应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法
【技术领域】
[0001]本发明属于高通量测序技术领域，尤其是涉及一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法。
【背景技术】
[0002]致癌基因和抑癌基因都是癌症基因治疗的潜在靶点，因此其鉴定在癌症的治疗中有着巨大的应用前景，目前已经针对致癌基因EGFR、Aik等基因开发出治疗癌症的药物。但是目前有效的癌症基因靶向药物还远远不能满足临床治疗的需要。基于CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clusteredregularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9)的大规模功能基因筛选技术作为近几年的基因工程新兴技术，能够在全基因组层面筛选癌症相关基因，从而为癌症的治疗提供药物靶点候选基因。
[0003]目前CRISPR/Cas9screen技术只在国内外少数实验室应用，并未推广。并且该方法在使用过程中需要高通量测序，因为sgRNA的模板只占基因组DNA中的很小部分，为了达到足够的sgRNA覆盖率，需要对大量的DNA进行建库，因此现有的建库方法费时费力，并且需要大量的PCR酶，经济负担也比较大。为解决以上问题，需要一种能够大量富集sgRNA的方法，以便于后续测序。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法。
[0005]本发明方法首先建立sgRNA文库；然后用慢病毒包装sgRNA文库，并收集病毒；之后在癌细胞系中筛选sgRNA文库；再提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA ;最后富集基因组DNA中的sgRNA。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0007]—种应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法，该方法包括以下步骤:
[0008](1) s gRNA 文库建立:
[0009]利用网站http://crisprscan.0rg 或 http://www.e-crisp, org 在线设计待筛选癌症基因群的sgRNA，或直接在addgene上购买靶向于全基因组sgRNA文库，sgRNA的载体采用 Lenti CRISPRv2 ；
[0010](2)用慢病毒包装sgRNA文库:
[0011 ] 无菌条件下，培养293FT细胞，并用Roche的转染试剂X-tremeGENE HP DNATransfect1n Reagent 将 Lenti CRISPRv2 及另外两种病毒包装质粒 psPAX2 和 pMD2.G 共转染至293FT细胞中，培养细胞，收获病毒液；
[0012]CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G 按照质量比 4:3:1 的比例转染 293FT 细胞。LentiCRISPRv2 与 X-tremeGENE HP DNA Transfect1n Reagent 的比例关系为 6 μ g:30 μ L，以10cm的培养皿为例，Lenti CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的质粒质量分别为6 μ g、4.5 μ g、1.5 μ g，X-tremeGENE HP DNA Transfect1n Reagent 的量为 30 μ Lo
[0013]细胞转染后15小时换液，并于之后的24小时和48小时收取病毒液，将两次收取的病毒液轻轻混匀，用0.44 μ Μ的滤器过滤病毒液，除去细胞碎片。
[0014](3) sgRNA文库在细胞中的筛选:
[0015]选取合适的病毒量，感染待检测的癌细胞系，感染48小时后，用puromycin筛选2天，所得阳性细胞收取部分作为对照组，其他细胞继续培养至40-46天后收取作为实验组；
[0016]病毒感染效率通过感染病毒细胞对puromycin的抗性进行检测，在六孔板中培养细胞至融合度70 %，用100 μ L、200 μ L、300 μ L、400 μ L、500 μ L的病毒液感染细胞，取能感染45-55%细胞的病毒量作为合适病毒量进行后续试验。
[0017](4)提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA:
[0018]用细胞裂解液裂解细胞，吹打混匀后，加入RNase酶，65°C孵育30分钟，再加终浓度为10 μ g/ml的蛋白酶K，55°C孵育过夜，用纯化液抽提DNA片段；
[0019]细胞裂解液的成分为400 μΜ NaCl.0.2% SDS(以质量分数计)、2mM EDTA、10mMTris-HClo
[0020]纯化液为体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液。
[0021](5)富集基因组DNA中的sgRNA:
[0022]用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，37 °C反应过夜，将酶切后的DNA片段放置在0.8被％的低熔点琼脂糖胶中，80V，1小时电泳，切胶回收1600-2000bp的DNA片段；
