一种玉米核因子基因ZmNF-YA3在改变植物抗逆性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改变植物抗逆性中的应用。
【背景技术】
[0002] NF-Y(nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一种转录因子复合物，由3个 不同的亚基（NF-YA/CBF-B/HAP2、NF-YB/CBF-A/HAP3 和 NF-YC/CBF-C/HAP5)组成，并通过作 用于其他调控因子的启动子来调节目的基因的表达。NF-YA是DNA序列特异性的亚基，结合 到基因启动子区的核心五聚体核苷酸CCAAT基序（motif)上。NF-YB和NF-YC是分别在结 构上类似组蛋白H2A和H2B的亚基。完整的NF-Y转录复合物与靶基因启动子中的CCAAT 基序结合，调控靶基因的转录。NF-Y复合体能够作为一个转录激活因子或阻遏因子起作用， 其与DNA的结合和转录调控活性也受到其它转录因子调节，后者通过与NF-Y亚基相互作用 起作用。植物NF-Y可分为NF-YA、NF-YB和NF-YC三个家族，每家族有8~39名成员，出现 了结构和功能的多样化，形成复杂的基因家族，且每个家族不同成员参与了不同调控。已有 的植物NF-Y基因功能分析揭示，三个家族的基因均有成员参与了植株生长发育调控或植 物与微生物相互作用，以及对逆境胁迫的响应。在进化过程中一些亚家族成员形成了参与 不同发育途径和代谢过程的特殊功能，如胚胎发育调控、根系发育和开花时间控制，内质网 应激调节、干旱胁迫响应、微生物感染及固氮根瘤形成等。一些植物NF-Y家族成员在抗旱、 耐盐性状上也有重要作用，过表达AtNF-YBl和ZmNF-YB2能够增强植物抗旱性。AtNF-YA5 被证明在干旱胁迫和响应脱落酸（ΑΒΑ)的拟南芥根和叶中表达上调。
[0003] 玉米NF-Y家族基因数量大，检索玉米基因组序列，发现玉米CCAAT-HAP2/NF-YA家 族成员 36 个、CCAAT-HAP3/NF-YB 成员 28 个、CCAAT-HAP5/NF-YC 成员 25 个。这些 NF-Y 家 族基因的功能研究尚处起步阶段，只见到玉米ZmNF-YB2基因过表达提高了玉米植株耐旱 性的研究报道和孟山都公司申请的专利。有关玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改变植物抗逆 性中的应用未见报道。
【发明内容】
[0004] 针对目前的研究现状，本发明要解决的问题是提供一种玉米核因子基因 ZmNF_YA3 在改变植物抗逆性中的应用。
[0005] 本发明所述的玉米核因子基因 ZmNF-YA3在改变植物抗逆性中的应用。
[0006] 其中：所述玉米核因子基因 ZmNF-YA3的cDNA序列如SEQ ID No. 1所示，其编码的 氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述植物是指栽培的草本作物，或玉米，或棉花；所述改 变植物抗逆性是指改变植物的抗旱性和/或耐热性。
[0007] 上述应用中：所述玉米核因子基因 ZmNF-YA3基因有cDNA形式或该ZmNF-YA3基因 以正义形式、反义形式或其RNAi结构形式。
[0008] 本发明所述玉米核因子基因 ZmNF_YA3在改变植物抗逆性中的应用方法是：从玉 米cDNA或基因组中克隆ZmNF-YA3基因序列，以基因全长形式或该基因以正义或反义形式、 或RNAi结构形式重组到植物表达载体中，形成融合基因，然后采用转基因技术将融合基因 导入植物细胞，获得转基因植株；其中，所述ZmNF-YA3基因以正义形式、反义形式或其RNAi 结构形式与启动子融合，该启动子有胁迫诱导型和/或组成型的。通过检测转基因表达强 度和对植株进行性状鉴定，从中筛选出生长和抗逆性发生明显改变的转基因植株及其后 代，创造出在植物育种中具有应用价值的植物新种质。具体的：
