抑制ehd2蛋白表达水平的rna干扰序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一段抑制人或哺乳动物细胞EHD2蛋白表达水平 的RNA干扰序列以及以此核心序列为基础的针对EHD2的靶向干扰技术，具体涉及抑制EHD2 蛋白表达水平的RNA干扰序列及其应用。
【背景技术】
[0002] RNA 干扰（RNA interference，RNAi)是由细胞内双链小干扰 RNA(small interference RNA，siRNA)引导的，通过细胞内RNA干扰原理识别具有同源序列的革巴点 mRNA后引起mRNA的降解或翻译抑制，从而抑制或降低mRNA编码蛋白表达水平的现象，其核 心是一段21个核苷酸左右长度的具有靶向性的特异核酸序列，下面统称为核心序列。RNAi 是广泛存在于大多数真核生物中，发生于转录后阶段的基因沉默现象。
[0003] 近年来，人们利用这一原理针对靶基因表达进行阻断，从而产生相应的功能缺失 表型用于科学研究，或疾病治疗，形成RNAi技术。根据RNAi原理，既可以在体外直接合成 以核心序列为基础的RNA双链（siRNA)转入细胞，也可以利用不同的DNA表达载体携带核 心序列在体内表达形成短发夹状RNA(shRNA)，起到特异性识别与降解相应的靶基因 mRNA， 或封闭其翻译的效果。虽然RNAi技术提供了一种对任何基因进行靶向干预调控的手段，在 生物医学基础研究和疾病治疗领域具有重要的应用价值和前景，但其前提是必需针对靶基 因对象展开分析、预测和实验筛选，找到一段特异和有效的核心序列，然后以此核心序列为 基础，通过如上所述的通用方法实施对靶基因在蛋白水平的表达干扰。
[0004] EHD2 (C-terminal EH domain-containing protein 2)属于 Ε? 蛋白家族，是一种 新型膜转运调控蛋白，对受体内吞及分子转运起关键作用。在肿瘤中，EHD2的表达情况与肿 瘤紧密相关，对EHD2表达水平的干预与调控对肿瘤研究及疾病治疗具有重要意义。为了进 一步研究EHD2在肿瘤发生发展中的作用以及为EHD2为靶点的肿瘤的基因治疗提供新的技 术手段，本发明公布了一段抑制人或哺乳动物细胞EHD2基因表达的RNA干扰序列，这是一 段与人或哺乳动物细胞中EHD2 mRNA同源的核酸序列，以此序列为核心序列，可以开发出各 种基于RNA干扰原理的EHD2干扰技术用于抑制EHD2蛋白的表达水平，包括直接合成siRNA 后通过转染（Transfection)技术引入人或哺乳动物细胞，或构建DNA载体通过转染或病毒 感染技术引入体外培养细胞或体内细胞等，从而达到降低EHD2蛋白表达水平的目的。
【发明内容】
[0005] 为进一步研究EHD2在肿瘤发生发展中的作用以及为EHD2为靶点的肿瘤等疾病的 基因治疗提供了一个新的技术手段，本发明提供了一段抑制人或哺乳动物细胞EHD2蛋白 表达水平的RNA干扰序列，该RNA干扰序列与EHD2的mRNA互补，具有抑制或降低EHD2蛋 白表达的功能。
[0006] 本发明的目的是通过如下的技术方案来实现的：
[0007] 通过直接合成以本发明所公开的序列为核心的双链RNA，或通过构建以本发明所 公开的序列为核心的DNA表达载体，经转染或病毒感染等常规转基因手段引入人或哺乳动 物细胞，利用细胞RNA干扰原理，起到对细胞内EHD2的mRNA的识别降解或蛋白翻译抑制效 果。
[0008] 利用本发明技术，可以对EHD2的生物学作用进一步展开广泛深入的基础研究，并 可为以EHD2为靶点的肿瘤等疾病的基因治疗等转化研究与临床应用提供新的有效手段。
[0009] 该序列的DNA脱氧核糖核酸序列如下：
[0010] 5' -ACCAAGGACAAGTCCAAATAC-3'，具体为国际通用基因序列号为 NM_014601 的 EHD2基因序列中的第1339至第1359位核苷酸。
[0011] 与此DNA序列对应的RNA核糖核酸序列为：
[0012] 5' -ACCAAGGACAAGUCCAAAUAC-3'
[0013] 其特征是：通过以该核糖核酸序列作为核心序列合成基因干扰RNA片段，或以该 脱氧核糖核酸序列作为核心序列构建DNA表达载体，经转基因技术引入人或哺乳动物细胞 后，在细胞内产生对EHD2 mRNA的特异性识别，从而起到抑制EHD2蛋白翻译、降低EHD2蛋 白表达水平的作用。这项技术可以用于对EHD2作用机制的广泛研究，以及进行以EHD2为 靶点的肿瘤等疾病的干预与治疗。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明的有益效果为：
[0016] 本发明公开了一段抑制人或哺乳动物细胞EHD2蛋白表达水平的RNA干扰核心序 列，该序列能够有效地抑制或降低EHD2的蛋白表达，为深入研究EHD2的生物学作用以及为 肿瘤等疾病的临床治疗提供了可行的手段。
【附图说明】
