紫草素及其衍生物作为基因治疗增敏剂的应用的制作方法

紫草素及其衍生物作为基因治疗增敏剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及紫草素及其衍生物在制备基因治疗增敏剂中的应用。本发明优点在于：紫草素及其衍生物作为基因治疗增敏剂具有相对较小的毒性；使用紫草素及其衍生物联合基因治疗进行恶性肿瘤治疗时，紫草素及其衍生物本身的抗癌作用与其增强的基因治疗的作用叠加，可以最大发挥抗肿瘤作用。
【专利说明】紫草素及其衍生物作为基因治疗增敏剂的应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及基因治疗领域，具体地说，是紫草素及其衍生物作为基因治疗增敏剂的应用。

【背景技术】
[0002]紫草(英文名:Lithospermum erythrorhizon)是中医学常用中药,入药种属及部位为紫草科植物紫草、新藏假紫草或滇紫草的根。性寒，味甘、咸；归心、肝经；功效:凉血止血，清热解毒；主治:血热壅盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。紫草素是紫草的主要有效成分之一，分子式:C16H16O5，分子量:288.30 g/mol。紫草素具有抗炎作用，这种作用是通过抑制肿瘤坏死因子_a (TNF-a)造成的，而TNF_a是形成和持续炎症的重要因素。另外紫草素还具有抗细菌，抗真菌，和抗HIV的作用。
[0003]基因治疗(Gene therapy)是利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗，为现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术。rAAV是目前基因治疗领域应用最广泛的病毒载体，目前正在越来越多地应用到肝癌的基因治疗中。使用rAAV作为载体的研究都取得了一定的肝癌抑制效果，但并没有确定靶向肝癌最好的rAAV血清型；而作为杀伤性治疗，对肝癌细胞的独特靶向性是至关重要的。另夕卜，临床使用rAAV，降低用量，保证安全至关重要，怎样将对肝癌靶向性最好rAAV感染效率最大化，目前还没有人提出解决方案。


【发明内容】

[0004]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供紫草素及其衍生物在制备基因治疗增敏剂中的应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:紫草素及其衍生物在制备基因治疗增敏剂中的应用。
[0006]所述的基因治疗是指基于病毒为载体的基因治疗。
[0007]所述的病毒是腺相关病毒。
[0008]所述的腺相关病毒是2型、3型、8型腺相关病毒。
[0009]所述的基因治疗是以腺相关病毒为载体对肝癌的基因治疗。
[0010]所述的紫草素衍生物是乙酰紫草素、去氧紫草素、消旋乙酰紫草素、1-甲氧基乙酰紫草素、β，β二甲基丙烯酰紫草素、2，3-二甲基戊烯酰紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、β，β - 二甲基丙烯阿卡宁、乙酰阿卡宁、β -乙酰氧基异戊酰阿卡宁、β -羟基异戊酰阿卡宁。
[0011]所述的紫草素衍生物是乙酰紫草素、β，β 二甲基丙烯酰紫草素。
[0012]所述的基因治疗是以携带天花粉蛋白基因的优化3型腺相关病毒为载体对肝癌的基因治疗。
[0013]本发明优点在于: 1、紫草素及其衍生物作为基因治疗增敏剂具有相对较小的毒性。已经发现的常用蛋白酶体抑制剂MG132具有较高的毒性，不能应用于临床，硼替佐米作为一种蛋白酶体抑制剂用于临床抗癌治疗也产生了一定的毒副反应，紫草素及其衍生物作为植物来源的物质，在发挥基因治疗增敏剂的作用时毒副作用较小；
2、使用紫草素及其衍生物联合基因治疗进行恶性肿瘤治疗时，紫草素及其衍生物本身的抗癌作用与其增强的基因治疗的作用叠加，可以最大发挥抗肿瘤作用。基因治疗目前最常用的载体类型是病毒载体，其中又因非致病性而对腺相关病毒使用越来越广泛，利用腺相关病毒的特殊靶向性治疗恶性肿瘤是目前基因治疗的研究热点之一，在这一过程中紫草素及其衍生物作为蛋白酶体抑制剂本身就具有对肿瘤细胞的选择性杀伤作用，携带治疗基因的腺相关病毒的治疗作用被紫草素及其衍生物增强之后，可以叠加产生更强的抗肿瘤作用。

【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1.体外实验挑选最佳中药单体，DMSO作为阴性对照，MG132作为阳性对照。(A)HeLa细胞，不同药物在多个浓度下处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV2_CMVp_hrGFP病毒，并药物共同作用2小时，48小时后拍摄GFP照片，ImageJ软件分析。(B)与实验(A)相同方法，仅测试更小浓度跨度的紫草素效果。(C)HeLa细胞，所示4种药物在实验(A)中得出的最佳浓度处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，并药物共同作用2小时，48小时后拍摄EGFP照片，ImageJ软件分析。(D)实验(C)细胞拍照过后进行流式细胞术检测。(E)HeLa细胞5，000 MOI感染rAAV2_CB_EGFP病毒，48小时后5 μ M紫草素或DMSO处理2小时，再48小时后拍摄EGFP照片，ImageJ软件分析。
