通过抑制成骨阻抑基因控制骨发生的制作方法

专利名称：：通过抑制成骨阻抑基因控制骨发生的制作方法通过抑制成骨阻抑基因控制骨发生相关申请的交叉引用本申请要求于2006年8月11日提交的美国申请号60/822,184的权益，将其全部内容作为参考引入本文。
背景技术：
：认为组织-特异性(或成熟)干细胞是正常组织体内稳态和组织修复的来源。它们还为再生医学提供了巨大前景，这归因于它们增殖和分化为多种成熟细胞类型的能力。人间充质干细胞(hMSCs)能够分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和神经细胞。然而，没有很好地理解解释这些分化过程的分子机制。RNA-介导的干扰(RNAi)是高度保守的基因沉默事件，其通过由同源双链小干扰RNA(siRNA)引起的单独mRNA革fi破坏起作用(Fire，A.等，^然("AtoM9391:806-811(1998))。已经证明了通过化学合成和经由基于载体的表达系统的体外或体内转录生成的siRNA是研究哺乳动物细胞中基因功能丧失的非常有效的工具(Brummelkamp,T.R.等，辟学C"'e"cd296:550-553(2002);Caplen,N.J.等，夷房嵐家辟学腐学叛OVociV^Mc^C/W;98:9742-9747(2001);Elbashir,S.M.等，^然(M^J411:494-498(2001);Lee,N.S.等，^然生激发术A0fec/7"0U20:500-505(2002);Miyagishi,M.等，y^然全激发术OV^5/Wec/z"o〃20:497-500(2002):Paddison,P.J.等，基茵发fTGe"^6:948-958(2002);Paul,C.P.等，^然生激发术r7VW祝ofec/z"o/J20:505-508(2002);Sui，G.等，夷房M^辨学綜学叛CracAto"c^/^SW"&4;99:5515-5520(2002);Yu,J.Y,等，夷房房^^弃学綜学叛(T^ocA^/v4cad&ZL/iSyO99:6047-6052(2002))。虽然成功地在哺乳动物细胞中进行了利用基因组规模siRNA文库的高通量筛选(Berns,K.等，y^然(7Va"rc,428:431-437(2004);Paddison,P.J.等，^然fVflwre」428:427-431(2004);Zheng,L.等，夷房M^辨学綜学叛OVociVa/3JcaJSc/[75*^0103:135-140(2004))，但是尚未报告阵列合成siRNA文库在干细胞中的有效应用。能够容易地从成年人中分离人间充质干细胞(hMSCs)，并迅速体外扩增。由于它们分化为不同成熟细胞类型的能力(Prockop，D.J.^然f激发术(7V^历ofec/7朋/J20:791-792(2002);Ryan，J.M.等，炎i^^,若(7/"/JawmJ(Lond)2:8(2005))(Campagnoli,C,等，虛,(^/ooJJ98:2396-2402(2001);Dezawa,M.等，辟学Cc/e"cd309:314-317(2005);Dezawa，M.等，aC7/"/m^〃113:1701-1710(2004);Pittenger,M.F.等,辨学r5We"cd284:143-147(1999);Pittenger,M.F.等,翁l银究fOc/^W95:9-20(2004);Woodbury，D.等，辨经辨学银究染,吉A^wYwc/7eW61:364-370(2000))，所以探索关于退化性疾病包括骨病症的以细胞为基础的治疗法的研究者对它们非常感兴趣(Dezawa,M.等，辨学J309:314-317(2005);Dezawa,M.等，游^^^^^^志aC//"/"vm〃113:1701-1710(2004);Horwitz,E.M.等，夷,M^搏学綜学叛。rac7Vw/t/W999:8932-8937(2002);Pittenger,M.F.等，薪l,究fOc95:9-20(2004);Prockop，D.J.辨学^'e"ce;>276:71-74(1997))。细胞从干细胞自我-更新到分化的命运转换不仅涉及正向调节基因，也涉及通常抑制分化的反向调节基因。存在对这样的方法学的需要，所述方法学影响间充质干细胞，例如向成骨细胞谱系细胞的分化途径。本发明解决这个以及其他需要。发明简述本发明提供筛选这样的试剂的方法，所述试剂通过抑制一种或多种表1中所列出的多肽的活性或表达而促进骨发生。本发明还提供通过抑制一种或多种表1中所列出的多肽的活性或表达而在细胞中促进骨发生的方法。因此，在第一方面，本发明提供用于鉴别促进骨发生的试剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)使多种试剂与表1中所列出的至少一种多肽或多核苷酸相接触；(b)测量至少一种所述多肽或多核苷酸的活性；(c)选择所述多种试剂中的至少一种，其中所选择的试剂抑制至少一4种所述多肽或多核苷酸的活性；和(d)测量所选择的试剂促进骨发生的能力，由此鉴别促进骨发生的试剂。在一些实施方案中，所述多肽或多核苷酸在宿主细胞中表达。在另一个实施方案中，所述方法包括(a)使多种试剂与表达至少一种选自表1的多肽或多核苷酸的细胞接触；(b)测量至少一种所述多肽或多核苷酸的表达(即，转录或翻译)；(c)选择所述多种试剂中的至少一种，其中所选择的试剂抑制至少一种所述多肽或多核苷酸的表达；和(d)测量所选择的试剂促进骨发生的能力，由此鉴别促进骨发生的试剂。在所述筛选方法的一些实施方案中，所述测量步骤(b)包括测量转录水平。在所述筛选方法的一些实施方案中，所述测量步骤(d)在体外进行。在一些实施方案中，所述测量步骤(d)在体内进行。接触和测量步骤中使用的细胞可以是原核的或真核的。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如，干细胞或间充质干细胞。在另一方面，本发明提供用于促进细胞内骨发生的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述细胞与抑制至少一种选自表l中的基因产物表达的siRNA相接触。在相关的方面中，本发明提供用于促进细胞内骨发生的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使所述细胞与抑制选自表1中的多肽活性的试剂相接触。关于促进哺乳动物细胞内骨发生的实施方案，在一些实施方案中，在体内执行本方法。在一些实施方案中，在体外执行本方法。在一些实施方案中，先体外后体内执行本方法。在所述筛选和处理方法的一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞是间充质干细胞。附图简述图1举例说明hMSC中的siRNA转染效率高于90%。被siTOX成功转染的细胞经历程序性细胞死亡，而被非-TOXsiRNA转染的细胞保持存活。图2举例说明鉴别和确认诱导hMSC成骨分化的siRNA击中(hit):a.碱性磷酸酶活性，如通过染色显示地，与对照siRNA转染的细胞相比，在击中siRNA(hitsiRNA)转染的或OS处理的细胞中受到上调作用。b.早期(Cbfal和Osx但非Dk5)和晚期(Bsp)成骨标记的表达在转染或OS处理后3天时制备的不同击中siRNA或OS处理的样品中受到区别性诱导。c.与击中siRNA和siCon共-转染的细胞相比，ALP活性在击中siRNA和siCbfal共-转染细胞中降低。d.在siRNA转染后36小时观察到靶基因的表达击倒。OS，成骨分化培养基；Osx，osterix。图3举例说明与被siCon转染的细胞相比，在被精选的击中siRNA转染的hMSC中增强的碱性磷酸酶活性染色。图4举例说明利用siADK或siCon以及随后OS连续处理hMSC证明siADK对比siCon对骨细胞成熟的增强作用。2+60S,OS处理从siRNA转染后2天时开始，并持续6天。类似的縮写应用于3+50S和4+40S。利用茜素红溶液染色细胞以获得磷酸钙沉积。图5举例说明大多数成骨击中siRNAs增强骨细胞成熟，但是抑制hMSC的脂肪形成分化。a.如通过茜素红染色所证明地，全部12种选择的击中siRNAs,除siMJD和siTBX3夕卜，当与OS处理相结合时，增强骨细胞成熟，b.基于油红O染色，全部12种选择的击中siRNAs,除siGNAS外，抑制在siRNA转染后第二天受到脂肪形成诱导培养基处理的hMSC的脂肪形成分化。siCon,对照siRNA;OS,成骨诱导培养基；3+90S,OS处理从siRNA转染后3天时开始并持续9天。图6举例说明组合siKCNTl和siSLC12a2转染对增强由OS诱导的骨细胞成熟过程具有协同效应(茜素红染)。1+130S，在siRNA转染后1天时利用OS处理细胞，并且处理持续13天。OS,成骨诱导培养基。图7举例说明细胞内cAMP信号传导在hMSC中的成骨对比脂肪形成分化中起相反的作用。a.腺苷酸环化酶激动剂毛喉素以剂量依赖的方式抑制OS培养基对hMSC的成骨作用(a-c),而腺苷激酶抑制剂5-碘代杀结核菌素增强OS培养基的成骨作用(d-f,g-i)并以剂量依赖的方式抑制hMSC的脂肪形成分化(j-l).a-f，ALP染色；g-i，茜素红染色;j-l,油红o染色。b.利用cAMP类似物(DB-cAMP&CPT-cAMP)或IBMX的处理促进hMSC经历脂肪形成分化，特别是在存在地塞米松(DEX)的条件下。c.通过CPT-cAMP、IBMX或PGE2应用增强的cAMP水平能够在被OS处理的细胞中将细胞命运决定从成骨转变为脂肪形成分化。Adipo,脂肪形成的诱导培养基;OS,成骨诱导培养基。图8举例说明hMSC的成骨和脂肪形成分化二者都需要CREB活性。a.通过蛋白质印迹检查CREB蛋白质活性证明了与被siCon转染的细胞或未处理细胞相比，被击中siRNA转染的细胞中增高的pCREB水平。b.被与耙基因中内源CRE竞争的CRE(CREB响应元素)诱杀剂转染的细胞对脂肪形成诱导培养基(Adipo)或成骨诱导培养基(OS)的刺激具有较低的响应。图9举例说明hMSC成骨分化中涉及的另外的信号传导通路。a.仅在siRNA转染后第7天或第12天收集的被siMJD和OS处理而非被其他击中siRNA处理的样品中诱导了PLZF1的表达。b.由PD98059或SB202190引起的ERK1/2或p38信号通路的抑制分别抑制OS对hMSC的成骨诱导作用。c.p38的磷酸化形式在被siDUSP6转染的细胞中受到上调。OS，成骨诱导培养基。图10举例说明ATP对OS-诱导的hMSC骨发生，以及在与OS处理相结合时，对siP2RY11和siSLC12a2诱导的hMSC骨发生具有剂量-依赖性抑制作用。在siRNA转染后第3天时加入OS和ATP并持续一周。染色细胞，以获得碱性磷酸酶活性。OS,成骨诱导培养基。图11举例说明siCOMP促进hMSC的脂肪形成和成骨分化。上两排(第二排图是相对应上图的放大图)显示siCOMP处理增强由脂肪形成诱导培养基(Adipo)诱导的hMSC脂肪形成。在siRNA转染后第3天时利用Adipo处理细胞，并且在利用油红0染色细胞前持续处理12天。下排显示siCOMP诱导hMSC的成骨分化。在siRNA转染后9天时测定细胞的碱性磷酸酶活性。OS,成骨诱导培养基。发明详述I.概述筛选了耙向5,000种人基因的合成siRNA文库，从而鉴别成骨特化的内源阻抑物，其在沉默时起始hMSC向成骨细胞的分化。该筛选在hMSC中产生53种成骨特化阻抑基因。见，表l。此外，确定cAMP在骨发生对比脂肪形成中起相反的作用。本发明发现了在调整遗传网络控制骨发生和在治疗骨疾病中的用途。II.定义"骨发生",当用于本文时，指从未分化的干细胞和成骨细胞谱系的细胞向骨细胞增殖和骨组织生长(即，新骨基质的合成与沉积)。骨发生还指祖细胞或前体细胞向骨细胞(即，成骨细胞)的分化或转分化。祖细胞或前体细胞可以是多能干细胞，其包括，例如，间充质干细胞。祖细胞或前体细胞可以是预-定向为成骨细胞谱系的细胞(例如，前-成骨细胞的细胞)或没有预-定向为成骨细胞谱系的细胞(例如，前-脂肪细胞或成肌细胞)。