猪肌肉生长抑制素基因打靶载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种猪肌肉生长抑制素基因打靶 载体及其应用。
【背景技术】
[0002] 肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN)是转化生长因子0 (Transforming Growth Factor-0，TGF-0)超家族成员，是一种作为肌肉生长负调控因子的分泌型蛋白。在胚胎 发育过程中，MSTN在生肌节细胞和发育的骨骼肌中表达，调控形成肌纤维的最后数量。在 成年动物体内，MSTN主要在骨骼肌中特异表达，并控制肌纤维的生长。MSTN的基因敲除和 自然纯合突变在小鼠、牛、狗和人类中均表现出骨骼肌的显著增加。
[0003]MSTN是以一种前体蛋白的形式被合成出来，经过一系列蛋白水解过程产生具有 生物活性的分子，或称其为成熟区域。第一次水解去除了由24个氨基酸组成的信号肽，这 个信号肽对于蛋白进入分泌旁路是必需的。然后，在位于第240-243位氨基酸的RSRR(精 氨酸-丝氨酸-精氨酸-精氨酸）位点发生第二次水解，产生一个分子量27, 680道尔顿的 N-端片段(称为前肽）以及12, 400道尔顿大小的C-端片段。根据对其它TGF-0成员的了 解，推测前肽对于C-端区域正确折叠成为半胱氨酸结构具有重要的作用。而C-端片断是 具有生物活性的部分。它通过二硫键连接形成C-端片段二聚体，并且折叠为半胱氨酸结结 构，继而发挥作用。
[0004] 肌肉生长抑制素基因人工敲除的小鼠（McPherronAC等，1997， nature. 387:83-90)，表现出骨骼肌显著、广泛的增加，包括胸部、前肢、后肢以及整个身体 被层，单个肌肉重量约为野生型小鼠的二倍。所有被检的骨骼肌都受到了基因突变的影响 而发生了增加，并且雄性和雌性增加与其体型和体重按一定比例。对纯合突变小鼠肌肉制 备的切片观察分析则表明这些小鼠既有肌纤维数量的增多，又有肌纤维的肥大，肌肉量的 增加是肌纤维数量以及肌纤维大小增加的双重结果。
[0005] 根据MSTN的生物学功能，提示对于MSTN基因的敲除可以成为农业生产中一种增 加肌肉的有效策略。通过基因打靶技术，将该基因失活，是研究其功能和和验证其生产应用 价值的理想手段。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种猪肌肉生长抑制素基因打靶载体及其应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的一种猪肌肉生长抑制素基因打靶载体，该载体依 次含有至少8.7kb的猪肌肉生长抑制素基因同源左臂、两端含LoxP位点的正筛选标记、至 少1.6kb的猪肌肉生长抑制素基因同源右臂，以及负筛选标记。
[0008] 所述猪肌肉生长抑制素基因同源左臂的核苷酸序列含有至少4. 6kb的猪肌肉生 长抑制素基因外显子1上游序列、全部外显子1序列、全部内含子1序列、全部外显子2序 列、以及至少1.6kb的内含子2序列，所述猪肌肉生长抑制素基因同源右臂的核苷酸序列含 有从猪肌肉生长抑制素基因外显子3中第312bp至基因下游的至少1. 5kb的DNA序列。
[0009] 所述的基因打靶载体，正筛选标记插入猪肌肉生长抑制素基因的位点为猪肌肉生 长抑制素基因外显子区域。
[0010] 所述的基因打靶载体，正筛选标记为新霉素素抗性基因。
[0011] 所述的基因打靶载体，负筛选标记为白喉毒素A基因。
[0012] 本发明还提供一种肌肉生长抑制素基因敲除的猪细胞系，将根据上述方法所述基 因打靶载体转染到与打靶载体同源臂DNA来源相同的猪细胞系中，获得经鉴定为肌肉生长 抑制素基因敲除的猪细胞系。
[0013] 本发明还提供一种制备肌肉生长抑制素基因敲除的猪克隆胚胎的方法，将根据上 述方法所述基因打靶载体转染到与打靶载体同源臂DNA来源相同的细胞系中，获得猪肌肉 生长抑制素基因敲除的转基因细胞，以所述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细 胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