[0015]图2.紫草素提高rAAV在肝癌细胞中的感染效率，DMSO作为阴性对照，MG132作为阳性对照。(A) Huh7细胞，紫草素多个浓度下处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV3-CB-EGFP病毒，并药物共同作用2小时，48小时后拍摄GFP照片，ImageJ软件分析。(B)与实验(A)相同方法，仅换成rAAV2-CB-EGFP病毒。(C)Huh7细胞，紫草素采用实验(A)测得的最佳浓度处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV3-UF50病毒，并药物共同作用2小时,48小时后拍摄M-apple突光照片，ImageJ软件分析。(D)实验(C)的细胞拍照过后进行Fluc信号检测。(E)紫草素化学结构式。
[0016]图3.紫草素不改变AFP特异性启动子的rAAV3在人肝脏细胞中的转基因表达水平。(A)人肝细胞，紫草素多个浓度下处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV2-UF50病毒，并药物共同作用2小时，48小时后检测荧光素酶信号。(B)人肝细胞，紫草素多个浓度下处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV3-UF50病毒，并药物共同作用2小时，48小时后检测Fluc信号。(C) 5，000 Μ0Ι, rAAV3_AFP_EGFP病毒感染所示细胞，48小时后拍摄EGFP荧光照片，图中为各组代表性照片。
[0017]图4.体内实验验证紫草素对rAAV的增强效果。(A)C57BL/6小鼠，腹腔注射紫草素 lmg-3mg/kg/day,第 3 天通过尾静脉系统注射 rAAV8-CB-Fluc_EYFP, I X 109vgs/mouse,第90天拍摄活体荧光照片，图为各组代表性小鼠照片。(B)实验(A)中各组小鼠在所示不同时间点拍摄活体荧光照片后，统计分析荧光强度。(C)实验(A)中所示两组小鼠第90天处死，每鼠取等量肝组织提取全DNA并取三份，每份10ng qPCR检测病毒基因组数量。
[0018]图5.紫草素增强rAAV感染效率的机理。(A) Cy3染料标记的，或未标记的rAAV2-CB-Fluc病毒，分别2，000Μ0Ι，或20，000Μ0Ι感染HeLa细胞2小时，48小时后检测相对Fluc信号信号强度。(B) Cy3染料标记的，或未标记的rAAV2_CB_Fluc病毒，2，000Μ0Ι感染HeLa细胞，感染前I小时和感染时2小时，同时紫草素5 μ M处理或DMSO处理，感染48小时后检测相对Fluc信号信号强度。(C) Cy3染料标记的rAAV2-CB_Fluc病毒感染HeLa细胞，感染前I小时和感染时2小时，同时DMSO或紫草素5 μ M或MG132 5 μ M处理，分别在感染后2小时和24小时后冲洗并固定细胞，DAPI染色细胞核，拍摄共聚焦照片。绿色:细胞核，蓝色:细胞质，红色:Cy3。
[0019]图6.紫草素增强rAAV感染效率的机理。(A) HeLa细胞，如图所示药物处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，并药物共同作用2小时。感染24小时后分离细胞质和细胞核，分别提取全DNA，用EGFP基因特异性引物进行qPCR检测。(B)HeLa细胞，如图所示药物处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，并药物共同作用2小时。24小时后提取细胞总RNA，用随机引物进行逆转录，并用EGFP特异性引物进行定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。(C)HeLa细胞，如图所示药物处理I小时，然后5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，并药物共同作用2小时。2小时后收集获取细胞并裂解，用泛素蛋白特异性抗体做western blot，GAPDH作为参照。(D) C57BL/6小鼠，尾静脉注射rAAV8_UF50病毒，I X 109vgs/mouse, 100天后腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day,连续5天，并在如图所示时间点拍摄活体荧光照片并统计分析。
[0020]图7.紫草素对肝细胞癌的体外抑制作用。(A)所示细胞系同样数量培养在96孔板中，用等倍稀释的紫草素作用24小时，CCK-8试剂盒检测活细胞相对数量，未加药组设为100%。(B)所示细胞系同样数量培养在96孔板中，用等倍稀释的紫草素作用24小时，CCK-8试剂盒检测活细胞相对数量，未加药组设为100%。(C)实验(B)同样处理的细胞用LDH试剂盒检测杀伤细胞相对数量，加细胞裂解液组设为100%。
[0021]图8.紫草素对肝细胞癌的体内抑制作用。(A) NSG小鼠，右前肢腋窝皮下种植Huh7-Fluc肿瘤,待肿瘤生长至5mmX 5mm时开始腹腔注射紫草素lmg/kg/day,连续注射10天后活体荧光成像仪图片。(B)实验A的小鼠体内肿瘤在不同时间点的荧光信号强度量化数据。(C)停止用药后第5天两组小鼠的体重。