术语"试剂"指在本文所述的筛选测定中有效的任何化合物。试剂可以是，例如，有机化合物、多肽(例如，肽或抗体)、核酸(例如，DNA、RNA、双链、单链、寡核苷酸、反义RNA,小抑制RNA、微小RNA、核糖核酸酶，等)、寡糖、脂质。通常，本筛选方法中使用的试剂具有小于10,000道尔顿的分子量，例如，小于8000，6000,4000,2000道尔顿。术语"测试化合物"或"药物候选者"或"调节剂"或语法等价物用于本文时描述任何天然存在的或合成的分子，例如，蛋白质，寡肽(例如，长度为约5-约25个氨基酸，优选地，长度为约10-20或12-18个氨基酸，优选地，长度为12、15、或18个氨基酸)、小有机分子、多糖、脂质，脂肪酸、多核苷酸、RNAi或siRNA、asRNA、寡核苷酸，等。所述测试化合物可以处于测试化合物文库的形式，诸如提供充足多样性范围的组合或随机化文库的形式。测试化合物任选地与融合配偶体，例如，耙标化合物、拯救化合物、二聚化合物、稳定化合物、可编址化合物、和其他官能部分相连。常规地，通过识别具有一些理想特性或活性，例如，抑制活性、构建主要8化合物的变体、和评估那些变体化合物特性和活性的测试化合物(叫作"主要化合物")生成具有有效特性的新化学个体。通常，在所述分析中使用高通量筛选(HTS)法。术语"短-抑制RNA"禾B"siRNA"可交替地指介导RNA干扰(也称为"RNA-介导的干扰，"或RNAi)的短双链RNA寡核苷酸。RNAi是通过由同源双链小干扰RNA(siRNA)引起的单独mRNA靶破坏起作用的高度保守的基因沉默事件(Fire，A.等，^然O^we9391:806-811(1998))。综述了RNAi的机制，例如，在Bayne和Allshire,遗传^^势0e"A(2005)21:370-73;Morris，细胞分子生命科学(CellMolLifeSci)(2005)62:3057-66;Filipowicz,等，薪/#/|7生激学观/^fCwre"fQp/w.ow&n/"Mra/(2005)15:331-41中。术语"活性"指对本领域中已知多肽普遍承认的功能。例如，表l中列出的多肽具有普遍承认的酶、受体、细胞黏附分子、细胞内信号传导介体等的活性。用于测量所列蛋白质活性的测定，包括酶活性测定、受体信号传导测定、受体-配体结合测定、细胞转移测定，是本领域中已知的。还可以将蛋白质活性与它的表达，例如，多肽转录或翻译联系起来。术语"促进"指与未处理的细胞(组织或受试者)相比，在处理的细胞(组织或受试者)中测量的参数(例如，活性、表达、骨发生)的增加。还可以对处理之前或之后的相同细胞或组织或受试者进行比较。该增加足以被检测到。在一些实施方案中,与未处理的细胞相比，处理的细胞中的增加是至少约50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍或更多。术语"抑制"指与未处理的细胞(组织或受试者)相比，在处理的细胞(组织或受试者)中测量的参数(例如，活性、表达、骨发生)的减小。还可以对处理之前或之后的相同细胞或组织或受试者进行比较。该减小足以被检测到。在一些实施方案中,与未处理的细胞相比，处理的细胞中的减小是至少约50%、60%、70%、80%、90%、或被完全抑制。在一些实施方案中，与未处理的细胞相比，在处理的细胞中测量的参数是不能检测到的(即，被完全抑制)。"干细胞"，当用于本文时，指能够分化成多细胞类型的任何哺乳动物多能(pluripotent)细胞或全能(multipotent)细胞或祖细胞或前体细胞。9适合于用在本发明方法中的干细胞包括能够分化为成骨细胞谱系的细胞，例如，成骨细胞的那些。本发明方法中使用的合适全能细胞或前体细胞包括，例如，间充质干细胞、前-成骨细胞、前-脂肪细胞、和成肌细胞。"分化(differentiate)"或"分化(differentiation)，"用于本文时，指前体或祖细胞(即，干细胞)分化为特定细胞类型如成骨细胞的过程。能够通过它们的基因表达和细胞表面蛋白质表达模式来识别分化的细胞。典型地,成骨细胞谱系的细胞表达基因，包括，例如，碱性磷酸酶、I型胶原、骨钙蛋白、和骨桥蛋白(osteoponin)。典型地，成骨细胞谱系的细胞表达骨特异性转录因子，包括，例如，Cbfal/Runx2和Osx(见，例如，Olsen,等，2000，见上和Nakashima等，潘應108(1):17-29(2002)。成骨细胞分化中涉及的其他转录因子包括，例如，gsc、Dlxl、Dlx5、Msxl、Cartl、Hoxal、Hoxa2、Hoxa3、Hoxbl、rae28、Twist、AP-2、Mfl、Paxl、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBX5、和Brachyury(见,例如，Olsen等，2000，见上)。"转分化"指预-定向为一种谱系细胞类型的前体或祖细胞(即，干细胞)分化为其他谱系特定细胞类型的过程，例如,前-脂肪细胞转分化为成骨细胞或成肌细胞转分化为成骨细胞。能够通过它们的基因表达和细胞表面蛋白质表达模式来识别转分化的细胞。典型地，成骨细胞谱系的细胞表达基因，包括，例如，碱性磷酸酶、I型骨胶原、骨钙蛋白、和骨桥蛋白。典型地，成骨细胞谱系的细胞表达骨特异性转录因子，包括，例如，Cbfal/Runx2禾口Osx(见，例如，01sen等，2000，见上和Nakashima等，见上)。成骨细胞分化中涉及的其他转录因子包括例如，gsc、Dlxl、Dlx5、Msxl、Cartl、Hoxal、Hoxa2、Hoxa3、Hoxbl、rae28、Twist、AP-2、Mfl、Paxl、Pax3、Pax9、TBX3、TBX4、TBX5、和Brachyury(见,例如，Olsen等，2000见上)。"固体支持物,"当与诱导骨发生相关地用于本文时，指能够在其上培养干细胞的三维基质或平面表面。所述固体支持物能够源自天然存在的物质(S卩，基于蛋白质的)或合成的物质。例如，基于天然存在的物质的基质可以由自体骨片段或如例如Clokie等，/W面手术杂志aCram'o/ac.Swgj13(1):111-21(2002)和Isaksson，薪處^"度^V吉潜7^CwWDe脱JSz^p/J84:1-46(1992)中所述的商购骨替代物组成。合适的合成基质记述在，例如,美国专利号5,041,138;5,512,474，和6,425,222中。例如，可生物降解的人10造聚合物，诸如聚乙二醇酸、聚原酸酯、或聚酐可以用于固体支持物。碳酸钙、文石、和多孔陶瓷(例如，致密的羟基磷灰石陶瓷)也适合用在固体支持物中。聚合物，诸如聚丙烯、聚乙二醇、和聚苯乙烯也能够用在固体支持物中。典型地，在三维基质固体支持物上培养和分化的细胞在该基质的所有表面上生长，例如，在内部和外部表面上生长。典型地，在平面固体支持物上培养和分化的细胞以单层生长。术语"多种"指两个或更多。III.筛选促进骨发生的试剂的方法使一种或多种多肽与一种或多种试剂相接触本发明提供筛选方法，其包括使至少一种表l中列出的多肽与作为抑制一种或多种表l中所列多肽的候选者的一种或多种试剂相接触。在一些实施方案中，筛选多种不同的试剂，例如，50，100,250,500，1000,10,000或更多种不同试剂。如需要地，所述多肽可以处于宿主细胞中、细胞提取物中或是被纯化的(例如，部分地，基本上地或完全地)。当测量，例如，结合活性或酶活性时，可以使用关于表l中多肽的抑制试剂的筛选测定，其中所述多肽不在宿主细胞中。例如，能够测量候选试剂抑制天然底物或配体结合的能力。在其他实施方案中，能够测量候选试剂抑制底物的酶消耗或产物积聚的能力。在一些实施方案中，将所述测定设计为通过自动化所述测定步骤和从待测定的任何方便来源提供化合物来筛选大组合文库,这典型地是平行运作的(例如，在机器人测定中以微滴定形式或在微孔板中)。所述组合文库可以是完全随机的，或包括含有基于一种或多种有前景的主要化合物的中心结构的成员。所述组合文库可以是完全合成的或可以包括一些或全部源自天然存在来源的成员，包括，例如，细菌，真菌，植物，昆虫和脊椎动物(例如，(青蛙)或J"gm7/a(鳗鱼))和无脊椎动物(例如，5Vra^y/oce^ra加(海胆)或软体动物).也见，Boldi,基f天然产激游jt^游资合游^^成广Com^"(3ton.a//Syw/Zzes^o/A^a^^a/尸nc/w"5asedZi6nan.&yJ,2006,CRC出版社(CRCPress)。在一个实施方案中，高通量筛选方法涉及提供含有大量潜在治疗化合物(潜在调节剂或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后，如本文中所述地，在一种或多种测定中筛选所述"组合化学文库"或"配体文库"，从而鉴别显示理想的特有活性的那些文库成员(具体地，化学物种或子集)。由此鉴别的化合物能够起到常规"主要化合物"的作用或其自身能够被用作潜在的或实际的治疗法。组合化学文库是通过组合大量化学"积木"诸如试剂，由化学合成或生物学合成产生的不同化学化合物的集合。例如，线性组合化学文库，诸如多肽文库是通过以各种可能的方式，针对给定化合物长度(即，多肽化合物中氨基酸的数量)，组合一组化学积木(氨基酸)而形成的。数百万化学化合物能够通过化学积木的这样组合混合而合成。制备和筛选组合化学文库是本领域中技术人员所熟知的。见，例如，美国专利号5,663,046;5,958,792;6,185,506;6,541,211;6,721,665,将其内容作为参考在此引入本文。所述组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见，例如，美国专利号5,010,175;Furka,房尿教,歪A廣,秀染^^7"./力7:487-493(1991);Houghton,等，^然(7Va/M力54:84-88(1991);和资合y^^b^#^;^案广ComW"aton.a/P印/cfe丄^ra/"7尸ratoco/J,Cabilly版本，1997,Humana出版社。还能够使用用于产生化学多样性文库的其他化学物质。所述化学物质包括，但不仅限于拟肽(例如，PCT公布号WO91/19735)、编码的肽(例如，PCT公布WO93/20242)，随机生物-低聚物(例如，PCT公布号WO92/00091)、苯二氮杂萆类(例如，美国专利号5,288,514)、多样体(diversomer)诸如乙内酰脲、苯二氮杂萆类和二肽(Hobbs等，夷房房家矜学腐学叛Wrac,Ato.^cadt/5^990:6909-6913(1993))、插烯(vinylogous)多肽(Hagihara等，夷房众学界染,志aC7zem.6bc.力14:6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽肽模拟物(nonpeptidalpeptidomimetics)(Hirschmann等,夷像众学界森吉CC7zem.Soc.J114:9217-9218(1992))、小化合物文库的类似有机合成(Chen等，夷房众学界染志"Ozem.5bcJ116:2661(1994);邀合jt^:合y^'j^遂，应尸ofew"a/J,Cortese版本，1995,WalterDeGruyter公司；禾卩Obrecht禾口Villalgordo,V、分^童众^激文,游慮沐-支游资合,^疗合成Sma〃-vWo/ecMAar-,/g/z/Cbm;xww(i丄Arar;;/esJ,1998,Elsevier禾斗学有限公司(ElsevierScienceLtd))、寡氨基甲酸酯(Cho等，辨学"c/ewce力61:1303(1993))、和/或肽基磷酸酯(Campbell等，有教众学染,吉aOg.Oze附J59:658(1994))、核酸文库(见Ausubel,见下，Sambrook和Russell,见下禾口美国专利号6,955,879;6,841,347;6,830,890;6,828,098;6,573,098;禾口6,399,334)、肽核酸文库(见,例如，美国专利号5,539,083;5,864,010和6,756,199)、抗体文库(见，例如，Vaughn等，^然全激发术^Vtowe5/otec/2"o/ogyJ,14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(见,例如，Liang等，辨学"c/ewce入274:1520-1522(1996);美国专利号5,593,853;和錄沐支獰激寡獰合成f/7资^薪/大众^激文,"o/W"6rao^W,Seeberger版本，2004,JohnWiley&Sons(E-book))、小有机分子文库(见，例如，苯二氮杂萆类，BaumC&EN,l月18日，第33页(1993)和美国专利号5,288,514;类异戊二烯,美国专利号5,569,588;噻唑烷酮(thiazolidinones)和间噻嗪烷酮(metathiazanones)，美国专利号5,549,974;吡咯烷，美国专利号5,525,735和5,519,134;吗啉代化合物，美国专利号5,506,337,等)。