编码甘薯erf转录因子的基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体设及一种编码甘馨ERF转录因子的基因，该基因编 码的蛋白质W及含有该基因的重组载体及基因的应用。
【背景技术】
[0002] 在植物中许多基因都受逆境胁迫诱导表达，根据作用方式的不同，主要分为两大 类：调苄基因和功能基因。调苄基因主要是在信号转导和基因表达中起调节作用的转录因 子;功能基因主要编码一些调节渗透势、清除自由基和活性氧的酶等。一般认为，植物对干 旱和高盐等逆境的抗性受多基因控制，因此，利用基因工程技术导入单个功能基因虽然能 增加植物的某种单一抗性，但并不能从整体上综合提高植物的抗逆性。转录因子作为功能 基因表达的调节开关，可W对不同的基因进行精确的调节，在植物逆境信号传递过程中发 挥着关键的作用，所W通过增强某个转录因子的作用，可促使多个与抗逆有关的功能基因 表达，运是使植物抗逆性状获得综合改良的一条非常有效的途径。
[0003] 植物AP2/ERF是一个庞大的转录因子基因家族，含有由60~70个氨基酸组成的 AP2/ERF结构域而得名，存在于所有的植物中。AP2/ERF转录因子参与多种生物学过程，包括 植物生长、花发育、果实发育、种子发育、损伤、病菌防御、高盐、干旱等环境胁迫响应等。 AP2/ERF类转录因子参与水杨酸、莱莉酸、乙締、脱落酸等多种信号转导途径，而且是逆境信 号交叉途径中的连接因子。根据含AP2/ERF结构域的数目，AP2/ERF转录因子含5个亚组，包 括AP2(APETALA 2)、RAV(related to ABI3/VPl)、DREB(dehyclration-responsive element binding protein)、ERF和其他。AP2家族含2个AP2/EREBP(ethylene-responsive element binding protein)结构域，ERF和DREB家族仅含1个AP2/EREBP结构域，而RAV家族除一个 AP2/EREBP结构域外还含1个B3结构域。ERF家族是AP2/ERF转录因子大家族的一个主要亚家 族，在调节植物生物和非生物逆境反应中发挥重要作用。在拟南芥和水稻基因组中分别含 有122和139个ERF转录因子家族成员，根据基因序列系统树和蛋白保守结构域等特征，拟南 芥和水稻ERF基因分别组成12和15个不同的组。
[0004] 甘馨不仅是重要的粮食作物，而且还是重要的经济作物和能源作物。甘馨广泛种 植在世界上的100多个国家，我国是世界上的最大生产国，甘馨生产约占世界甘馨的80%。 与其他粮食作物相比，甘馨相对较为耐旱，但品种间差异较大，世界上相当比例的甘馨种植 在干旱的环境下，而世界干旱、半干旱地区已占陆地面积的Ξ分之一 W上，干旱对植物的影 响在诸多自然逆境因素中居首位。我国现有边际性±地资源(非耕地)约20亿亩，主要是干 旱、盐碱滩涂地。在我国农业用水紧缺、耕地面积紧张的形势下，在运些地区开发种植耐旱 甘馨，既能合理的利用±地资源，又能部分缓解粮食和能源紧缺问题。通过定向改良甘馨的 抗逆境能力，提高甘馨在边际性±地区的生长适应性，对确保我国的粮食安全具有重要的 战略意义。因此在甘馨中克隆新的ERF类转录因子基因，研究其基本的生物学特性和功能， 可为整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，并为改良作物抗逆性 提供一定的物质基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种编码甘馨ERF转录因子的基因，该基因命名为 IbRAP2.4〇
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种该基因编码的蛋白质。
[0007] 本发明的第Ξ个目的是提供一种含有该基因的表达载体。
[0008] 本发明的第四个目的是提供一种含有该表达载体的宿主细胞。
[0009] 本发明的最后一个目的在于提供该基因的用途。
[0010] 本发明的技术方案概述如下：
[0011] -种编码甘馨ERF转录因子的IbRAP2.4基因，它是SEQ ID N0.1所示的核巧酸序 列。所述的核巧酸序列由885个碱基组成。
[0012] 所述IbRAP2.4基因具有调控植物根系发育，增强生物量W及抗旱性的功能。
[0013] 上述基因编码的蛋白质，它是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。所述的序列由294 个氨基酸残基组成。
[0014] 一种含有上述基因的表达载体pCAMBIA1305-IbRAP2.4,它含有SEQ ID N0.1所示 的核巧酸序列。
[0015] 一种含有上述表达载体农杆菌宿主细胞EHA105: PCAMBIA1305-2 X 35s-化RAP2.4 的构建。
[0016] 上述基因在转化植物获得转基因植株中的应用，尤其是在制备转基因拟南芥中的 应用。本发明的优点：