[0022]图9.紫草素对小鼠正常脏器的影响。健康C57BL/6雄性小鼠15只，如图随机分为三组，腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day，或紫草素4mg/kg/day，连续注射10天后处死小鼠，检测血清 AST (A)、ALT (B)、ALP (C)值。
[0023]图10.试验中使用的rAAV基因组图谱及TCS基因序列。(A) rAAV-CBAp-FIuc,rAAV-CBAp-EGFP，rAAV-AFPp-TCS病毒基因组结构示意图。(B ) TCS基因原始核苷酸序列，起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)分别用绿色和红色标记。(C)添加旗帜标签的(Flag-tagged)TCS基因。Eco TtV和ZAo I限制性内切酶位点(加粗斜体)用于克隆化学方法合成的TCS基因，下划线字体为包含终止密码子(TAA)的旗帜标签序列。
[0024]图11.TCS基因载体的构建。(A)质粒pdsAAV-AFP-EGFP图谱；(B)质粒pdsAAV-AFP-TCS-Flag 图谱；(C)质粒 pdsAAV-AFP-TCS-TAA 图谱。
[0025]图12.天花粉基因体外对肝癌细胞的杀伤作用。(A)如图所示质粒PEI方法转染Huh7细胞，48小时后CCK-8试剂盒检测存活细胞相对量；(B)如图所示病毒100，000Μ0Ι感染Huh7细胞，48小时后CCK-8试剂盒检测存活细胞相对量。
[0026]图13.携带TCS基因的rAAV3对肝癌的体内杀伤作用。(A)第O天荷Huh7_Fluc肿瘤的小鼠尾静脉注射病毒5 X 101° vgs/mouse,从第O天到第11天多次活体成像仪检测肿瘤表达的Fluc信号；(B)第8天各组具有代表性的小鼠照片；(C)第11天处死小鼠后检测血清中AST，ALT浓度。
[0027]图14.紫草素与携带TCS基因的优化rAAV3共同治疗肝癌的体内效果。如图所示组别在第O天尾静脉注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP病毒或rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag或PBS，并在第O天到第11天腹腔注射紫草素或PBS，活体成像仪在图示的时间拍摄小鼠全身活体照片读取并统计肿瘤部位Fluc信号。
[0028]图15.联合治疗终点小鼠肿瘤直径。图9试验中小鼠第11天处死并解剖获取肿瘤，游标卡尺测量肿瘤最大直径。
[0029]图16.紫草素与携带TCS基因的rAAV3共同治疗肝癌对小鼠的肝功能影响。图9试验中小鼠第11天处死后取血检测血清中AST (A)、ALT (B)浓度。
[0030]图17.乙酰紫草素对rAAV感染效率的影响。
[0031]图18.β，β -二甲基丙烯酰紫草素对rAAV感染效率的影响。
[0032]【【具体实施方式】】
下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0033]实施例1紫草素对rAAV感染效率的影响一、实验材料与方法
1.化合物，质粒，引物
高效液相层析(HPLC)级别的雷公藤红素、扁蒴藤素、紫草素、姜黄素、芹黄素、白杨素、木禪草素和丹酌.酸 B 盐购于 Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA,溶解于 DMSO, 5mg/ml浓度作为储存液。HPLC 级别的 MG132 购于 Calb1chem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany,5mg/ml 溶解于 DMSO。HPLC 级别的硼替佐米购于 Santa Cruz B1technology, Inc.SantaCruz, USA, 5m g/ml 溶解于 DMSO。
[0034]pHelper 质粒购于 Agilent Technologies, Santa Clara, USA。pdsAAV-CBAp-EGFP和pAAV-CBAp-Fluc，制备方法如下:利用分子克隆技术，将鸡肌动蛋白启动子(CBAp)驱动的增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)或荧光素酶基因(Fluc)嵌入到携带AAV2的末端重复序列(ITR)的质粒中，使嵌入的基因位于两个ITR之间。pACG2质粒和 pdsAAV-CBAp-Fluc 质粒分别由 Wu 等(Wu J, Zhao ff, Zhong L, Han Z, Li B, Ma W,Weigel-Kelley KA, Warrington KH, Srivastava A: Self-complementary recombinantadeno—associated viral vectors: packaging capacity and the role of rep proteinsin vector purity.Human gene therapy 2007, 18 (2): 171-182.),和 Wang 等(Wang Y,Ling C, Song L, Wang L, Aslanidi GV, Tan M, Ling C, Srivastava A: Limitat1ns ofencapsidat1n of recombinant self-complementary adeno—associated viral genomesin different serotype capsids and their quantitat1n.Human gene therapymethods 2012，23 (4): 225-233.)构建。所有质粒均在使用之前进行了测序。