还见，邀全丈荦设^,伊份，药激凍紫^游嚴亂教伴工虞、浙应IfComZ>/afon.a/Zj'6rar_yZ)ew'gwaw<i￡Va/wa"ow:尸n'"cz)/es'Sq/h^we7bo&,y^/"c加'oraz'"Z>wgD/scove^J,Ghose，等,版本,2001,MarcelDekker;分f多摔丝，蕴合众学,文库浙秀激叛萦。kfo/ecw/wChaiken和Janda,版本，1996,牛津大学出版物(OxfordUnivPr.);,邀版本，2002,Humana出版社。可以商购获得用于制备组合文库的装置(见，例如，观/e众学发术6UvawcedC7zem7^c/z^，LouisvilleKY"Symphony,Rainin,Woburn,MA.,应用生物系统(AppliedBioSystems)，FosterCity,CA.,Millipore,Bedford,MA禾卩Caliper生命禾斗学(CaliperLifeSciences),Hopkinton,MA)。在一些实施方案中，能够在多孔板(例如，96-孔，384-孔，等)上方便地13进行筛选测定，其中分别在单孔中测试每种待筛选的试剂。在一些实施方案中，在单一反应混合物中测试两种或更多候选试剂。试剂所述筛选方法中使用的试剂可以是，例如，小的有机化合物(例如，分子量小于10,000道尔顿，例如，小于8000,6000，4000,2000道尔顿)、脂质、糖、多肽、核酸(例如，寡核苷酸、DNA、RNA、核糖核酸酶、短抑制RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA),等)。典型地,与细胞接触的抑制试剂的量是约0.05nM-约50^M,例如，约1nM-约1^M,约0.1)iM-约50pM,或约0.05nM,0.1nM,0.5nM,1.0nM,1.5nM,25nM,100nM,1.0^M，10(iM,或50岸。夯教众合笏在一些实施方案中，所述一种或多种试剂是小的有机化合物。基本上，在本发明的测定中可以将任何化学化合物作为一种或多种表1中多肽的潜在抑制剂进行筛选。最优选的通常是能够溶于水性或有机(具体地基于DMSO的)溶液的化合物和符合Lipinski的"第5规则"标准的化合物。将所述测定设计为通过自动化所述测定步骤和从待测定的任何方便来源提供化合物来筛选大化学文库，这典型地是平行运作的(例如，在机器人测定中以微滴定形式或在微孔板中)。应该理解存在许多化学化合物的供应商，包括西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，Mo.);FlukaChemika-BiochemicaAnalytika(Buchs瑞士),以及许多现成可用于筛选的小有机分子文库供应者，特别包括Chembridge公司(圣地亚哥，CA)、DiscoveryPartenersInternational(圣地亚哥,CA)、Triad治疗(TriadTherapeutics)(圣地亚哥，CA)、Nanosyn(MenloPark,CA)、Affymax(PaloAlto,CA)、ComGenex(南旧金山，CA)、Tripos,公司.(圣路易斯，MO)、反应生物公司(ReactionBiologyCorp.)(Maivern，PA)、BiomolIntl.(PlymouthMeeting,PA)、TimTec(Newark,DE)、禾卩AnalytiCon(Potsdam,德国)。多,微沐14在一些实施方案中，所述一种或多种试剂是多肽(包括但不仅限于具有8-30个氨基酸的肽、抗体，等)。有效用于筛选的多肽文库可商购自许多来源，例如，来自剑桥肽(CambridgePeptides),剑桥，英国；JPT肽技术(JPTPeptideTechnologies),柏林，德国；生物-合成(Bio-Synthesis),Lewisville,TX;和Presrwick化学(PresrwickChemical),华盛顿特区。用于生成肽文库的方法也是本领域中所熟知的。见，例如，^成^^iv使—賴(&"Ae"cPe/^/w^GWA)，Grant,版本，2002,牛津大学出版社(OxfordUniversityPress);Benoiton,,会成众学(C7z渭/欣y尸取油6y"r/^s&)，2005，CRC出版社；Jones，富^^^^7i合成"""'"o4c/dad尸印^fe^wAewS),2002,牛津大学出版社(OxfordUniversityPress)。肽合成器可以商购自，例如，TechniKrom,公司，Evanston,IL;应用生物系统(AppliedBioSyst画),FosterCity，CA;和高级自动化肽蛋白质技术(AdvancedAutomatedPeptideProteinTechnologies)(AAPPT)，Louisville,KY。在一些实施方案中，所述一种或多种试剂是抗体，包括多克隆或单克隆抗体，Fab片段，单链抗体(scFv),来自组合文库的互补区，等。有效用于筛选目的的组合抗体文库可以获自MorphoSys,Martinsried/Planegg,德国。用于生成抗体文库的方法在本领域中是已知的。鄉丝絲微在一些实施方案中，所述一种或多种试剂是抑制性寡核苷酸，包括反义寡核苷酸、核糖核酸酶、短抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)。随机化的寡核苷酸文库可以商购自，例如，完整DNA技术(IntegratedDNATechnologies)(IDT),Coralville,IA;Ambion，Austin,TX禾卩Qiagen,Valencia,CA。在一个实施方案中，所述抑制性寡核苷酸抑制一种或多种表1中列出的多肽的活性或表达水平。发义誠辦"反义"寡核苷酸与编码其的RNA序列以及DNA序列相对应，其与该反义RNA特异于的具体mRNA分子充分互补，从而导致反义RNA和mRNA之间的分子杂交，以使mRNA的翻译受到抑制。所述杂交可以发生在体外和体内条件下。所述反义分子必须对靶基因具有充足的互补性，这样该反义RNA能够与靶基因(或mRNA)杂交，并且无论该行为处于剪接、转录还是翻译水平，都抑制靶基因表达。在一些实施方案中，所述互补的反义序列长度为约15-30个核苷酸,例如，15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，27，28,29或30个核苷酸，或更长或更短，如所需地。本发明的反义成分可以能够与靶cDNA的若干部分的任一个，或与靶mRNA杂交，所述靶cDNA的若干部分包括编码序列、3'或5'未翻译区、或其他内含子序列。反义寡核苷酸可以包括能够与靶DNA的若干部分的任一个，或与靶mRNA杂交的序列，所述耙cDNA的若干部分包括编码序列、3'或5'未翻译区、或其他内含子序列。稀劍扁就微siRNA技术涉及能够发生在真核细胞中的序列-特异性转录后基因抑制过程。通常，该过程涉及由与所述序列同源的双链RNA(dsRNA)诱导的特殊序列的mRNA的降解。siRNA可以受到引入或表达相对短的同源dsRNA的影响。为了筛选的目的，用于在转录或翻译水平实施表达抑制的双链寡核苷酸可以具有任何方便的长度。siRNA分子典型地长度为约15-约30个核酸，例如，长度为约19-25个核酸，例如，长度为约15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，27,28，29,30个核酸。任选地，所述dsRNA寡核苷酸可以包括3'突出端末端。示范性2-核苷酸3'突出端可以由任何类型的核糖核酸残基组成，并可以由2'-脱氧胸苷残基组成，这降低RNA合成的成本并能够增强细胞培养基中和转染细胞内siRNA的核酸酶抗性(见，Elbashi等，2001,^然411:494-8)。本发明的某些实施方案中还可以使用50、75、100或甚至500对碱基对或更多的较长dsRNA。用于实施抑制的dsRNA的示范浓度是约0.05nM,0.1nM,0.5nM,1.0nM,1.5nM,25nM或100nM，尽管根据受处理细胞的性质、基因靶标和技术人员容易辨别的其他因素可以使用其他浓度。示范性dsRNA可以化学合成或利用合适的表达载体在体外或体内产生。示范性合成的RNA包括利用本领域中已知方法化学合成的21个核苷酸的RNA。优选地，利用本领域中已知方法，对合成的寡核苷酸进行去保护和凝胶-纯化(见，例如，Elbashir,等，2001,基茵发廖^^""DevJ15:188-200)。备选地，可以从哺乳动物表达载体转录所述dsRNA。以两种可能的方向位于哺乳动物细胞中所使用的合适启动子下游的单一RNA靶标应该转录该靶标的两条链，从而构建理想靶序列的dsRNA寡核苷酸。应该将任何以上RNA种类设计为包括靶核酸中显示的核酸序列的一部分。在设计siRNA寡核苷酸中使用的特异性序列可以是所述靶标的表达基因信使内包含的任意连续的核苷酸序列。本领域中已知的程序和运算法则可以用于选择适当的靶序列。见，位于ambion.com的Ambion网页。另夕卜,可以利用设计用于预测特定单链核酸序列的二级结构的程序，并容许那些序列的选择可能发生在折叠的mRNA的暴露单链区域中，来选择最佳序列。用于设计合适的siRNA寡核苷酸方法和组合物可以见于，例如,美国专利号6,251,588中，将其内容作为参考引入本文。樣麟纖核糖核酸酶是能够催化RNA特异性分裂的酶RNA分子。核糖核酸酶分子的组合物优选地包括一种或多种与靶mRNA互补的序列，和众所周知负责mRNA分裂的催化序列或功能等价序列(见，例如，美国专利号5,093,246,将其全部内容作为参考引入本文)。设计用于催化地分裂靶mRNA转录物的核糖核酸酶分子还可以用于阻止该耙mRNA的翻译虽然在位点-特异性识别序列处分裂mRNA的核糖核酸酶可以用于破坏耙mRNA，但是优选使用锤头核糖核酸酶。锤头核糖核酸酶分裂位于由与耙mRNA形成互补碱基对的旁侧区指示的位置处的mRNA。优选地，所述靶mRNA具有下列两个碱基的序列5'-UG-3'。锤头核糖核酸酶的构建和产生是本领域中众所周知的.。靶向核糖核酸酶的基因必要地含有与靶mRNA的两个区域互补的杂交区，其中每个区域长度为至少5个连续核苷酸和优选地每个为6,7，8,9,10,11,12,13,14，15,16,17,18,19或20个连续核苷酸。另外，核糖核酸酶具有高度特异性内切核糖核酸酶活性，其自催化地分裂靶点有义mRNA。17对于反义，可以使用siRNA或核糖核酸酶寡核苷酸，硫代磷酸寡核苷酸。磷酸二酯连接以及杂环或糖的修饰可以提供增高的效率。硫代磷酸酯用于修饰所述磷酸二酯连接。已经将N3'-P5'氨基磷酸酯连接描述为针对核酸酶稳定寡核苷酸并增加与RNA的结合。肽核酸(PNA)连接是核糖和磷酸二酯主链的完全替代，并且对核酸酶稳定，增加针对RNA的结合亲和性，且不容许由RNA酶H引起的分裂。其基本结构还依从可以容许其最优化为反义成分的修饰。关于所述杂环的修饰，已经证明了某些杂环修饰在不干扰RNA酶H活性的条件下增加反义作用。所述修饰的实例是C-5噻唑修饰。最后，还可以考虑所述糖的修饰。