[0017] 本发明从甘馨中分离出编码邸F转录因子基因的完整cDNA，连接到植物表达载体 上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株，对转基因植株进行了抗逆性分析，结果 表明IbRAP2.4基因能够增强植物的根系发育和生物量，并且响应逆境信号，正向调控植物 的耐旱能力。此基因可W应用于植物遗传改良。
【附图说明】
[0018] 图1.扣RAP2.4氨基酸序列的系统进化树分析结果 [0019] 图2.扣RAP2.4在甘馨不同组织中的表达
[0020] 图3.干旱胁迫诱导表达后扣RAP2.4的表达
[0021] 图4. PCAMBIA1305-2 X 35s-扣 RAP2.4 载体示意图
[0022] 图5.过表达IbRAP2.4基因对拟南芥植株叶片大写、生物量的影响
[0023] 图6.过表达IbRAP2.4基因对拟南芥根发育的影响
[0024] 图7.未转化的野生型拟南芥株系和转扣RAP2.4基因株系的根系比较
[0025] 图8.未转化的野生型拟南芥株系和转IbRAP2.4基因株系的抗旱性比较
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但下述实施例中所设及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制 造厂商说明书建议的条件实施。
[0027]实施例1
[002引甘馨中ERF转录因子扣RAP2.4基因序列获得，具体如下：
[0029] 利用OMEGA RNA试剂盒，从lOOmg的新鲜的甘馨叶片中提取总RNA，利用反转录试剂 盒(Bioteke)合成 cDNA。
[0030] 具体反应体系如下： Total RNA 0.2-2ug Oiigo dT(50 uM) lul dNTP mixture(10mM 巧Ch| lul
[0031 ] 5x鬥rst Strand buffer 4ul M-MLV Reverse Transcriptase {200U/ul) lul Rnase Inhibitor (40U/ul) lul Rnase Free dH20 up 化 20'ul
[0032] 在PCR仪上按W下条件进行反转录反应：1、50°C，45min;2、70°C，lOmin;之后冰上 冷却。
[0033] 将提取的总RNA送华大基因 （Beijing Genomic Insti1:ute,BGI)，通过高通量测序 获得甘馨转录组数据库，并通过De novo拼接获得甘馨化igene数据库，其中化igene23081 与NR数据库比对后发现该基因可能参与逆境响应。将Unigene23081通过0FR FINDER 化ttp://www.ncbi .nlm.nih.gov/p;rojects/go;rf/)在线软件预测基因完成的ORF，并利用 Primer Premier 5设计扩增完整0RF引物：
[0034] IbRAP2.4(F):5，ATGACCCGCCCGAACCT 3'
[0035] 扣RAP2.4(R):5 'CTTTGATCCCTTTCTGCAAATC 3 '
[0036] 利用TAKARA公司Primerstar GXL DNA聚合酶进行扩增，具体步骤如下： 5χ PnmeSTAR GXL Buffer lOul dIMTP Mixture (2.5 mM each ) 4ul lbRAP2.4 ( F) 10~15 pmo! 之ul
[0037] lbP.AP2.4 (R) 10~15 pmol 2u| Template 2uj PrimeSTAR GXL DNA Polymerase lul 灭菌蒸馈水 叩teiSOul
[003引 反应条件如下：94°C，4min;98°C，10Sec;55°C，15Sec;68°C，1.5min;72°C，10min; 30个循环。使用OMEGA DNA纯化试剂盒将PCR产物纯化，纯化后的PCR产物与pEASY-Blunt载 体连接（本过程使用hansGEN的祀ASY-Blunt Vector Cloning Kit试剂盒），反应体系如 下：化RAP2.4基因的cDNA片段4ul，祀ASY-Blunt载体化L。反应条件：20-30°C，30min。连接产 物转化 E-Coli.DH5a 感受态，涂布在含有 40ul 25mg/ml 的 X-Gal、16ul 50mg/ml 的 IPTG、 1 OOmg/mL Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，使用菌落PCR法确 认祀ASY-Blunt载体中插入片段的长度大小，与预期一致。送南京金斯瑞生物科技公司测序 获得基因序列沈Q ID NO. 1。
[0039] 实施例2
[0040] IbRAP2.4蛋白序列同源分析，具体如下：
[0041 ] 测序获得。0魁全长90769,03。为68469，编码227个氨基酸沈