[0035]引物EGFP-F(5 ' -AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3 ' ) (SEQ ID N0.1)和 EGFP-R(5' -TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3' ) (SEQ ID N0.2)用来做逆转录聚合酶链反应(qTR-PCR)检测。
[0036]2.细胞系培养
人宫颈癌细胞系HeLa，胚胎肾细胞系HEK293，和肝癌细胞系Huh7，均购于AmericanType Culture Collect1n (Manassas, VA,USA)。上述细胞均由完全 Dulbecco，s modifiedEagle medium 培养液(C-DMEM, Mediatech Inc.Herndon, USA)加 10% 热灭活的胎牛血清(FBS, Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA), 1% 青霉素和链霉素(Lonza,ffalkersville, MD)。细胞贴壁培养在加湿，37°C，5% CO2环境下，需要时用胰酶-EDTA混合液(LonZa，Walkersville，MD，USA)室温消化2-5分钟，C-DMEM冲悬后传代培养。人原代肝细胞购于 Triangle Research Labs (Research Triangle Park, North Carolina, USA),贝占壁培养在加湿，37°C，5% CO2环境下原代培养。
[0037]3.rAAV 的制备
包装:高纯度的rAAV储存液由三质粒转染法制造(Ling C，Lu Y, Cheng B, McGooganKE, Gee Sff, Ma W, Li B, Aslanidi GV, Srivastava A: High-efficiency transduct1nof liver cancer cells by recombinant adeno—associated virus serotype 3 vectors.Journal of visualized experiments: JoVE 2011 (49).):
使用聚乙烯亚胺(polyethelenimine,PEI, linear, MW 25000, Polysciences, Inc.Warrington, PA，USA)将三种质粒共同转染进HEK293细胞，6小时后更换细胞培养液。转染72小时后收获细胞,经过3次反复冻融后用限制性内切酶及?flzoftase (Life Technology,Grand Island, USA)酶切破坏细胞基因组DNA。
[0038]纯化:碘克沙醇(1dixanol,Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis,USA)分层超高速离心法离心，然后用HiTrap SP/Q HP过滤柱(GE Healthcare,Piscataway,USA)离子交换法纯化病毒颗粒，然后用磷酸盐缓冲液(PBS，Mediatech Inc.Herndon, USA)冲洗，并用150K分子量尚心分尚浓缩器浓缩。
[0039]鉴定:病毒的物理基因组由southern blot测定。方法如下:10 μ I病毒储存液稀释到 100 μ I 加入限制性内切酶(Novagen, Darmstadt, Germany)在 37°C酶切 I小时，破坏所有病毒外壳蛋白以外DNA，加入相同体积的10mM NaOH在65°C作用30分钟，便Benzonase酶失活并破坏外壳蛋白释放病毒基因组DNA，并解链，放冰水混合物中快速冷却。一种已知浓度且与病毒基因组相同序列的片段DNA同时相同方法解链。将含有DNA的溶液和进行凝胶电泳，ssAAV基因组选择碱性1.2%琼脂糖凝胶，scAAV基因组选择中性1.2%琼脂糖凝胶。将DNA转移到尼龙膜上，用Southern公布的方法(1975年)进行检测。先将胶在I号溶液(0.25M HCl)中进行平衡，室温，20分钟；2号溶液(1M NaCl, 0.5M NaOH)，室温，40分钟；3号溶液(1M NaCl, 0.5M Tris-HCl)，室温，40分钟。在20xSSC溶液中，将膜上的 DNA 转移到 Immobilon-NY +TM 膜(Millipore,Billerica,MA)上。经过交联，将膜放置在25ml杂交液(6x SSC, 100 ug/ml煮沸过的鱼精蛋白DNA，0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)，和5x Denhardfs溶液)中，68°C，6小时预杂交。将膜放置在含有煮沸过的32P-标记的DNA探针的杂交液中，68°C杂交18-20小时。用50ml的I号冲洗液(2x SSC,0.1% SDS)冲洗膜2次，室温，每次15分钟；再用50ml的2号冲洗液(0.1xSSC, 0.1% SDS)冲洗2次，68。。，30分钟,在-70°C，使用 B1MAX MRTM X-ray 感光胶片(Kodak，Rochester，NY)曝光。