2'-0-丙基和T-甲氧基乙氧基核糖修饰在细胞培养中和体内针对核酸酶稳定寡核苷酸。可以通过直接转染或经由表达载体的转染和表达将抑制性寡核苷酸递送到细胞中。合适的表达载体包括哺乳动物表达载体和病毒载体，在其中己经克隆了具有包括启动子的合适的调控序列的抑制性寡核苷酸，从而导致反义RNA在宿主细胞中的表达。合适的启动子可以是组成型的或发育-特异性启动子。转染递送可以通过本领域中已知的脂质体转染试剂(例如，Xtreme转染试剂，罗氏(Roche)Alameda，CA;Lipofectamine制剂，Invitrogen，Carlsbad,CA)实现。由阳离子脂质体，由反转录病毒载体介导的递送和直接递送是有效的。另一种可能的递送模式利用抗体靶向关于靶细胞的细胞表面标记。细胞在一些实施方案中，一种或多种表1中的多肽是在宿主细胞内。可以在任何能够内源或重组表达一种或多种多肽的细胞内测量一种或多种表1中的多肽的活性。所述细胞可以是原核的或真核的。示范性细胞包括细菌细胞(例如，大肠杆菌(￡.co//)、芽孢杆菌(&"'//^))、植物细胞(例如，拟南芥(力raZ^o;^)、芸苔属(5ra孤'ca)、烟草)，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。多肽在不同宿主细胞系统中的重组表达是本领域中已知的。见，例如，Sambrook和Russell,分子克隆实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第3版，2001,冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress);Ausubel,等,现代分子克隆方案(CurrentProtocolsinMolecularCloning),1987-2006,JohnWileyInterscience。适合于重组表达一种或多种表1中多肽的宿主细胞和表达载体可商购自，例如,Invitrogen,Carlsbad,CA;普洛麦格(Promega),Madison,WI;禾口Qiagen,Valencia,CA。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞可以是干细胞，典型地，是间充质干细胞(MSCs)、前-成骨细胞、或其他谱系的细胞，诸如，例如，前-月旨肪细胞或成肌细胞。描述了用于分离和分化人和动物MSC的方法(见，例女口，美国专利号5,942,225和5,486，359;和Pittenger等，弃学C"'ewcd284:143(1999))。间充质干细胞("MSC")能够分化为间充质细胞谱系，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、基质，包括造血支持基质、和腱，并在修复和再生中起重要作用(见，例如，Olsen,2000，潘應浙发,主激学年^^祭述"肌Ce〃Dev.所o/J16:191)。如例如，美国专利号5,643,736中所述，MSC是通过由独特的单克隆抗体确定的特异性细胞表面标记来识别的。能够通过从骨髓或其他MSC源中的其他细胞中分离多能间充质干细胞而获得人间充质干细胞(MSC)。骨髓细胞可以获自髂嵴、股节、胫骨、脊骨、肋骨或其他髓质空间。人间充质干细胞的其他来源包括胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿和青少年的皮肤、血液、脂肪组织、和肌肉卫星细胞。典型地，在含有生长因子的培养基中培养来自含有间充质干细胞的组织样本的细胞，所述生长因子(1)刺激间充质干细胞生长但不分化，且(2)仅容许间充质干细胞与底物表面选择性黏附。将细胞培养一段合适的时间后，可以从底物表面除去非-黏附的物质，由此提供扩大的间充质干细胞群。因此，能够通过正向选择黏附的骨髓或骨膜细胞获得同源MSC群，所述骨髓或骨膜细胞不具有与造血细胞或分化的间充质细胞相关的标记。将要分化为成骨细胞谱系细胞的细胞可以获自任何适当的哺乳动物。例如，所述细胞可以获自啮齿动物，包括，例如，小鼠、大鼠、豚鼠、和兔;非-啮齿类哺乳动物，诸如，例如，猫、狗、猪、绵羊、马、牛、和山羊；灵长类，包括，例如，黑猩猩和人。待分化细胞可以是原代细胞或可以是保持在培养物中的细胞。如果将细胞保持在培养物中，则它们在例如培养的第5代和第15代之间，与本发明的化合物/组合物相接触。用于构建原19代细胞培养物以用于本发明的方法的技术和方法是本领域中技术人员已知的(见，例如，Humason,动^^资l^^术64m'wa/7!^werec/zm々z/^J,第4版，W.H.Freeman和Company(1979),和Ricciardelli,等,(1989)沐//潘應浙发,主激学(7"附raCe〃Dev,所o/J25:1016)。通用培养方法培养表达表1中的一种或多种多肽的宿主细胞利用细胞培养领域中的常规技术。本领域中的技术人员能够利用已知的方法学确定合适的细胞培养方法和条件(见，例如，Freshney等，动激潘應荐养(CWft^eo/J"/ma/Ce〃)(第4版，2000);Ausubel,等，见上；Sambrook和Russell,见上；虔虫潘應潜秉.基欲,应l方,(/rae"Ce〃CW/wmsv尸訓t/a膨"to/朋dJ/;/zWA/ecG),Vlak,等版本，1996,Kluwer学院出版社(KluwerAcademicPub.);和Evans，等，澄激潘應潜养(P/aWCe〃C"//")，2003,Taylor&Francis。通常，细胞培养环境包括考虑这样的因素，如用于细胞生长的基底、细胞密度和细胞收縮、气相、培养基、和温度。按照本发明的方法，可以使用塑料培养皿、烧瓶、或滚筒瓶培养细胞。合适的培养容器包括，例如，多孔平板、培养皿、组织培养管、烧瓶、滚筒瓶，等。测量多肽的活性或表达水平按照基于多肽的已知功能的方法，可以测量表1中列出的任一种多肽的活性。例如，对于具有己知酶活性(例如，腺苷酸环化酶、腺苷激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷脂酶)的多肽，可以测量酶反应中的底物消耗和/或产物累积。对于作为已知受体(例如，嗅觉受体、整联蛋白、钾通道)的多肽，可以测量下游细胞内信号传导或与配体的结合。所述测定是本领域中已知的。按照本领域中熟知的方法，可以测量表l所列多肽的表达水平，并记述在本文中。可以在转录和/或翻译水平上测量表达的水平。在翻译水平上,可以利用免疫测定包括免疫组化染色、蛋白质印迹、ELISA等，使用与特定蛋白质或其片段选择性结合的抗体，测量一种或多种表1所列蛋白质的20表达。在免疫测定中利用蛋白质4寺异性抗体检测蛋白质是本领域中已知的(见，例如，Harlow&Lane,，;/历贫沐,^^邀宜手，(爿"/6o^'^:爿Z^6ora一'A/謹a/)(1998);Coligan，等，版本.，^#,资学方案(C鮮e"f尸ratoco/s/"/mm朋o/ogy)(1991-2006);Goding，卓^^摩贫沐.'^"遭f〃^"應(Mowoc/oa/Jwri6odz'es:/W"ci^/esadPrac"ce)(第3版，1996);禾卩Kohler&.Milstein,爐(淑脏)256:495-497(1975)。在转录水平上，可以通过例如，扩增，例如PCR、LCR，或杂交测定，例如，RNA杂交、RNA酶保护，或点印迹检测mRNA，所有方法都是本领域中己知的。例如，利用直接或间接标记的检测试剂，例如荧光或放射标记的核酸、放射或酶标记的抗体检测蛋白质或mRNA的水平。这些测定是本领域技术人员所熟知的，且记述在，例如Ausubel,等，版本，苦,分7垒激学;^案(Cwm7Protocol/"Mo/ecw/w5/o/ogy)(1987-2006)中。还可以利用启动子-报告基因基因融合构建体测量转录水平的调节(例如,增高或降低)。例如，编码表1中多肽的基因的启动子区域能够与产生可检测信号的多肽的编码序列融合(即，可操作地连接)。报告基因构建体是本领域中熟知的。示范性报告基因序列包括，例如，荧光蛋白质(例如,绿色、红色、黄色)、磷光蛋白质(例如，萤光素酶)、抗生素抗性蛋白质(例如，(3-内酰胺酶)、酶(例如，碱性磷酸酶)。选择抑制所述多肽活性的试剂能够通过与不与一种或多种候选试剂接触的相同多肽的多肽活性比较，测量一种或多种表1所列的多肽的多肽活性的抑制(细胞内或外)。与未处理样品相比，处理的样品(或反应混合物)中受抑制的多肽活性应该是，例如，至少约10%、25%或50%。在一些实施方案中，与未处理样品中的多肽活性相比，多肽活性可以被抑制至少约60%、70%、80%、90%、或甚至被完全抑制。类似地，能够通过与相同多肽在不和一种或多种候选试剂接触的细胞中的多肽表达水平进行比较，测量一种或多种表1所列的多肽的多肽表达的抑制。在一些实施方案中，与未处理细胞相比，处理的细胞中受抑制的多肽表达水平应该是，例如，至少约10%,25°/。或50%。在一些实施方案中,与未处理细胞中的多肽表达水平相比，多肽表达水平可以被抑制至少约60%,70%,80%，90%,或甚至被完全抑制。在其他实施方案中，将在一种或多种测试试剂存在下的多肽活性或表达的抑制与在己知抑制剂存在下的多肽活性或表达水平相比较。在这种情形中，相同或相似的多肽活性或表达水平表示所述一种或多种测试试剂是抑制剂。在一些实施方案中，可以通过向不重组或内源表达任何一种表1中的多肽的细胞施用试剂，来测量该抑制试剂的选择性或特异性。特异性抑制表1中的多肽的试剂通常不应该在不表达所述多肽的细胞中引起任何可检测的响应。检测骨发生可以利用本领域中己知的任何方法在体外或体内检测骨发生的诱导。例如，通过检测成骨细胞-特异性蛋白质的表达，检测骨-特异性转录因子的表达，和检测骨密度的变化进行。成骨细胞-特异性蛋白质包括，例如，碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原、骨钙蛋白、和骨桥蛋白(见，例如，01sen等，潘應f〃发,f激学牟^^貢述Ce〃.Dev.历o/.)16:191(2000))。在一些实施方案中，将碱性磷酸酶的表达作为骨发生的指示剂进行检测。骨特异性转录因子包括，例如，Cbfal/Runx2,gsc,Dlxl,Dlx5，Msxl,Cartl，Hoxal,Hoxa2,Hoxa3,Hoxbl，rae28,Twist,AP陽2，Mfl,Paxl,Pax3,Pax9,TBX3,TBX4,TBX5,禾BBrachyury(见，例如，Olsen等，2000，见上)。典型地，将Cbfal/Runx2的表达作为骨发生的指示剂进行检测。检测成骨细胞-特异性蛋白质可以通过测量成骨细胞-特异性蛋白质或mRNA的水平，检测成骨细胞-特异性蛋白质的表达。可以利用免疫测定包括免疫组化染色、蛋白质印迹、ELISA等，使用与特定成骨细胞特异性蛋白质或其片段选择性结合的抗体，方便地测量特定成骨细胞-特异性蛋白质的水平。在免疫测定中利用蛋白质-特异性抗体检测蛋白质是本领域中技术人员已知的(见，例如,Harlow&Lane,浙y^贫沐'实殺室手，(爿"幼O(iZasv爿Z^oratoryMa"薦/)(1998);Coligan,等，版本，当^"克疫^^;^案(O^reWPratoco/s/mm,o/ogy)(1991-2006);Goding,卓克蘑贫体.'C7kfo"oc/o"a/J/W6c^/e5../V/"c^/ay尸rac".ce)(第3版，1996);禾卩Kohler&Milstein，应然(A^wre)256:495-497(1975)。为了测量mRNA,扩增，例如，PCR、LCR,或杂交测定，例如,RNA杂交、RNA酶保护、点印迹是优选的。例如，利用直接或间接标记的检测试剂，例如荧光或放射标记的核酸、放射或酶标记的抗体检测蛋白质或mRNA的水平。这些测定是本领域技术人员所熟知的，且记述在，例如Ausubel,等，版本，^薪分f生激^^案(Cwm7/尸ratoco/s/"Mo/ecw/"r5/o/ogy)(1987-2006)中。典型地，成骨细胞特异性-蛋白质，即碱性磷酸酶的表达用于检测分化的成骨细胞。碱性磷酸酶(ALP)的表达与骨发生相关联。