与空载体组相比；##，Ρ〈〇. 01，与Ρ311高表达组相比。D、上 皮细胞钙粘蛋白阳性细胞比例。**，P〈〇.