[0040]滴度测定:滴度由定量DNA slot blot方法测得，具体如下:高度纯化的rAAV的物理颗粒滴度由定量DNA slot blot方法检测。10 μ I病毒储存液稀释到100 μ I加入Benzonase限制性内切酶在37°C酶切I小时，破坏所有病毒外壳蛋白以外的DNA，加入相同体积的10mM NaOH在65°C作用30分钟，使此瓜ase酶失活并破坏外壳蛋白释放病毒基因组DNA，并解链。然后放冰水混合物中快速冷却。一种已知浓度且含有与病毒基因组相同序列的质粒DNA同时相同方法解链。所有解链的DNA两倍稀释法点样到Immobilon-NY +TM膜上(Millipore，Bedford，MA)。经过交联，将膜放置在 25ml 杂交液(6x SSC, 100 ug/ml煮沸过的鱼精蛋白DNA，0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)，和5x DenhardtJ s溶液)中，68°C，6小时预杂交。将膜放置在含有煮沸过的32P-标记的DNA探针的杂交液中，68V杂交18-20小时。50ml的I号冲洗液(2xSSC,0.1% SDS)冲洗膜2次，室温，每次15分钟；再用50ml的2号冲洗液(0.1xSSC, 0.1% SDS)冲洗 2 次，68°C，30 分钟，在-70°C，使用 B1MAX MRTM X-ray感光胶片(Kodak, Rochester, NY)曝光。
[0041]4.筛选对rAAV感染效率增强效果最好的中药单体
rAAV体外感染:细胞放置于普通96孔板，C-DMEM培养液中，5，000或10，000个细胞每孔。24小时后，细胞被空白处理或用相关药物处理I小时，rAAV在C-DMEM中感染细胞2小时，同时伴有或不伴有相关的药物处理。PBS冲洗细胞，并换C-DMEM继续培养。感染48小时之后进行荧光检测、荧光素酶信号检测或流式细胞术检测，分析转基因表达。
[0042]荧光显微镜检测:两次独立实验，每次4个重复孔，拍照后使用ImageJ软件定量分析。转基因强度由统计整个视野的荧光像素数来判断。
[0043]荧光素酶信号检测:细胞培养并处理于白色底部透明96孔板中(Corning，cat#3610, Tewksbury, MA, USA),按说明书加入 Bright-Glo ?突光素酶检测试剂(PromegaCorporat1n, Madison, WI, USA),使用 Fluoroskan Ascent FL 光度计(Thermo FisherScientific, USA)检测各孔荧光素酶信号强度。
[0044]流式细胞术检测:6孔板进行细胞培养，每组设3个副孔，实验重复3次。药物处理后的细胞经胰酶消化并用含2%FBS的PBS冲悬细胞，离心弃上清再用含2%FBS的PBS冲悬细胞，离心 _ 冲悬 2 次。FACS Calibur 流式细胞仪(Beckton Dickinson B1sciences,San Jose, CA，USA)分析荧光细胞数量、比例。
[0045]5.检测不同中药单体的细胞毒性
细胞存活量分析:细胞计数试剂盒-8 (Cell Counting Kit-8 CCK-8, DojindoMolecular Technologies, Gaithersburg, USA)被用来评价存活的细胞数。细胞放置在96孔板，C-DMEM培养液中，5，000个细胞每孔，24小时后空白处理或相关药物在不同浓度处理，从0.16 μ Mo I/L到20 μ Mol/L。CCK-8溶液按照制造商推荐的方法加入每个孔中。相同培养条件下培养4小时后，用VERSAmax可调节微板检测器(Sunnyvale，CA，USA)检测450nm峰值下的吸光度。
[0046]6.分析中药单体提高rAAV感染效率的机理
提取RNA，逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR):使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN，Gaithersburg, USA)获取全 RNA, Reverse Transcript1n 系统(Promega, Fitchburg, USA)进行逆转录。然后使用 SYBR GreenER qRT-PCR SuperMix for iCycIer (Life Technology,Grand Island,USA)进行qRT-PCR扩增。中性胶分离的锐利的S28和18S rRNA条带为完整的细胞RNA。
[0047]7.分析中药单体提高rAAV感染效率的机理
细胞质核分离:6孔板每孔收集的细胞用175μ I预冷的RLN缓冲液(50 mmol/LTris-HCl,pH 8.0,140 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2 和0.5% Nonidet P_40)轻轻冲悬细胞。涡旋震荡样本10秒，放置冰上5分钟，300 g离心2分钟。收集上清液作为细胞质部分，沉淀作为细胞核部分。用western blot检测细胞不同部分的纯度,抗体如下:SantaCruz B1technology公司相关抗体和适合的二抗:抗IkB多克隆抗体(C_21)(细胞质部分)和antilamin B多克隆抗体(C-20)(细胞核部分)。