[0023]限制性内切酶反应体系为:50yL中，含有6yg DNA, 5 μ L 10 X NEB buffer，限制性内切酶EcoN I 3yLo
[0024](6) sgRNA文库构建与测序:
[0025]文库按照illumina公司的建库试剂盒说明书构建，将建好文库进行Hiseq2000的50SE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。
[0026]待检测的癌细胞系包括肺癌细胞与肝癌原代细胞。
[0027]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0028]1、本发明在慢病毒包装中，选用Roche的转染试剂X-tremeGENE HP DNATransfect1n Reagent 将 Lenti CRISPRv2 及另外两种病毒包装质粒 psPAX2 和 pMD2.G共转染至293FT细胞中，培养细胞，收获病毒液；并且通过大量实验确定了 CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G按照质量比4:3:1的比例转染293FT细胞，并且确定Lenti CRISPRv2与X-tremeGENE HP DNA Transfect1n Reagent 的比例关系为 6 μ g:30 μ L。之前的相关方法中常用的CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G按照质量比为3:2:1。本专利中的发明在此基础上做了一系列质量比，确定4:3:1的比例包装的病毒的感染效率最高，并且此质量比例更接近质粒摩尔比1:1:1，更符合慢病毒在自然状态下的包装比例。
[0029]2、本发明对细胞的筛选过程做了改进，利用被感染细胞的puromycin抗性，用简便的方法确定了病毒感染效率，确定了病毒Μ0Ι值。
[0030]3、本发明采用限制性内切酶切方法与高通量方法相结合。限制性内切酶EcoN I能够特异性识别Lenti CRISPRv2上的两个位点，并切下一个1670bp的含有sgRNA的片段。EcoN I在基因组上为稀有位点，因此DNA被EcoN I酶切后主要集中在2000bp以上的位置。之后胶回收的方法能够将1600bp-2000bp的DNA片段富集，其中含有sgRNA的片段在模板DNA的比例大大提高，大多数非目的DNA被除去。因此，本发明不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低非特异性PCR扩增产生的假阳性，能够高效扩增sgRNA的DNA模板，提高了建库效率。
[0031]4、本发明方法建库效率高，需要的PCR酶也少。依照常规方法，107细胞得需要提出6.6 μ g的DNA作为模板进行后续试验，本发明只需要66ng就足够。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0033]实施例1
[0034]对肺癌细胞PC9进行癌症相关基因的筛选。具体方法如下:
[0035](1) sgRNA 文库建立:
[0036]利用网站http://crisprscan.0rg 和 http://www.e-crisp, org 在线设计与癌症相关的基因群的sgRNA。sgRNA的载体采用Lenti CRISPRv2。
[0037](2)用慢病毒包装sgRNA文库:
[0038]无菌条件下，培养293FT细胞，并用Roche的转染试剂X-tremeGENE HP DNATransfect1n Reagent 将 Lenti CRISPRv2 及另外两种病毒包装质粒 psPAX2 和 pMD2.G 包装慢病毒。细胞转染后15小时换液，并于之后的24小时和48小时收取病毒液，将两次收取的病毒液轻轻混匀，用0.44 μ Μ的滤器过滤病毒液，除去细胞碎片；
[0039]以10cm的培养皿为例，Lenti CRISPRv2、psPAX2、pMD2.G的质粒质量分别为6 μ g、4.5 μ g、1.5 μ g，X-tremeGENE HP DNA Transfect1n Reagent 的量为 30 μ L。
[0040](3) PC9细胞中筛选sgRNA文库
[0041]选取合适的病毒量，感染PC9，48小时后，用puromycin筛选2天，所得阳性细胞收取部分作为对照组，其他细胞继续培养至40天后收取。
[0042]病毒感染效率通过感染病毒细胞对puromycin的抗性进行检测，在六孔板中培养细胞至融合度70 %，用100 μ L、200 μ L、300 μ L、400 μ L、500 μ L的病毒液感染细胞，取能感染45-55%细胞的病毒量作为合适病毒量进行后续试验。
[0043](4)提取筛选所得细胞及筛选前细胞的基因组DNA
[0044]用细胞裂解液裂解细胞，吹打混匀后，加入RNase酶，65°C孵育30分钟，再加终浓度为10 μ g/ml的蛋白酶K，55°C孵育过夜。用纯化液(体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液)抽提DNA片段；
[0045]细胞裂解液的成分为400 μΜ NaCl、0.2% SDS(以质量分数计)、2mM EDTA、10mMTris-HClo
[0046](5)富集基因组DNA中的sgRNA
[0047]用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，37 °C反应过夜，将酶切后的DNA片段放置在0.8被％的低熔点琼脂糖胶中，80