ALP将无机焦磷酸盐水解为磷酸盐，并促进骨基质中形成羟磷灰石晶体。ALP的失活性突变导致软骨病，其特征在于很差矿化的骨和频繁的骨折，这说明ALP在骨形成中起显著作用(见，例如,Hessle,等，夷房房家辨学腐学叛(尸腦.A^/.Jo^.Sd.99:9445(2002))。ALP是高活性且稳定的酶，这使得直接测定其酶活性很方便。另外，细胞的直接组化染色能够方便地用于检测ALP。还通过检测细胞外基质(ECM)矿化，来检测骨发生。如本文中所述地，可以通过用茜素红溶液染色细胞，来检测与ECM矿化相关的磷酸钙沉积。然后可以评估红色染色的范围和强度。艨活丝对于ALP活性的直接测定，可将细胞涂布在多孔平板(例如，96-孔、384-孔、1536-L)上，并用合适量的一种或多种候选试剂单独地或与其他生长因子(例如，BMP-4)—起对其进行处理，并然后在37t:，5。/。C02条件下培养。在一段合适的培养时间后，除去培养基，并将裂解缓冲液加入到每个孔中。在裂解缓冲液中培养一段合适的时间后，将碱性磷酸酶底物溶液(例如，2'-[2'-苯并噻唑基]-6'-羟基苯并噻唑磷酸酯(BBTP))加入到每个孔中。在室温下培养一段合适的时间后，利用本领域中已知的方法，在平板读数仪上对平板进行读数。23对于检测ALP的细胞直接免疫组化染色，将细胞以合适的密度接种到多孔测定平板中，并用合适量的候选试剂单独地或与其他生长因子(例如,BMP-4)—起对其进行处理一段合适的时间。然后将细胞固定在10%福尔马林溶液中。再次清洗固定的细胞并利用本领域中技术人员己知的方法(见，例如，Harlow&Lane,见上；Coligan，见上；Goding，见上；，HKohler&Milstein,见上)，用特异于ALP的试剂(例如，特异于ALP的抗体或比色ALP底物)对其进行染色。获取细胞的照相图像并从该图像手工计数ALP阳性细胞。检测骨4寺异性转录因子利用报告基因测定检测骨-特异性转录因子的表达。这些测定是本领域中技术人员所熟知的，并且记述在，例如，Ausubel，等，见上中。检测骨特异性转录因子Cbfal/Runx2的表达水平可以用于检测骨发生。Cbfal/Runx2在成骨细胞分化中起重要作用。缺乏Cbfal/Rimx2基因的转基因小鼠出生后不久死亡，这归因于缺乏骨的形成(见，例如，Ducy等，一智應(CW/)89:747(1997)和Komori等，潘應(CW/)89:755(1997))。报告基因，包括例如，氯霉素乙酰转移酶、萤火虫萤光素酶、细菌萤光素酶、荧光蛋白(例如，绿色、黄色、紫色),或(3-半乳糖苷酶，可以用在报告基因测定中。典型地，将报告基因构建体瞬时或稳定地转染到细胞中。典型地，通过PCR的合适引物扩增相关基因(例如，Cbfal/Runx2)的启动子区域。将由此产生的PCR产物插入合适的克隆载体中，扩增并测序。利用适当的限制性酶消化由此产生的质粒，并将由此产生的片段插入到包含报告基因的载体中。斷機游潘應对于利用瞬时转染的细胞进行的报告基因测定，将细胞以合适的密度(例如，约30,000个细胞/孔)接种到处于生长培养基中的多孔平板中，并培养一段合适的时间。利用合适的转染试剂，将质粒DNA转染到该细胞中。一段合适的时间(例如，约8小时)后，将转染的细胞涂布在多孔测定平24板(例如，Corning)中，并合适量的候选试剂进行处理。培养细胞一段合适的时间(例如，数天，例如，2，3或4天)后，然后利用本领域中技术人员已知的方法测定细胞中报告基因的活性。稳定機游潘應对于利用稳定转染的细胞进行的报告基因测定，将细胞以合适的密度(例如，约30,000个细胞/L)接种到处于生长培养基中的多孔平板中，并培养一段合适的时间。利用合适的转染试剂，将合适量的报告基因质粒和包含可选择标记的(例如,抗生素抗性基因)的载体共-转染到该细胞中。一段合适的培养时间后，将细胞接种到培养皿中，并将合适量的抗生素加入到培养基中。以合适的间隔添加新鲜的抗生素。汇集抗生素抗性集落，从而产生稳定转染的细胞。将转染的细胞涂布在多孔测定平板(例如，Corning)中，并用合适量的候选试剂进行处理。培养细胞一段合适的时间(例如，数天，例如,2，3或4天)，然后利用本领域中技术人员已知的方法测定细胞中报告基因的活性。本发明的筛选方法是恰当的高通量筛选。利用多孔平板(例如,96-孔、192-孔、384-L、768-孔、1536-孔，等)和自动化系统能够同时筛选许多试剂。本筛选方法中使用的自动化系统购自，例如，Thermo实验室系统(ThermoLabSystems),Waltham,MA;Caliper生命科学(CaliperLifeScience),Hopkinton,MA;BeckmanCoulter,公司,Fullerton，CA;禾口Invitrogen公司,Carlsbad,CA。IV.向细胞递送siRNA寡核苷酸的方法可以将包括一种或多种抑制一种或多种表1所列多肽的siRNA寡核苷酸的组合物递送到哺乳动物细胞中，以促进骨发生。能够利用本领域中熟知的和本发明描述的方法，使所述细胞与一种或多种siRNA寡核苷酸进行体外、先体外后体内或体内的接触。在一些实施方案中，使哺乳动物细胞与包括一种或多种siRNA序列的组合物相接触，所述siRNA序列抑制一种或多种表1所列多肽的表达。在一个实施方案中，使哺乳动物细胞与包括一种或多种siRNA寡核苷酸的组合物相接触，所述siRNA寡核苷酸抑制一种或多种选自由下列各项组成的组中的多肽的表达GNAS(人GNAS复合基因座，转录变体3(如2007年8月9日)、Gsa亚基的同种型b，NM—080426)、ADCY8(腺苷酸环化酶8，NM—001115)、ADK(腺苷激酶,NM—001123)、P2RY11(嘌呤能受体P2Y,G-蛋白质偶联的,11,NM—002566)、TBX3(T-盒3或尺乳综合症(ulnarmammarysyndrome),NM—005996)、BIRC4(含有杆状病毒IAP重复4，NM_001167)、BCL2L2(BCL2-样2，NM—004050)、SLC12A2(溶质载体家族12，成员2,NM—001046)、KCNT1(钾通道，亚家族T,成员1,XM_029962.2)、GBDRl(与推定的神经胶质胚细胞瘤细胞分化相关的,NM—016172)、DUSP6(双特异性磷酸酶6，NMJ)01946)和MJD(神经系统亚速尔病或共济失调蛋白3，NM—004993)。在一些实施方案中，使哺乳动物细胞与包括一种或多种表1所列的siRNA寡核苷酸序列的组合物相接触。为了向细胞的体外或体内递送，组合物可以包括一种或多种用于直接转染的siRNA分子，例如，处于双链或发夹构型的。备选地，组合物可以包括一种或多种载体，例如，质粒哺乳动物表达载体或病毒表达载体，所述载体表达一种或多种siRNA序列，例如，处于双链或发夹构型的。为了转染，包括一种或多种siRNA分子(在载体内或无载体)的组合物可以包括用于向受试者施药的包括脂质体的递送赋形剂、载体和稀释剂以及它们的盐，和/或可以存在于药用制剂中。关于核酸分子递送的方法记述在，例如，Gilmore,等，^蕨秀激遂送(CwrDrwgDe/z'vez);)(2006)3:147-5和Patil,等，X4尸S^V志UJ尸SJow77a/)(2005)7:E61-E77中，将其中每篇作为参考引入本文。siRNA分子的递送还记述在数篇美国专利公布中，包括例如，2006/0019912;2006/0014289;2005/0239687;2005/0222064;和2004/0204377,将其中每篇的内容在此作为参考引入本文。可以用本领域中技术人员已知的多种方法向细胞施用核酸分子，所述方法包括，但不仅限于，脂质体中的包封，通过离子电渗疗法，通过电穿孔,或通过结合到其他赋形剂中，所述赋形剂包括可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精(见，例如Gonzalez等，1999,生激缀会众学(5/oco">gWeC/zem.),10,1068-1074;Wang等，国际PCT公布号WO03/47518和WO03/46185)、聚(乳-共-乙)酸(PLGA)和PLCA微球体(见例如美国专利号6,447,796和美国专利申请公布号2002/130430)、可生物降解的纳米胶囊、和生物粘着微球体中，或通过蛋白质样载体(O'Hare和Normand,国际PCT公布号WO00/53722)。在另一个实施方案中,还可以利用聚乙烯亚胺及其衍生物，诸如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物，配制或复合本发明的核酸分子。本发明使用的脂质体转染试剂的实例包括，例如CellFectin,即阳离子脂质N,NI,NII，NIII-四甲基-N,NI,Nil,NIII-四棕榈基-精胺和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(GIBCOBRL)的1:1.5(M/M)脂质体制剂；CytofectinGSV,即阳离子脂质和DOPE(Glen研究)的2:1(M/M)脂质体制剂;DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧)-N,N,N-三-甲基-甲硫酸铵)(BoehringcrManheim);Lipofectamine,即聚阳离子脂质DOSPA和中性脂质DOPE(GIBCOBRL)的3:1(M/M)脂质体制剂；和(5)siPORT(Ambion);HiPerfect(Qiagen);X-tremeGENE(罗氏)；RNAi载体(Epoch生物实验室)和TransPass(新英格兰生物实验室(NewEnglandBiolabs))。在一些实施方案中，将siRNA序列递送到克隆了哺乳动物表达载体的细胞中。适合于siRNA表达的哺乳动物表达载体商购自，例如，Ambion(例如，pSilencer载体)，Austin,TX;普洛麦格(Promega)(例如，GeneClip,siSTRIKJE,SiLentGene),Madison,WI;Invitrogen,Carlsbad,CA;InvivoGen,圣地亚哥，CA;和Imgenex，圣地亚哥，CA，典型地，用于转录siRNA分子的表达载体应该具有U6启动子。在一些实施方案中，将siRNA序列递送到克隆了病毒表达载体的细胞中。适合于向细胞递送siRNA分子的病毒载体包括腺病毒载体、腺伴随载体、和反转录病毒载体(包慢病毒(lentiviral)载体)。为了递送和表达siRNA寡核苷酸而开发的病毒载体可以商购自，例如，基因检测(GeneDetect)，Bradenton,FL;Ambion,Austin,TX;Invitrogen,Carlsbad,CA;开方文生物系统(OpenBioSystems),Huntsville，AL;禾卩Imgenex，圣地亚哥，CA。V.施药和配制27抑制一种或多种表1所列的多肽活性和/或表达的试剂(例如，siRNA、有机化合物、多肽)能够用于在哺乳动物细胞中诱导骨发生。使哺乳动物细胞与抑制试剂相接触，随之该哺乳动物细胞分化为成骨细胞谱系的细胞。该哺乳动物细胞能够与抑制试剂(或其组合物)在体内，先体外后体内(均记述如下)或体外(如上所述)相接触。体内诱导骨发生抑制试剂及其组合物能够方便地用于在体内诱导骨发生。将本发明的化合物和组合物，以有效诱导哺乳动物细胞分化为成骨细胞谱系的细胞的量，施用于个体，例如,哺乳动物诸如人。由于它们诱导骨发生的能力，抑制试剂有效治疗骨病症和疾病，包括骨质疏松症、佝偻病、软骨病、麦_奥综合症，和佩吉特病。在一个实施方案中，本发明的化合物和组合物用于治疗骨质疏松症。在一个实施方案中，本发明的化合物和组合物用于增加骨密度。在一个实施方案中，本发明的化合物和组合物用于增加骨密度和减少骨流失。在一些实施方案中，所述药物组合物包括一种或多种选自表1所列的那些的siRNA寡核苷酸。本领域中的技术人员应该理解本发明组合物能够单独或与其他化合物和治疗方案组合使用，从而诱导骨发生。例如，所述抑制试剂可以与骨形态发生蛋白("BMPs")或影响骨再造周期的其他抗-再吸收药物联合施用。合适的骨形态发生蛋白包括，例如，BMP-2，BMP-4,和BMP-7。