嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及CRISPR_Cas9系统识别的靶序列和sgRNA及它们 的相关应用。
【背景技术】
[0002] 获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)又称艾滋 病，是一种危害性极大的传染病。自发现的三十多年来，AIDS已累计导致两千余万人死亡， 一直是一个巨大的公众健康难题，影响着全球3, 530万人的生活。AIDS是由人类免疫缺陷 病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的，HIV是一种感染人类免疫系统细 胞的慢病毒，属反转录病毒的一种，又称为艾滋病毒。HIV可分为HIV-I和HIV-2两种亚型， HIV-I的致病力强，是引起艾滋病的主要病原体。
[0003] ⑶4+T细胞是HIV-I病毒感染过程的首要靶点，随后研究又发现仅有⑶4分子并不 能介导HIV-I病毒的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体（coreceptor)。1996年证实， 趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-I病毒感染的辅助受体。其中，趋化因子CCR5,作为G 蛋白親联受体（G-protein coupled receptor，GPCR)超家族的细胞膜蛋白，是HIV-I入侵 机体细胞的主要辅助受体之一。CCR5主要在静止期记忆性T淋巴细胞、单核细胞和未成熟 的树突状细胞的膜上表达，是HIV-I入侵人体时重要的辅助受体，它作为HIV-I入侵机体细 胞的主要辅助受体之一，在治疗艾滋病研究中是一个重要的药物靶点。
[0004] 目前对艾滋病的治疗手段主要是控制HIV-I病毒的感染以及阻碍AIDS的发展，称 为高效抗逆转录病毒治疗法（highly active antiretroviral therapy，HAART)，包括一系 列抑制病毒各个繁殖阶段的化合物。HAART是能很大程度上减少细胞内病毒的繁殖和血浆 病毒血症的发生，但对于新的宿主细胞不被HIV-I感染没有作用。为了从源头上预防健康 的细胞被HIV-I感染，新的治疗方案需要彻底地破坏病毒的入侵途径，因而以CCR5为靶点 的HIV-I受体拮抗剂越来越受关注，主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆 抗体、肽类化合物等。经典的CCR5拮抗剂抑制R5嗜性的HIV-I感染细胞的机制是：它们 与CCR5结合后，使CCR5构象改变，导致CCR5的内源化作用（internalization)或者不利 于HIV-I的识别，阻断HIV-I与细胞膜蛋白的结合，导致HIV-I与CCR5在细胞表面的结合 减少，从而起到抗感染的作用。但不幸的是长期使用一种抑制剂，最终会使HIV-I产生耐 药性，随着耐药性的不断出现，使得现有的抗HIV-I药物难以达到理想的治疗效果。同时， CCR5拮抗剂还存在如下缺点，例如，天然趋化因子的半衰期短和存在潜在的诱导炎症应答 作用；非肽类小分子化合物不能下调受体表达；肽类化合物不稳定、易降解；单克隆抗体存 在人体对药物的不适应性、潜在的过敏反应等缺点。
[0005] 近年来，随着革巴向基因编辑技术的一步步突破，从ZFN(zinc finger nuclease) 到后来的 TALEN(transcription activator-like effector nuclease)以及最新的 CRISPR-Cas9技术，为艾滋病的彻底治愈提供了新的希望。研究表明带有CCR5编码基因32 个核苷酸缺失的实验者接触HIV但未检测到HIV感染，表明了 CCR5影响HIV病毒入侵细胞， 说明CCR5基因是一个可靠、高效和安全的治疗HIV的靶点，因此能够实现CCR5在基因组层 面上的敲除也是可靠、高效和安全的治疗HIV的方法。2008年，Sangamo成功地利用ZFNs 在CD4+T细胞上实现CCR5的敲除，然而ZFN靶向敲除CCR5的效率较低，人们期待找到更高 效的CCR5的敲除策略。
[0006] 规律成族间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR-associated，CRISPR_Cas9)是一种具有核酸内切酶活性 的复合体，是细菌和古细菌在进化过程中形成的一种免疫防御体系，用以对抗外来病毒 和外源DNA入侵。CRI SPR-cas9系统通过整合外源DNA片段到CRISPR中，利用CRISPR RNA (CRISPR-derived RNA，crRNA)和反式作用 RNA (trans-activating RNA，tracrRNA)特 异性地识别靶向序列，并对序列靶位点进行切割。在没有模板的条件下，发生非同源重组末 端连接（Non-homologous end joining，NHEJ)，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入 或缺失（indel)，造成移码突变，导致基因敲除。或者是在有同源模板的情况下，可通过另一 条同源重组（homologous recombination，HR)的修复途径进行修复，可实现对革El向基因的 精确编辑，如引入特异突变或定点转基因。现在已经把两种小RNA (crRNA和tracrRNA)融 合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)，因此，能够设计、制备出精确性和特异性 靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种CRISPR_Cas9系统识别的靶序列 以及精确特异地靶向人CCR5基因的sgRNA和它们的有关应用。
[0008] 因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种CRISPR-Cas9系统识别的 靶序列，所述靶序列如SEQ ID NO: 1-30中任意一个的第n-30位所示且η = 1-12。
[0009] 第二方面，本发明提供了一种sgRNA，该sgRNA的序列为：5'_识别序列-招募Cas9 蛋白的序列-3'，其中，所述识别序列对应的DNA序列如SEQ ID N0:l-30中任意一个的第 n-30位所示且η = 1-12。
[0010] 第三方面，本发明提供了编码第二方面所述的sgRNA的DNA分子。