[0048]DNA 提取:使用 PureLink Genomic DNA Mini 试剂盒(Life Technology, GrandIsland, USA)从全细胞、细胞核、细胞质或动物组织中抽取全DNA，使用NanoDrop Lite分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)测定DNA浓度，稀释后每个qPCR反应体系加入300ng DNA并应用病毒基因组特异性引物来检测病毒基因组DNA数量。
[0049]8.分析中药单体提高rAAV感染效率的机理
Western blot分析:二烧基硫酸钠(SDS), 1% Nonidet P-40,0.25%脱氧胆酸钠和
Immol/L乙二胺四乙酸加蛋白酶抑制剂混合物，I mmol/L NaF和I mmol/L Na3VO4)裂解细胞。使用Bradford试剂(B1-Rad, Hercules, USA)检测蛋白质浓度并将所有蛋白质浓度均一化，用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样本，电转到硝酸纤维膜上(B1-Rad，Hercules, USA)，将膜与相关的抗体在4°C孵育过夜。然后将膜与辣根过氧化物酶共轭二抗(GE Healthcare, Piscataway, USA)孵育，用增强化学突光底物(MEMD Millipore,Darmstadt, Germany)检测。所有的膜都经过洗脱之后进行了抗-甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体的再次检测，作为点样参照。抗GAPDH抗体购于Thermo Scientific，USA，抗-泛素多克隆抗体购于 Santa Cruz B1technology, Inc.Santa Cruz, USA。
[0050]9.分析中药单体提高rAAV感染效率的机理
共聚焦显微镜检测rAAV在细胞内位置:Cellmask Orange plasma membrane染料购于 Life Technology, Grand Island, USA。单次反应 Cy3 染料购于 GE HealthcareB1-Sciences, Pittsburgh, USA。将 rAAV 保存液加入 Microcon YM-100 (EMD MilliporeCorporat1n, Billerica, MA, USA)离心过滤器按说明书浓缩，将浓缩的rAAV保存液与Cy3染料室温孵育，并不断震荡。使用20K MWCO Slide-a-Lyzer MINI透析单元(ThermoFisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA)按说明书透析。将透析产物加入 MicroconYM-100离心过滤器再次过滤，即获得Cy3染色的rAAV。用Flurodish细胞培养盘(WorldPrecis1n Instruments C0.Sarasota, FL, USA)培养细胞，C-DMEM, 5，000 个细胞每盘。感染Cy3标记的rAAV，2或24小时后PBS冲洗，4%多聚甲醛37°C 10分钟固定，再用PBS冲洗，用 20 μ g/ml DAPI (4' ,6-Diamidino-2_Phenylindole, Dihydrochloride, Sigma-AldrichC0.LLC, St.Louis，USA) 37。。10分钟染色细胞核，再换成PBS，用Leica TCS SP5共聚焦显微镜63x油浸物镜观察并拍照。
[0051]10.rAAV体内感染效率的检测及分析
实验动物:所有的动物实验由美国动物保护与使用委员会批准，并且按照佛罗里达大学(Gainesville，FL, USA)或上海第二军医大学动物保护规范进行操作。6_10周鼠龄，体重 15_20g 的 nonobese diabetic/severe combined immunodeficient gamma (NSG)或C57BL/6，雄性或雌性小鼠购于Jackson实验室(Bar Harbor, ME, USA)，喂养在佛罗里达大学医学院(Gainesville，FL, USA)，室温，小鼠自由取水取食。
[0052]rAAV体内感染与荧光素酶信号分析:对小鼠进行rAAV尾静脉注射，或直接肿瘤内注射。对于荧光报告基因，注射病毒8周之后获取小鼠肝脏，然后对每个肝叶切片再用荧光显微镜观察。对于Fluc报告基因，先对小鼠称重计算获得底物注射剂量，然后腹腔注射按 5 mg/mL 稀释在 PBS 中的 D-1uciferin-K+ salt (Caliper Life Sciences, Hopkinton,USA)底物,4 mg/kg体重,并且麻醉小鼠,用装备冷却电子稱合器的Xenogen活体成像仪(Xenogen,Alameda, USA)拍摄突光素酶照片。信号密度用相机控制软件Living Image统计，单位为光子/秒/平方厘米/球面度(p/s/cmVsr)。
[0053]11.统计
结果以中位数土标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件分析，多组均数比较用单因素方差分析，两组均数比较用t检验，P〈0.05视为有统计学意义。
[0054]二、结果
1.紫草素对rAAV感染效率的影响