合适的抗-再吸收药物包括，例如，二膦酸盐，诸如，例如，阿仑膦酸钠和利塞膦酸钠;激素，包括，例如，降钙素和雌激素，和选择性雌激素受体调节剂，包括,例如，雷洛昔芬。应该通过伴随施用所述组合物的任何不利副作用的存在、性质、和范围；所述组合物的LD50;和所述组合物在不同浓度时的副作用来确定所述组合物的有效量。典型地，施用的组合物的量应该在约0.01-约20mg/kg的范围内，例如约0.05-约15mg/kg，例如约0.1-约10mg/kg体重。通常，最初施用较低剂量，并逐渐递增直到达到适合的有效剂量。可以例如，口服或肠胃外，例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下施用组合物，或直接施用到骨组织中。口服施药是优选的施药方法。所述化合28物制剂可以存在于单一-剂量或多-剂量的密封容器，诸如安瓿和小瓶中。在一些实施方案中，通过可植入的泵递送所述组合物。典型地，在向个体或受试者施药前，利用药用载体配制本发明的组合物。可以部分地通过被施用的具体组合物，以及通过用于施用所述组合物的具体方法，确定药用载体。因此，存在广泛多样的本发明药物组合物的合适制剂(见，例如，劍药弃学/〃实應(ie""'"gto":T7ze&^"cea"c/尸ra"/ceo/尸/wrmac;K),费城禾斗学大学(UniversityoftheSciencesinPhiladelphia)，第21版，2005，Lippincott,Williams&Wilkins)。适合于口服施药的制剂可以由下列各项组成(a)液体溶液，诸如混悬在稀释剂中的有效量的所述化合物或组合物，所述稀释剂包括水、盐水或PEG400;(b)胶囊剂，香囊剂或片剂，各含有预定量的有效成分，如液体、固体、颗粒或明胶；(c)处于合适的液体中的混悬液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可以包括下列各项中的一种或多种乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶状二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸，和其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂、和药物相容的载体。锭剂形式除包括活性成分、本领域中已知的载体外，可以包括处于调味剂，例如，蔗糖中的活性成分，以及包含处于惰性碱，诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶乳剂、凝胶等中的活性成分的软锭剂。本发明的组合物可以处于适合于其他施药途径，诸如，例如，静脉内灌输、腹膜内、皮下、肌肉内、直接进入骨的制剂中。所述制剂包括，例如，水性和非-水性的等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂，缓冲剂，细菌抑制剂，和使所述制剂与预期接收者血液等渗的溶质，和可以包括混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂的水性和非-水性无菌混悬液。可以由无菌粉末剂、颗粒剂、和片剂制备注射溶液和混悬液。在本发明的情形中，向患者施用的剂量应该足以在患者体内随着时间实现有益的治疗响应。例如，如果施用本发明的组合物治疗或预防骨质疏松症，则向患者施用的剂量应该足以预防、延迟、或逆转骨密度的减少。通过具体使用的组合物的效率和患者的健康状态，以及待治疗患者的体重或表面积，来确定剂量。剂量大小还应该通过伴随具体组合物在特定患者体内施药的任何不利副作用的存在、性质、和范围来确定。如所需地，可以一次或重复施用所述抑制试剂，其包括siRNA组合物。例如，可以以规则的间隔(例如，每日两次、每日一次、每周两次、每周一次、每月一次)施用所述抑制试剂持续一段延长的时间(例如，7天、14天、21天、l个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12月、或更长)。如所需地，可以随着时间经常或多或少地施用抑制试剂。先体外后体内诱导骨发生能够用本领域中技术人员已知的任何方法向受试者施用分化的成骨细胞。在本发明的一个实施方案中，能够例如，经由外科移植，向受试者施用处在完整的固体支持物(例如，三维基质或平面表面)上的分化的成骨细胞。备选地，在向受试者例如，静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内或直接进入骨施药前，能够使分化的成骨细胞与所述基质分离，即，通过用蛋白酶处理。在本发明的一些实施方案中，从人中提取间充质干细胞，并随后使其与抑制一种或多种表1中的多肽的试剂相接触，从而增殖和分化为成骨细胞谱系的细胞。能够从待治疗的受试者中，即，自体(由此避免基于免疫的移植排斥)，或能够从第二受试者中，即，异源提取细胞。在每种情形中，细胞的施药可以与合适免疫抑制处理相结合。可以通过本领域中已知的任意方法，向受试者施用按照本发明方法分化的成骨细胞。合适的施药方法包括，例如，静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、进入骨和外科移植。所述细胞可以处于适合于施药的制剂中，诸如，例如，水性和非-水性的等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂，缓冲剂，细菌抑制剂，和使所述剂型与预期接收者的血液等渗的溶质，和可以包括混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂的水性和非-水性无菌混悬液。可以由无菌粉末剂、颗粒剂、和片剂制备注射溶液和混悬液。为了外科移植，可以将分化细胞留在完整固体支持物，例如，三维基质或平面表面上。将所述基质或平面表面外科移植到受试者的合适位点。例如，需要骨移植的患者可以具有在外科植入的完整固体支持物上的分化30的细胞。在确定治疗或预防由于减少的或异常的成骨细胞引起的病症中待施用的细胞的有效量的过程中，医师评估细胞毒性、移植反应、疾病的发展、和抗-细胞抗体的产生。为了施用，当应用于患者的大多数和全面健康状态时，在考虑不同浓度成骨细胞的副作用的条件下，可以以有效的量施用按照本发明的方法分化的成骨细胞，以向受试者提供成骨细胞。可以经由单次或分开剂量完成施用。检测骨密度为了评价本发明的组合物对骨密度的作用，可以在将接受治疗的个体内进行骨密度的基线测量。在施用本发明的抑制试剂(例如，一种或多种选自表1所列的那些的siRNA寡核苷酸)的过程中或之后，以合适的间隔周期性测量骨密度。用于测量骨密度的方法和装置是本领域中众所周知的，且记述在，例如，美国专利号6,436,042;6,405,068;6,320,931;6,302,582;6,246,745;6，230，036;6,213,934;6,102,567;6,058,157;5,898,753;5,891,033;5,852,647;5,817,020;5,782,763;5,778,045;5,749,363;5,745,544;5,715,820;5,712,892;5,572,998;禾卩5,480,439中。VI.治疗和诊断用途本发明的方法和组合物发现了治疗骨病症和由缺陷性或缺乏性成骨细胞形成引起的疾病的用途。作为缺乏性或缺陷性成骨细胞分化结果发展的示范性骨疾病包括，例如，骨质疏松症、佝偻病、软骨病、麦-奥综合症、和佩吉特病。见，例如，Kasper,等，/^辨,学游给I森嚴厕O/am'so"'s尸〃>7">/^o//"fer"a/Me&'"'"eJ的第333-334章，第16版，2004，McGraw-Hill。此外，本方法还特别有效于体外骨培养、和骨发生的分析下列实施例意欲举例说明，而非限制本发明。实施例实施例1实验程序细胞培养、转染和高通量筛选人间充质干细胞(hMSCs,PT-2501)购自Cambrex公司，并按照供应商的指导进行培养。在用于siRNA文库筛选前，将细胞扩增至第5代。简要地，在384-孔板的每个孔中混合稀释的Xtreme-siRNA转染试剂(cat弁447611500，罗氏)(0.12|ilXtreme处于4jilDMEM中)和预-点滴的siRNA(14ng/孔)持续1小时。然后，利用自动分配器(Multidrop384,Thermo实验室系统(ThermoLabSystems))加入处于60pl培养基(无抗生素)中的细胞(4000/孔)(siRNA最终浓度为约15nM)。在第一次更新培养基前，容许转染继续8小时。培养7天后，针对碱性磷酸酶(ALP)活性，对细胞进行染色(cat#86R-lKT,西格玛(Sigma))。在96-孔平板中进行筛选后测定，并以30nM的浓度以8000个细胞/孔的细胞密度转染siRNA。类似于siRNA，利用Xtreme-siRNA转染试剂，将CRE诱杀剂寡核苷酸和对照寡核苷酸(在所有核苷酸上硫代磷酸酯键修饰)(Park,Y.G.等，f激化学染,吝a历o/C/2柳J274:1573-1580(1999))转染到细胞中，只是最终DNA浓度是卯nM。筛选中使用的对照siRNA(siCon)含有一个50个合成序列的库，所述合成序列具有至少4个与已知的人转录物和EST的错配，和至少2-3个与完整的人基因组的错配。在初级筛选后的靶点表征中使用的siCon购自Dharmacon(D-001210-01-05)，通过生物信息学将其设计为具有>=4个与已知的人和小鼠基因的错配。siTOX也购自Dha廳conOD掘500-01-05)。siCBFAl:UAGUAGAGAUAUGGAGUGCtg(SEQIDNO:1)(反义)；GCACUCCAUAUCUCUACUAtt(SEQIDNO:2)(有义)。CRE诱杀剂'24-mer回文序列5'-TGACGTCATGACGTCATGACGTCA-3'(SEQIDN0.3)。CRE错配对照5'-TGTGGTCATGTGGTCATGTGGTCA-3'(SEQIDNO:4)。磷酸钙染色用PBS冲洗细胞两次，室温下在茜素红溶液(cat#vw3611-2,VWR)中染色8分钟，再用PBS清洗，在10%福尔马林溶液(cat#HT-5014,西32格玛)中固定20分钟，然后用水冲洗并空气干燥。油红O染色用PBS冲洗细胞两次，在10%福尔马林溶液中固定20分钟，用PBS冲洗两次并用dH20冲洗一次，用丙二醇清洗5分钟，并用处于丙二醇中的油红(12722A,Newcomer供应(NewcomerSupply))染色30分钟。然后，用85%丙二醇清洗细胞5分钟，用dH20冲洗3次，并保存在50%甘油中。化合物处理8-CPT-cAMP，Na(cat#116812)、5-碘代杀结核菌素(ca枝407900)、前列腺素E2(PGE2，cat#538904)、SB202190(cat#559388)和U0126(cat#662005)购自Calbiochem;N6，2'-0-联丁酰基-cAMP(cat#D0260-5MG)、毛喉素(cat^F6886)、抗坏血酸2-磷酸酯(cat#49752-10G)、(3-甘油磷酸酯(G-6251)、地塞米松(D8893)、3-异丁基-l-甲基黄嘌呤(IBMX,15879)和胰岛素(19278)购自西格玛(Sigma)/奥德里奇(Aldrich)/Fiuka。RNA制备和RT-PCR利用来自Qiagen的RNAeasy微型试剂盒(RNAeasyminikit),由约5x10(4)个细胞制备来自每份样品的总RNA，并进一步用TurboDNA-Free(cat#1907,Ambion)进行处理，以防止DNA污染。按照指示，利用用于RT-PCR的Superscript第一链合成系统(SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR)(cat#11904-018,Invitrogen)或Qiagen—步RT-PCR试剂盒(QiagenOneStepRT-PCRkit)(cat#210210)进行反转录。