[0011] 第四方面，本发明提供了一种CRISPR_Cas9系统，该CRISPR_Cas9系统包括Cas9 蛋白和sgRNA、和/或包括携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述 Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上，其中，所述sgRNA为第 二方面所述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)。
[0012] 第五方面，本发明提供了一种编辑CCR5基因的方法，该方法包括：将第四方面所 述的CRISPR-Cas9系统导入表达CCR5的细胞中。
[0013] 第六方面，本发明提供了第四方面所述的CRISPR_Cas9系统在制备用于预防和/ 或治疗HIV感染的药物中的应用。
[0014] 第七方面，本发明提供了一种预防和/或治疗HIV感染的方法，该方法包括将第四 方面所述的CRISPR-Cas9系统导入表达CCR5的细胞中。
[0015] 本发明可以实现人CCR5基因的编辑，进而改变CCR5的序列，尤其是和HIV表面蛋 白结合的序列，导致细胞无法被HIV感染，从而实现预防和/或治疗艾滋病的目的。
[0016] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0017] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0018] 图1为表达SgRNA的重组质粒的结构示意图；
[0019] 图2为表达StCas9的重组质粒的结构示意图；
[0020] 图3为同时表达SgRNA和StCas9的重组质粒的结构示意图；
[0021] 图4为根据本发明的一种实施方式对HEK293T细胞的CCR5基因进行敲除后的测 序结果。
【具体实施方式】
[0022] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0023] 在本发明中，在未做相反说明的情况下，使用的术语"基因敲除"或"基因编辑"是 指对生物的基因组DNA进行删除、插入或者替换，从而达到对目的序列修改的目的；本发 明涉及的sgRNA和CRISPR_Cas9系统均为人工改造而成的（engineering，non-naturally occurring)〇
[0024] 在第一方面中，本发明提供的CRISPR-Cas9系统识别的靶序列如SEQ ID NO: 1-30 中任意一个的第 n-30 位所示且 n = 1-12(整数，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12)。
[0025] 在第二方面中，本发明提供的sgRNA的序列为：5' -识别序列-招募Cas9蛋白的 序列-3'，其特征在于，所述识别序列对应的DNA序列如SEQ ID NO: 1-30中任意一个的第 n-30 位所示且 n = 1-12(整数，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12)。其中，表示多核苷 酸元件（识别序列和招募Cas9蛋白的序列）以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能， 被连接的多核苷酸序列是连续的。
[0026] 所述招募Cas9蛋白的序列为能够招募Cas9蛋白的序列，即结合Cas9蛋白并使其 活化而能够切割目标基因的序列，通常具有特定的二级结构（如茎环结构）。优选地，所述 招募Cas9蛋白的序列如SEQ ID NO :31-34所示。
[0027] 所述Cas9蛋白可以来源于嗜热链球菌（S. thermophilus)，如在UniProt中的 Entry Name为CAS9_STRTR的蛋白。Cas9蛋白的氨基酸序列也可参见NCBI的EWM58113. 1、 WP_011681470. 1、sp|G3ECRl. 2|CAS9_STRTR、WP_014727651. 1、WP_024703962. 1、 WP_014608595. UETE40675. UETE40173. I 或 EWM55849. I 等。例如，Cas9 蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO:42所示。
[0028] 根据本发明的一种优选实施方式，所述识别序列对应的DNA序列如SEQ ID NO: 22 所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQ ID NO:33所示。该优选的sgRNA能够更有效地编辑 (敲除）CCR5基因。
[0029] 在第三方面中，本发明提供了编码第二方面所述的sgRNA的DNA分子。
[0030] 在第四方面中，本发明提供的CRISPR_Cas9系统包括Cas9蛋白和sgRNA、和/或 包括携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述Cas9蛋白的编码序列 和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上，所述sgRNA为第二方面所述的sgRNA且所 述Cas9蛋白源自嗜热链球菌。
[0031] 所述载体为能够传递所携带的核酸（编码序列）的核酸分子。所述载体可以为质 粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等。在特定的实施方式中，所述载体为真核表达载体，如 pcDNA3〇
[0032] 携带有sgRNA的编码序列的载体的结构可以如图1所示。携带有Cas9蛋白的编 码序列的载体的结构可以如图2所示。同时携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码 序列的载体的结构可以如图3所示。
[0033] 如上所述，所述Cas9蛋白的编码序列来源于嗜热链球菌，且可以为经密码子优化 后适于在真核细胞中表达的序列（如SEQ ID NO:38第3815-8107位所示的序列）。
[0034] 根据本发明的优选实施方式，所述sgRNA为"识别序列对应的DNA序列如SEQ ID NO:22所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQ ID NO:33所示"的sgRNA。
[0035] 在第五方面中，本发明提供的编辑CCR5基因的方法包括：将第四方面所述的 CRISPR-Cas9系统导入表达C