根据已有的报道，本发明选择了共8种中药单体提取物，分别是雷公藤红素(Celastrol)、扁蒴藤素(Pristemerin)、紫草素(Shikonin)、姜黄素(Curcumin)、疗黄素(Apigenin)、白杨素(Chrysin)、木禪草素(Luteolin)和丹酌.酸 b (Salvianolic acid b),测试了它们在HeLa细胞中对rAAV2_CMVp_hrGFP感染的增强作用，发现其中紫草素的效果最佳[图1.A]。图中紫草素从2.5 μ M组到5 μ M组的转基因表达效率有一个突然的提高，为了进一步验证其浓度依赖性的真实性，又检测了紫草素从2.5 μ M到6 μ M更小浓度阶梯变化对rAAV2介导的转基因效率影响，证实了之前实验的可信性[图1.B]。另外，更换了包含另外一种报告基因的rAAV2-CB-EGFP病毒，选取前面实验中效果最好的4种中药单体提取物的最佳浓度再次检测，紫草素的效果仍然最强[图1.C]。此外流式细胞术检测到了同样的结果[图1.D]。
[0055]我们的目标是用筛选出来最优的中药单体联合rAAV3治疗肝癌，所以接下来测试了紫草素[图2.E]在人肝癌细胞系——Huh7中对rAAV3-CB-EGFP感染效率的增强作用及浓度依赖性[图2.A]，结果显示紫草素仍然具有显著的增强作用，但最佳浓度与在HeLa细胞系中有所区别。同样在Huh7细胞系中，同样浓度的紫草素也可以增强rAAV2-CB-EGFP的感染效率[图2.B]。然后选取最佳浓度的紫草素作用于Huh7细胞系，换另外一种包含两种报告基因的rAAV3-UF50，并检测了两种报告基因的表达情况，结果显示两种报告基因趋势相同，并与之前实验的增强趋势相同[图2.C，图2.D]。
[0056]rAAV2在正常小鼠体内靶向肝脏最明显，而rAAV3在正常小鼠体内几乎不靶向任何器官。使用携带杀伤基因rAAV治疗肝癌要避免杀伤正常肝脏细胞，接下来检测了购于三角研究实验室有限责任公司(Triangle Research Labs, LLC)的2位临床捐赠者的人肝脏细胞。首先用rAAV2-UF50病毒感染，紫草素在一定浓度可以明显增强感染效率[图3.A]。rAAV3本身对肝细胞感染能力较弱，用携带CB启动子加Fluc基因的rAAV3_UF50病毒感染人肝脏细胞效率较低，与紫草素联合应用有一定提高，但与rAAV2相比有显著差距[图
3.B]。携带AFP启动子加EGFP基因的双链rAAV3可以高效感染Huh7细胞，但感染人肝细胞后不能检测出转基因表达，即使与紫草素联用也无法检测到绿色荧光[图3.C]。这说明携带AFP特异性启动子基因的rAAV3在体外可以选择性的感染肝癌细胞系而不感染正常人肝细胞，并且紫草素不能增加这种rAAV3对人肝细胞的感染效率。至此，得出的结论是:紫草素作用于多种细胞时可以增强多种不同血清型rAAV的体外感染效率，但对携带AFP特异性启动子的rAAV3，并不能在人肝脏细胞增强其感染效率，用于针对肝癌的靶向性基因治疗相对安全。
[0057]2.紫草素对rAAV体内感染效率的影响
rAAV8在体外几乎不能感染任何细胞，但其对小鼠肝脏的体内感染效率要远高于其他任何rAAV血清型。为了检测紫草素在体内能否增强感染效率已经很高的rAAV8，这次选用携带 Fluc 基因的 rAAV8-CB-Fluc-EYFP，I X 109vgs/mouse,尾静脉注射 C57BL/6 品系小鼠，并在注射病毒的当天及前后2天，共5天连续腹腔注射紫草素lmg?3mg/kg/day，然后在不同时间段用活体成像仪拍摄小鼠照片[图4.A]，并量化分析[图4.B]。数据显示紫草素Img组小鼠肝脏报告基因表达量在30天时开始显著性高于对照组，在90天时Img组和2mg组均显于对照组(P〈0.05)。说明紫草素可以在体内提高rAAV8的感染效率。第90天处死小鼠并获取DMSO组和紫草素Img组小鼠的肝组织，提取全DNA后qPCR检测rAAV8病毒基因组数量[图4.C]，紫草素Img组明显高于DMSO组。这说明紫草素可以帮助rAAV病毒基因组DNA更多保留在其靶器官细胞中，也进一步验证了体外实验的结果。
[0058]实施例2紫草素增强rAAV感染效率的机理 1.紫草素体外增强rAAV感染效率的机理
首先设计用Cy3染料标记rAAV2-CB-Fluc的外壳蛋白，然后用莱卡TCS SP5共聚焦显微镜观察标记后的rAAV2-CB-Fluc-Cy3病毒外壳在HeLa细胞内的转运情况。正式观察之前，先检测了标记后的rAAV2-CB-Fluc-Cy3病毒的生物活性，感染HeLa细胞，高剂量组和低剂量组的报告基因表达量都可以检测到，但比同等剂量的未标记组有明显降低[图5.A]；另外，又检测了紫草素对rAAV2-CB-Fluc-Cy3感染效率的影响，结果显示紫草素仍然可以显著增强其感染效率[图5.B]，说明Cy3染料标记对rAAV生物活性有一定负影响，但可以接受。然后用rAAV2-CB-Fluc-Cy3感染HeLa细胞2小时和24小时，并用药物干预，观察rAAV2-CB-Fluc-Cy3外壳在不同时间段细胞内的转运情况。图片显示在紫草素和MG132作用下，细胞内rAAV外壳量略微更多，并且更多地聚集在细胞核周围，但很少进细胞核[图
5.C]。