[0009] 本发明中，首先以耐旱自交系齐319和干旱敏感自交系65232为材料，采用芯片杂 交技术比较苗期渗透胁迫处理（用18% PEG溶液浇灌沙培的3叶期玉米幼苗，分别在处理 后12h、24h、48h和恢复浇水后24h)对不同基因型转录组影响，选出了差异表达的在不同 基因型中变化趋势不同的转录因子。然后，采用定量RT-PCR技术对它们进行表达谱分析， 从中选出ZmNF-YA3/GRMZM5G857944基因进行转基因研究。在正常生长条件下ZmNF-YA3/ GRMZM5G857944基因在玉米根中的表达丰度大于叶中；在根中耐旱自交系齐319的表达丰 度是干旱敏感自交系65232的2. 5倍；在叶中齐319的表达量只有65232的1/2。渗透胁 迫处理24h时，在耐旱自交系齐319的叶片中表达丰度略有上升，而在根中大幅度下降，约 为处理前的1/9;在旱敏感自交系65232的叶和根中均显著下降，下降幅度约为30%。在渗 透胁迫处理48h，齐319的叶、根中ZmNF-YA3表达丰度变化不大，而在65232根和叶中表达 丰度有一定上升。复水24h后，在齐319的根中ZmNF-YA3表达迅速上升，在65232的根中 却明显下降；而在叶中ZmNF-YA3的表达丰度恢复到接近胁迫处理前的水平。即该基因表达 受渗透胁迫的调节，且在不同基因型中表达变化有差异，在根中是渗透胁迫抑制的，在叶中 对渗透胁迫反应因基因型不同而差异明显，推测它与玉米的根系生长发育及抗旱性有关。
[0010] 本发明中，将ZmNF-YB3基因编码框分别与胁迫诱导型的启动子如Prd29B、Prd29A 等融合，重组到植物表达载体中，采用农杆菌介导法或基因枪轰击法将融合基因转入植物， 产生转基因株系。如在转基因玉米、棉花的产生中，构建出载体pCambial300-Prd29B: :ZmN F-YA3(+)-PCaMV35S: :bar 和 pCambial300-Prd29B: :ZmNF-YA3(-)-PCaMV35S: :bar，采用农 杆菌介导法或基因枪轰击法将目标质粒的T-DNA区转入玉米骨干自交系或棉花优良品种 中，转化苗移栽成活后自交，收获种子。通过除草剂抗性筛选和分子生物学检测方法（PCR、 Southern blotting、RT-PCR)检测转转化植株后代，产生转基因株系。继而通过连续3代 的自交和分子鉴定，产生了转基因纯合株系。另外，依据ZmNF-YA3基因特异序列，构建出 尺熟丨结构并重组到植物表达载体？?605941中，产生转化质粒？?605941^^(1298::2111即-￥八3 RNAi-PCaMV35S: :bar进行玉米遗传转化，获得转RNAi结构玉米植株。
[0011] 本发明中，通过连续自交继代得到转基因纯合植株。首先，在正常栽培条件下确 定转基因植株生长发育是否正常，进而分析转基因植株和对照植株（转基因受体基因型植 株）在胁迫条件下的抗性差异。在正常栽培条件下转基因植株形态和生长发育正常，由于 启动子的特性，转基因 ZmNF-YA3或其反义结构或RNAi结构呈现胁迫诱导型表达。在转基 因玉米中，部分过表达株系在干旱或低温条件下ZmNF-YA3表达强度显著高于未转基因植 株的，而部分转反义基因或RNAi结构的玉米株系，内源ZmNF-YA3的表达受到明显抑制，即 ZmNF-YA3表达水平显著低于未转基因植株的。以下以转基因玉米株系为例简述本发明中抗 逆检测试验的基本步骤和方法。
[0012] 在抗旱性实验中，将转ZmNF_YA3基因或它的RNAi结构的纯合株系的种子分别播 种在塑料盘中，置于适宜条件下生长。植株4叶期时停止浇水，干旱处理7-10天（由环境 温度和相对湿度决定），观察植株萎蔫程度的差异，当绝大多数植株基部变软倒伏后，恢复 浇水，观测植株恢复生长状况和成活率，确定植株的抗旱性。结果表明，ZmNF-YA3基因过表 达增强了苗期植株的抗旱性，而ZmNF-YA3基因下调表达降低了植株的苗期抗旱性。
[0013] 同时，将转ZmNF-YA3基因和其RNAi结构的玉米种子及受体基因型种子同期播种 在的花盆或/和大田，分别在雌雄穗分化期（9~13叶期）、开花授粉期和灌浆期进行干旱 胁迫处理，即通过控制浇水和避免雨淋，保持土壤相对含水量在55-65%，持续时间15天左 右，观察转基因植株性状和生长发育状态，检测相关的生理指标。一般开放授粉，收获果穗 并进行考种。结果表明，部分ZmNF-YA3过表达株系的抗旱性显著高于受体基因型的，单株 产量