[0014] 其中，所述与打靶载体同源臂DNA来源相同的细胞系为猪成纤维细胞系、猪输卵 管上皮细胞系、猪卵巢上皮细胞系、猪颗粒细胞系等。
[0015] 本发明进一步提供一种制备肌肉生长抑制素基因敲除家畜的方法，其是将根据上 述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得基因敲除家畜。
[0016] 本发明提供的猪肌肉生长抑制素基因打靶载体以及基于该打靶载体建立的肌肉 生长抑制素基因敲除猪的生产方法，肌肉生长抑制素基因敲除猪的肌肉生长量明显提高， 具有较大的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例1中猪肌肉生长抑制素基因打靶载体构建过程。
[0018] 图2为本发明实施例1中猪肌肉生长抑制素基因打靶载体pPNLPD-MSTNl结构框 架图，含有9. 9kb的MSTN基因同源左臂、两端含LoxP位点的正筛选标记基因、2. 6kb的MSTN 基因同源右臂和负筛选标记的基因表达框。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0020] 实施例1MSTN基因打靶载体的构建
[0021] 构建MSTN基因打靶载体的步骤，包括以目标生物基因组为模板，PCR扩增MSTN基 因同源左臂和同源右臂，用含LoxP位点的标记基因将同源左臂和右臂连接，即构建成基因 打靶载体。MSTN基因打靶载体主要包括9. 9kb的MSTN基因同源左臂、两端含LoxP位点的 正筛选标记基因、2. 6kb的MSTN基因同源右臂和负筛选标记。正筛选标记基因如新霉素抗 性基因（NE0)等，负筛选标记基因如白喉毒素A基因（diphtheriatoxinA，DTA)等，具体 构建过程如下：
[0022] 取生产性能测定优良的种猪耳组织，采用组织块接种法建立猪成纤维细胞系，细 胞系命名为DLK001，常规细胞传代以及冷冻保存。细胞培养、传代及冷冻保存方法详见《精 编细胞生物学实验指南》（J.S.博尼费斯农等著，章静波等译，2007年，科学出版社)。建立 成纤维细胞系也可以采用长白猪、大白猪等其它品种的猪组织进行培养获得，也可选用其 它类型细胞系，如输卵管上皮细胞、卵巢上皮细胞、颗粒细胞等。
[0023] 同源左臂（ZB)扩增：利用已公布的猪基因组序列（GenBank:丽_003612282)，设 计同源左臂，ZB-F:5'-TATCCGC/GGCAATCAGAATAGGAATGGGAACTT-3'，下划线部分 为SacII限制性内切酶识别位点；ZB-R:5'-TATGC/GGCCGCACGTAACAGTTTGAGAAGGT AGT-3'，下划线部分为NotI限制性内切酶识别位点。提取上述成纤维细胞系DLK001基 因组DNA，以该基因组DNA为模板进行长片段PCR扩增，同源左臂1的PCR扩增产物长度为 9961bp，包含了MSTN基因外显子1上游5798bp、外显子1、内含子1、外显子2、内含子2中 1608bp的片段序列。同时按照上述方法，扩增了同源左臂2,其长度为8678bp，含MSTN基因 外显子1上游4515bp、外显子1、内含子1、外显子2、内含子2中1608bp的片段序列。
[0024]同源右臂（YB)扩增引物分别为：YB-F:5'-TATG/CTAGCCAGACAGGGTACTCTCAA CAATAG-3'，下划线部分为NheI限制性内切酶识别位点；YB-R: 5'-TATG/TCGACTGCAAC TCAGTAGCCTGAAAAGTT-3'，下划线部分为SalI限制性内切酶识别位点。扩增产物长 度为2635bp，包含了从外显子3中312bp至基因下游2323bp的序列，为同源右臂1。同时 按照上述方法，扩增了同源右臂2,其长度为1495bp，包含了从外显子3中312bp至基因下 游