所用的PCR引物如下GAPDH:正向5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(SEQIDNO:5);反向5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(SEQIDNO:6)。ALPL:正向5'-TGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCA-3'(SEQIDNO:7);反向5'-ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC-3'(SEQIDNO:8)。RUNX2:正向5'-TCTTCACAAATCCTCCCC-3'(SEQIDNO:9);反向5'-TGGATTAAAAGGACTTGGTG-3'(SEQIDNO:10)。OSX:正向5'-CCTATGTACCAGGAGTAATGAATAG-3'(SEQIDNO:11);反向5'-CTCCTAGCTCTTTAAGTTCTTTCTC-3'(SEQIDNO:12)。DLX5:正向5'-GAGAAGGTTTCAGAAGACTCAGTA-3'(SEQIDNO.13);反向5'-CTAGAACAGCAAAACACAGTAGTC-3'(SEQIDNO:14)。BSP:正向5'-GAGAATACCACACTTTCTGCTAC-3'(SEQIDNO:15);反向5'-AAGTAGCTGTACTCATCTTCATAGG-3'(SEQIDNO:16)。MJD:正向5'-AGCACAACTAAAAGAGCAAAGAGTC-3'(SEQIDNO:17);反向5'-CTCATAGCATCACCTAGATCACTCC-3'(SEQIDNO:18)。BIRC4:正向5'-GTTTCAGCATCAACACTGGC-3'(SEQIDNO:19);反向5'陽TCCGTGCTTCATAATCTGCC-3'(SEQIDNO:20)。P2RY11:正向5'-GTGTCCACCCTCTACTCTACAT-3'(SEQIDNO:21);反向5'-CTCCACTCTCTCTACTTGGTTCT-3'(SEQIDNO:22)。SLC12A2:正向5'-GGTGTCTATCTCTTGACCTTGT-3'(SEQIDNO:23);反向5'陽GACCTGGTGTCTAGTGTTAAGTG-3'(SEQIDNO:24)。TBX3:正向5'-ATAACTGAGATTGCTGTGGG-3'(SEQIDNO:25);反向5'-AGAGAGGGGGAAAAATACAG-3'(SEQIDNO:26)。BCL212:正向5'-GCTGAGGCAGAAGGGTTATG-3'(SEQIDNO:27);反向5'-ATAGAGCTGTGAACTCCGCC-3'(SEQIDNO:28)。KCNT1:正向5'-TTCTGGAAGTTAGAAGCAGC-3'(SEQIDNO:29);反向5'-ACCGTACAAACCAGTAAGGA-3'(SEQIDNO:30)。ADK:正向5'-CCAGAGTCAGTATTAAAGGTGG-3'(SEQIDNO:31);反向5'-GAGACCAGTTGAGACAGAAAACADCY誦3'(SEQIDNO:32)。Gsa:正向5'-ATCTCTGTGATCCTGTTCCTC-3'(SEQIDNO:33);反向5'-GTGAAATGAGGGTAGCAGTAGT-3'(SEQIDNO:34)。DUSP6:正向5'-TAGATACAGGCAGTAGGTTTGC-3'(SEQIDNO:35);反向5'-CTCTCTTTGGCTCCTCTATATG-3'(SEQIDNO:36)。GBDR1:正向5'-GAGAGACTTCCAGACAGAACTC-3'(SEQIDNO:37);反向5'-CATCTATCACCTCTTTCTCGTC-3'(SEQIDNO:38)。PLZF:正向5'-TCTCAAACGCCACCTGCGCTCACAT-3'(SEQTDNO.39);反向5'-CACTGGCAGGGCGAGGCGCCGTTGT-3'(SEQIDNO:40)。蛋白质印迹细胞裂解缓冲液含有20mMTrispH8.0,1mMEDTA,150mMNaCl和0.5%NP-40，且在使用前，加入蛋白酶抑制剂混合物(Cat#p8340，西格玛,1:100稀释)和磷酸酶抑制剂混合物2(Cat#p5726,西格玛，1:100稀释)。在12%NovexTris-甘氨酸凝胶(Cat#EC6008box,Invitrogen)中分离蛋白质(60吗/孔)，并利用XCdlII印迹模块系统(XCellIIblotmodulesystem)(Cat#EI9051,Invitrogen)将其转移到硝化纤维膜(Cal#LC2001,Invitrogen)上。室温下在5。/。牛奶/PBST中封闭该膜l小时，在4度用一抗培养过夜，用PBST(在PBS中的0.05%吐温20)清洗3次，随后用处于5。/。牛奶/PBST中的二抗培养1小时，并在室温下用PBST清洗3次。然而，为了针对pCREB的抗体，在除了最后一步的所有步骤中，用PBS代替PBST。利用ECL蛋白质印迹检测试剂(安玛西亚生物科学(AmershamBiosciences))检测结合抗体的蛋白。抗-磷酸-CREB购自Upstate生物技术(UpstateBiotechnology)(cat#06-519);抗-磷酸-p38购自细胞信号技术(Cellsignalingtechnology)(cat#9910)。结果测试了多种商购的脂转染试剂后，我们发现来自罗氏(Roche)的XtremesiRNA转染试剂在hMSC中最有效，其提供超过卯％的转染效率35和最小的细胞毒性(图1)。然后，将这种高效SiRNA转染方法用在高通量筛选中，所述高通量筛选基于碱性磷酸酶(ALP)的酶测定，所述碱性磷酸酶是成骨分化的早期标记(Rodan,G.A.等，蕭應(Ce〃)89:677-680(1997))。鉴别并确认了在hMSC中的siRNA转染后第7天时引起ALP活性显著增高的55个击中(图2a和表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>(siRNA,siRNA/DNA)NM—018843MCFPAAUGGACUCAUGGAUCAUCUATG73，74线粒体载体家族蛋白NM—000633BCX2CAUGUGUGUGGAGAGCGUCAACC75，76B-细胞CLL/淋巴瘤2NM—004050BCL2L2CACCCAGGUCUCCGAUGAACUTT77，78BCL2-样2NM—016346NR2E3CAGCAGCAGCGGGAAGCACUATG79，80核受体亚家族2，组E,成员3NM—016346NR2E3CAGAGGAUGCUGAUGAGAAUATT81,82核受体亚家族2，组E,成员3NM—022571HU画PIYCACGCUCAGCGUGGCGCUCAUCT83,84推定的白细胞血小板-活化K子受/女NM—002985C(X5AAUGGGUUCGGGAGUACAUCAAC85,86体趋化因子(C-C基序)配体5NM—001946DUSP6AACUGUGGUGUCUUGGUACAUTG87,88双特异性磷酸酶6NM—0059卯STK10TAGAGCACGAAACCCAGAAACTG89,90丝氨酸/苏氨酸激酶10画—022355LOC64174CAUCGGGAUUGGUGGAGAUUATG91,92推定的二肽酶丽—012400PLA2G2DTACCAGAAGCGACUGCGUUUCTA93,94磷脂酶A2，组1ID画—178134CYP4Z1CAUCCCUAUGCCUUCAUACCATT95，96细胞色素P450NM一001354AKR1C2CAAGCCAGGGCUCAAGUACAAGC97,98醛酮还原酶家族l，成员C2画—000255MUTTAGCUGAGGGAAUACCUAAACTT99,100甲基丙二酰辅酶A变位酶画—000787DBHGACCACGUACUGGUGCUACAUTA101,102多巴胺(3-羟化酶(多巴胺(3-单加氧酶)画—012253TKTUTAUCCGUGUCAUCGACCUGUUTA103,104转羟乙醛酶-样1丽—000137FAHAACUUCGGAAGUGUGCAUUCATC105，106延胡索酰乙酰乙酸水解酶(延胡索酰乙酰乙酸酶)雨—006502POLHTAUGCCAGAACACAUGGACUATC107,108聚合酶(DNA-指导的)，T]200780029759.0转滔*被36/44:K<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在初级siRNA击中中，相应的基因编码蛋白酶、激酶、离子通道、蛋白质受体、配体、转录因子、细胞外基质蛋白质和假定的蛋白质等，其中一些是相同基因家族(整联蛋白家族、血管生成素家族、腺苷酸环化酶家族和嗅觉受体家族)的成员(表1)。虽然骨发育中涉及大部分识别的基因，但是发现两种基因，TBX3(T-盒3)和GNAS,当分别在小鼠和人中突变时，引起骨骼畸形(Bianco，P.等，骨矿银究杂,吉a6o恥M/"w)15:120-128(2000);Davenport,T.G.等，发,(Deve/opme"0130:2263-2273(2003);Eddy,M.C.等，骨rW究染岳(JSo"eM'"eri^)15:2074-2083(2000);Shore,E.M.等，，新^"潜兰,学染KyV五"g/JMW)346:99-106(2002);Weinstein,L.S.等，箭类潜兰度学染,吉(A^"g/JMW)325:1688-1695(1991))。为了检验筛选，我们选择了12种靶基因(图3)，包括GNAS(人GNAS复合基因座、转录变体2、Gsa亚基的同种型、NM—080426)、ADCY8(腺苷酸环化酶8，NM_001115)、ADK(腺苷激酶，NMJ)01123)、P2RY11(嘌呤能受体P2R、G-蛋白质偶联的，11,NM_002566)、TBX3(T-盒3或尺乳综合症，NM—005996)、BIRC4(含有杆状病毒IAP重复的4，NM—001167)、BCL212(BCL2-样2,NM—004050)、SLC12A2(溶质载体家族12，成员2,NM001046)、KCNT1(钾通道，亚家族T，成员1,XM—029962.2)、GBDR1(推定的神经胶质胚细胞瘤细胞分化-相关的，NMJ)16172)、DUSP6(双特异性磷酸酶6,NM—001946)和MJD(神经系统亚速尔病或共济失调蛋白3，NM—004993),以进一步表征它们在hMSC成骨分化中的功能。为了证实诱导的ALP活性源自骨-特异性同工酶ALPL(Weiss,M.J.等,夷房房家辨学腐学叛CProcA^"cadSc/83:7182-7186(1986》，利用ALPL特异性引物，对在siRNA转染后第4天收集的hMSC样品进行RT-PCR分析。如图2b中所示，与受到最佳成骨诱导培养基(OS,细胞培养基中的0.05mM抗坏血酸2-磷酸酯，10mM糖磷酸酯和0.1地塞米松的混合物)处理的样品相类似(Pittenger，M.F.等，辨学"c/e"c^284:143-147(1999)),与利用非特异性siRNAs(siCon)转染的对照样品相比，利用除siTBX3和siMJD外的击中siRNAs转染的样品产生增加的ALPL转录物。为了进一步证实转染的hMSC的成骨同一性，我们还检验了若干另外的早期(CBFA1、DLX5、Osterix/OSX)和一种晚期(骨-特异性涎蛋白或BSP)阶段成骨标记的表达(Acampora，D.等，犮#0>ve/，we""126:3795-3809(1999);Ducy,P.等,潘應89:747-754(1997);Nakashima,K.等，潘應(Te〃J108:17-29(2002);Wang,D.等，(J^o"eM/ww7")14:893-903(1999))。除了在所有测试样品中似乎不改变的DLX5夕卜，与siCon处理的样品相比，在击中siRNA和OS处理的样品中的CBFA1、OSX和BSP受到不同的上调(图2b)，这提示由不同击中siRNA诱导的hMSC成骨特化进行到不同的阶段。