[0017] 图1是转入EHD2干扰序列为核心的核酸后细胞EHD2蛋白表达水平受到抑制的免 疫印迹检测结果。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
[0019] 实验材料来源：
[0020] 人宫颈癌Hela细胞、人乳腺癌Bcap37细胞、人非癌乳腺上皮细胞HbllOO购于美 国 American Type Culture Collection(ATCC)公司，由本公司保存。pCMV/Neo 质粒和阴性 对照Ctrl-siRNA质粒购自上海吉凯公司；Neomycin购自Invitrogen公司。EHD2抗体为抗 原纯化的兔抗人多克隆抗体，由本公司制备，为非商品化试剂，已申请专利。
[0021] 实施方法：
[0022] I. EHD2干扰序列的合成
[0023] 以本发明中的RNA干扰序列为核心序列（由下划线标出），合成以下DNA片段及其 反义片段：
[0024] 5' -AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAACCAAGGACAAGTCCAAATACAGTGAAGCCACAGATGT AGTATTTGGACTTGTCCTTGGTCTGCCTACTGCCTCGCAATTC-3，
[0025] 2. EHD2-shRNA表达载体构建
[0026] 表达载体pCMV/Neo用Xho I和EcoR I酶切形成粘性末端。将上述合成的EHD2 干扰DNA片段退火，连入pCMV/Neo质粒载体中，转染感受态大肠杆菌DH5 α后，铺平板过夜 培养。挑取转化菌扩增培养并提取质粒，测序验证插入序列。
[0027] 阴性对照Ctrl-shRNA载体由吉凯公司提供，含有一段与人类已知基因均不同源 的 shRNA。
[0028] 3.载体转染乳腺癌细胞株
[0029] 上述质粒在脂质体介导下分别转染细胞，5% 0)2温箱孵育48h。添加0. 25mg/ml Neomycin筛选至无转染对照组细胞完全死亡，约14天。
[0030] 4.检测转染后细胞中EHD2的表达水平
[0031] 采用免疫印迹的方法检测EHD2的表达水平，将对照细胞和EHD2-shRNA转染的细 胞用RIPA裂解液裂解，用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定，取相同蛋白总量进行SDS-PAGE 电泳，将胶上蛋白电转到PVDF膜，室温5%牛奶封闭1小时。洗涤后加一抗（兔抗人EHD2 抗体）室温孵育1小时，然后用兔二抗室温孵育1小时，最后用增强化学发光试剂盒检测。 对曝光条带进行定量分析。实验重复3次以上。
[0032] 本发明实施效果：
[0033] 见图1，EHD2_shRNA表达载体转染入三种人源细胞，通过免疫印迹的方法证明：与 对照细胞相比，干扰细胞中EHD2蛋白表达量明显降低。
[0034] 从以上结果得出：本发明设计的EHD2特异的核心序列可以对细胞中EHD2基因表 达进行干扰并有效抑制EHD2蛋白的表达，为进一步研究EHD2的作用及临床治疗提供了可 行的手段。
[0035] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一段能够特异性抑制人或哺乳动物EHD2基因表达的核酸序列，其特征在于，该序列 与人或哺乳动物EHD2mRNA互补，干扰或抑制其蛋白翻译，该序列的DNA脱氧核糖核酸序列 如下： 5' -ACCAAGGACAAGTCCAAATAC-3'，其对应的RNA核糖核酸序列为： 5' -ACCAAGGACAA⑶CCAAAUAC-3'。2. -种抑制人或哺乳动物EHD2基因表达的小RNA干扰技术，其特征在于，以权利要求 1中所述的一段能够特异性抑制人或哺乳动物EHD2基因表达的核酸序列为核心序列制备 基因干扰RNA片段或构建DNA表达载体。3. 如权利要求2所述的一种抑制人或哺乳动物EHD2基因表达的小RNA干扰技术，其 特征在于，将制备的基因干扰RNA片段或构建的DNA表达载体经转基因技术引入人或哺乳 动物细胞后，在细胞内产生对EHD2mRNA的特异性识别，从而起到抑制EHD2蛋白翻译、降低 EHD2蛋白表达水平的作用。
【专利摘要】本发明公开了一段人或哺乳动物EHD2(C-terminal？EH？domain-containing？protein2)基因特异的核酸序列，该序列与EHD2的mRNA互补，可以在细胞内通过识别EHD2mRNA的同源序列干扰或抑制EHD2蛋白翻译。该序列的DNA脱氧核糖核酸序列为：5’-ACCAAGGACAAGTCCAAATAC-3’。以此序列为核心的基因干扰技术可用于抑制人或哺乳动物细胞EHD2蛋白的表达。
【IPC分类】C12N15/113
【公开号】CN105400788
【申请号】CN201511004588
【发明人】应国光, 刘博
【申请人】天津市应世博科技发展有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月25日