小鼠中骨细胞命运决定和成熟所必需的主要转录因子CBFA1/RUNX2(Ducy，P.等，潘應(Te〃J89:747-754(1997)),通常在hMSC中表达(图2b)。为了检验击中siRNA诱导的成骨细胞命运定型是否需要CBFA1的功能，每种击中siRNA与CBFAl-特异性siRNA或siCon共-转染在hMSC中，并检验ALP活性。与单独击中siRNA处理相比，利用siCon的共-处理不引起ALP活性的任何明显改变，而与CBFA1siRNA的共-处理降低由击中siRNA或成骨诱导培养基(OS)诱导的ALP活性的水平(图2c),这提示hMSC中击中siRNA诱导的成骨细胞命运定型也需要CBFA1的功能。为了证实诱导的ALPL表达不是由来自转染击中siRNA的脱靶(off-target)作用所引起的，对在siRNA转染后36小时时制备的RNA样品的相应siRNA耙基因进行RT-PCR。如与对照样品相比较地，相应击中siRNA转染的hMSC中降低的耙基因转录水平证实了特异性(图2d)。另外，在siRNA转染后72小时观察到耙基因的击倒。骨细胞成熟伴随着细胞外基质(ECM)的矿化(JohnBilezikian等，骨主激学嚴潘OV/"";p/^o/6o"e&o/og>0,巻l,第2版科学出版社)(2002))。为了检验由击中siRNA诱导的hMSC成骨分化是否能够进一步进入成熟阶段，培养击中siRNA处理的细胞20天。基于茜素红染色，没有检测到ECM矿化，所述茜素红染色检测磷酸钙沉积，即矿化ECM的主要组成，这指示由击中siRNA引起的表达击倒主要起诱导hMSC早期成骨特化的作用，且晚期阶段的成骨细胞成熟可能需要另外的因子。由于OS处理的hMSC在2周内经历成骨细胞成熟，所以我们测试通过击中siRNAs(最初2-4天)及随后OS(另外5-9天)的连续处理是否能够促进该过程。如图4中所示地，与对照处理细胞相比，所述用siADK和OS培养基连续处理hMSC，明显增强茜素红染色的强度。当在siRNA转染后3天时开始OS处理并持续9天时，在这12种测试的击中之中，6种(siADK、siGNAS、siP2RY11、siGBDRl、siSLC12a2和siKCNTl)显著增强了茜素红染色的强度，2种(siDUSP6和siBCL212)提供中度增强，2禾中(siBIRC4和siADCY8)提供弱增强，和2种(siTBX3和siMJD)没有显著作用(图5a)。这些观察与这样的结论相一致，即10种有效击中siRNA的靶基因不仅在hMSC成骨特化中，而且在骨细胞成熟中起抑制作用。两种siRNA击中，诸如siSLC12A2和siKCNTl的组合处理进一步增强成骨分化过程(图6)。已经提示了hMSC的成骨分化和脂肪形成分化是两个相反的过程，其中一个过程抑制另一个(Beresford，J.N.等，潘應矜学/杂,玄GCW/Scz102(Pt2):341-351(1992))。此外，在骨质疏松患者中，骨髓中脂肪细胞的数量增加,这意味着细胞命运倾向从成骨细胞谱系到脂肪细胞谱系的改变(Justesen,J.等，f激老年学C^ogm"fo/og^2:165-171(2001);Meunier,P.等，//^^蕃形,/辟賴关研秀rn/"CW/zc^^/W^W80:147-154(1971))。因此，我们通过与脂肪形成诱导混合物(100吗/mlIBMX,1DEX和10|ig/ml胰岛素)的组合处理，检验了我们的击中siRNA对hMSC脂肪形成分化的作用。与先前的研究相一致地，除siGNAS夕卜，我们的击中siRNAs以不同程度抑制hMSC的脂肪形成分化(图5b)。在我们的筛选中，将GNAS确定为hMSC中的成骨细胞命运阻抑基因。主要GNAS基因产物，即G蛋白(x-亚對Gsa),使跨膜受体偶联于腺苷酸环化酶，并且是受体-刺激的细胞内cAMP生成所必需的。在两种以异位骨化为特征的病症类型(进行性骨发育异常和奥尔布赖特遗传骨营养不良)中发现了该基因中灭活的突变(Chan,I.等，游康实验皮嚴谅学(T/z'w￡xpDe環ato〃29:77-80(2004);Eddy,M.C.等，骨矿砑^^^志(J5o"eM/"er15:2074-2083(2000);Shore,E.M.等，'新;^"搭兰度学^^志(TVJMW)346:99-106(2002))，反之，在以骨纤维性发育异常为特征的具有麦-奥综合症的患者中发现该基因中活化的突变(Wdnstein，L.S.等，箭英潜兰,学染,吉(W^g〃MW)325:1688-1695(1991)),这提示Gsa是成骨定型的关键阴性调节子。这与我们以及其他人的观察相一致，即减少的GNAS表达开启固SC中的成骨细胞命运(Lietman,S.A.等，游尿蕃形井辟賴关,秀OAo/7/eto/^J,231-238(2005))。一致地，我们的筛选不仅识别Gsct，还识别若干在cAMP生成密切涉及的蛋白质，其包括ADCY8(腺苷酸环化酶8)、ADK(腺苷激酶)和P2RY11(嘌呤能受体P2Y,G-蛋白质偶联的，ll),这提示了hMSC中细胞内cAMP信号传导和成骨分化之间的紧密连锁。由于细胞内cAMP信号传导中确实涉及全部靶基因，所以我们测试了对hMSC成骨分化上cAMP生成起相反功能的两种化合物，即ADK抑制剂5-碘代杀结核菌素和ADCY活化剂毛喉素的作用(Cottam,H.B.等，,学,众学染,吉r7Me^C/zewJ36:3424-3430(1993);deSouza，N.J.等，度学,究祭述a^//^/eW3:201-219(1983))。当与OS处理组合时，利用5-碘代杀结核菌素的处理模仿击中siADK的作用，并显著增强hMSC的成骨分化，而利用毛喉素的处理抑制该过程(图7a)。此外，细胞可渗透的cAMP类似物，诸如8-CPT-cAMP或N6,2'-联丁酰基-cAMP(DB-cAMP)与地塞米松的组合处理足以使hMSC分化为成熟脂肪细胞。而且，当与OS培养基组合时，8-CPT-cAMP能够将细胞命运定型从成骨转换到脂肪形成(图7b和7c),这与先前的观察相一致，即骨发生和脂肪形成彼此相互排斥。显示出ATP是P2RY11受体的配体(Communi等，1997)。ATP处理抑制OS-诱导的hMSC骨发生，并以剂量依赖的方式，稍微增加经历脂肪形成分化的细胞数量，这与这样的观点相一致，即P2RY11在hMSC中起成骨阻抑基因的作用。本观察与这样的结论相一致，即在hMSC中降低细胞内cAMP水平促进成骨特化，但抑制脂肪形成的细胞命运，且反之亦然。为了发现CREB(cAMP应答元件结合蛋白)，SPcAMP信号传导通路的一般下游效应子是否参与介导cAMP信号控制的hMSC分化，我们在siP2RY11、siADK、siGNAS、siSLC12a2或siCon转染后3天的细胞中检查了CREB蛋白活性形式的表达水平。与siCon处理的或未处理的样品相比，在这些击中siRNAs或OS处理的样品中，pCREB蛋白的水平增加(图8a)，这提示hMSC成骨分化需要CREB活性。为了进一步检验CREB在骨发生和脂肪形成中的作用，将能够与内源CRE增强子竞争结合蛋白质的合成的24-merCRE诱杀剂寡核苷酸转染到hMSC中(Park,Y.G.等，生激化学/夯,吉a所o/C/7emJ274:1573-1580(1999))，然后对其进行成骨或脂44肪形成诱导培养基的处理。与24-merCRE错配对照寡核苷酸相比，CRE诱杀剂不仅抑制细胞经历脂肪形成分化，而且抑制成骨分化(图8b),这提示骨发生和脂肪形成二者均需要CREB活性，并且在hMSC中，cAMP信号传导对成骨分化的抑制作用能够受到除CREB外的效应子的调控。虽然所述筛选揭示控制hMSC成骨分化的cAMP信号通路中涉及多参与者，但是组合的siRNA处理研究还提示不同的靶基因使用不同的机制来控制相同的成骨过程，其中之一是为了激活骨发生的阳性调节子。若干.蛋白质，包括BMP-2、PLZF、禾[]TAZ,在全能间充质前体细胞中显示出促进成骨分化(Hong，J.H.等,搏学6Sc/e"ce力09:1074-1078(2005);Ikeda,R.等，f激众学^^志(7所o/C72emJ280:8523-8530(2005);Katagiri,T.等，潘應浙f激学染,志aCe//5/o/J127:1755-1766(1994))。为了测试它们在我们的siRNA诱导的成骨分化中的作用，对这些基因进行了RT-PCR。虽然不同样品中BMP-2和TAZ的表达水平没有显著变化，但是在siMJD或OS处理的样品，而非其余击中siRNA处理的样品中，检测到PLZF的表达(图9a),这提示MJD通常在hMSC中抑制PLZF的表达。另夕卜，显示MAPK信号传导通路在OS处理的hMSC中已经被激活，且抑制这些通路抑制OS诱导的骨发生(图9b)(Jaiswal,R.K.等，主激众学染志aM/OzemJ275:9645-9652(2000))。DUSP6是双特异性磷酸酶，已经显示出其直接使ERKl/2或p38激酶去磷酸化(Muda,M.等，生激众学^^吉所o/C/zemJ273:9323-9329(1998))。我们因此通过蛋白质印迹，在转染后72小时，利用了针对所述蛋白质的磷酸化形式的抗体，检査了siDUSP6处理的hMSC以及其他siRNA处理的样品中的ERK1/2和p38活性状态(图9c)。siDUSP6处理的样品中增高的活化p38而非pERK1/2水平提示DUSP6通常至少部分地通过抑制p38信号传导通路活性，来抑制hMSC成骨分化。我们对解释识别的阻抑基因成骨诱导作用的分子机制的探査与这样的结论相一致，即不同的阻抑基因通过分离的通路起作用，从而抑制正常hMSC中的成骨分化。虽然为了清楚和理解的目的详细描述了上述发明，但是对于阅读本公开内容的本领域技术人员应该清楚的是，在不偏离本发明真实范围的条件下，可以进行多种形式和细节的改变。例如，上述所有技术、方法、组合物、设备和系统能够以不同的组合使用。将本申请中引用的所有公布、专利、专利申请、或其他文件作为整体引入作为参考，以获得所有目的，其程度如同每篇单独的公布、专利、专利申请、或其他文件单独指出引入作为参考以获得所有目的的程度相同。权利要求1.用于鉴别促进骨发生的试剂的方法，所述方法包括，(a)使多种试剂与选自表1的至少一种多肽相接触；(b)测量至少一种所述多肽的活性；(c)选择所述多种试剂中的至少一种，其中所选择的试剂抑制至少一种所述多肽的活性；和(d)测量所选择的试剂促进骨发生的能力，由此鉴别促进骨发生的试剂。2.权利要求1的方法，其中所述多肽在宿主细胞中表达。3.权利要求2的方法，其中所述测量步骤(b)包括测量所述至少一种多肽的表达。4.权利要求3的方法，其中测量所述表达包括测量转录水平。5.权利要求2的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。6.权利要求1的方法，其中在体外执行所述测量步骤(d)。7.权利要求1的方法，其中在体内执行所述测量步骤(d)。8.用于在哺乳动物细胞中促进骨发生的方法，所述方法包括使所述细胞与siRNA相接触，所述siRNA抑制选自表1的至少一种基因产物的表达。9.权利要求8的方法，其中所述细胞是干细胞。10.权利要求9的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞。11.用于在哺乳动物细胞中促进骨发生的方法，所述方法包括使细胞与抑制选自表1的多肽的活性的试剂相接触。12.权利要求ll的方法，其中所述细胞是干细胞。13.权利要求12的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞。全文摘要本发明提供筛选这样的试剂的方法，所述试剂抑制一种或多种负责抑制骨发生的多肽的活性或表达。本发明还提供在细胞中通过向该细胞施用试剂诱导骨发生的方法，所述试剂抑制一种或多种负责抑制骨发生的多肽。文档编号A61K48/00GK101501221SQ200780029759公开日2009年8月5日申请日期2007年8月10日优先权日2006年8月11日发明者生丁,赵院香申请人:斯克里普斯研究所