[0059]下一步，检测了细胞感染rAAV后，病毒基因组DNA在细胞质部分和细胞核部分比例的情况。rAAV2-CB-EGFP病毒感染24小时后，分离HeLa细胞的细胞质和细胞核，然后从两部分提取全部DNA，做qPCR检测病毒基因组DNA数量，可以看到紫草素和MG132处理过后，HeLa细胞的细胞核内的病毒基因组DNA数量与细胞质内病毒基因组DNA数量的比例都显著高于单纯病毒感染组。这说明紫草素可以帮助病毒基因组更多地进核[图6.A]。本发明还检测了总细胞内病毒基因组DNA转录的mRNA的数量，同样是rAAV2_CB_EGFP病毒感染HeLa，24小时后提取细胞总RNA，用随机引物进行逆转录，并用病毒基因组特异性引物进行定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)[图6.B]。图中可以看出不同浓度紫草素组的细胞内目标mRNA数量比DMSO组都有提高，而且从2.5μ M到5μ M有一个明显的大幅度升高，这也跟报告基因的蛋白表达量的趋势是一致的[图1.Α]。以上都是从增加感染效率的方面验证紫草素对rAAV的增强作用，接下来检测了紫草素对细胞内的蛋白酶体通路的影响作用。HeLa细胞被紫草素或MG132处理过后，感染rAAV2_CB_EGFP病毒，2小时后收集全细胞，并裂解细胞做western blot，图片中可以看到HeLa细胞被紫草素和MG132处理过后，全细胞的泛素蛋白含量明显增高[6.C]，提示处理过这些药物之后细胞内蛋白酶体对泛素化蛋白的降解作用被抑制。而且紫草素各组随着用药浓度的提高，泛素化蛋白的累计也逐步增多，有浓度依赖性。
[0060]2.紫草素体外、体内增强rAAV感染效率的作用阶段
为了明确紫草素是否能帮助已经由rAAV介导表达相关蛋白质的细胞进一步增加蛋白质表达量，用rAAV2-CB-EGFP病毒感染HeLa细胞48小时后再用紫草素处理细胞，再过48小时后观察，GFP荧光强度没有显著变化[图1.E]。说明紫草素对rAAV转基因表达的增强作用发生于病毒感染早期。
[0061]除了与rAAV同时给药，我们还测试了在rAAV之后给药。C57BL/6正常小鼠尾静脉注射rAAV8-UF50病毒，I X 109vgs/mouse, 100天之后，按照肝脏Fluc强度平均分成两组(每组5只)，分别腹腔注射DMS0，或紫草素lmg/kg/day，连续5天，然后多次拍摄活体荧光照片，Fluc信号统计数据显示两组之间没有统计学差异[图6.D]。说明rAAV感染小鼠稳定表达蛋白质之后，注射紫草素并不能增加rAAV携带外源蛋白质基因表达量，提示紫草素作用于rAAV感染早期。
[0062]实施例3紫草素联合携带杀伤基因的rAAV3治疗肝癌
天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS)来源于传统中药天花粉(Radicestrichosanthis),天花粉为多年生攀援草本植物，葫芦科括楼属，热後iTrichosantheskirilowii Maxim)或双边括楼(,ricAosafliAes rosthornii Herms)的根。天花粉的功效为:清热泻火，生津止渴，消肿排脓，主治:热病口渴、消渴、黄疸、肺燥咳血、痈肿、痔漏，等。TCS由247个氨基酸残基组成，属于I型核糖体失活蛋白(Ribosome-1nactivatingproteins, RIP),具有抑制多种肿瘤细胞生长、抗病毒、免疫调节、抗艾滋病病毒等多种药理活性。Shaw PC等最早确认了 TCS基因的序列，其长度为870bp。本发明试图将这段基因包装进rAAV3并将其与紫草素联合应用进行治疗肝癌的研究。
[0063]一、实验材料与方法 1.化合物，质粒，引物
HPLC 级别的紫草素购于 Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA,溶解于 DMSO, 5mg/ml 浓度作为储存液。HPLC级别的MGl32 购于 Calb1chem,Merck KGaA, Darmstadt, Germany,5mg/ml 溶解于 DMSO。
[0064]pdsAAV-AFPp-EGFP 质粒由 Glushakova 等构建(Mingozzi F，High KA:Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV: progress andchallenges.Nature reviews Genetics 2011, 12 (5):341-355.)。TCS 基因由 LifeTechnologies 公司合成，基于公布的序列(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/M34858.1; T.kirilowii trichosanthin (TCS) mRNA, complete cds; GenBank:M34858.1)，并用限制性内切酶J职I細ind JJJ进行亚克隆，放进pdsAAV-AFPp-EGFP质粒中。所有质粒均在使用之前进行了测序。
[0065]2.细胞系培养
人宫颈癌细胞系HeLa，胚胎肾细胞系HEK293，肝癌细胞系Huh7，慢性髓细胞性白血病细胞系 K562,均购于 American Type Culture Collect1n (Manassas, VA, USA)。新型肝癌细胞系LH86由佛罗里达大学医学院病理科提供(Zhu H, Dong H, Eks1glu E, HemmingA, Cao M, Crawford JM, Nelson DR, Liu C: Hepatitis C virus triggers apoptosisof a newly developed hepatoma cell line through antiviral defense system.Gastroenterology 2007, 133 (5): 1649-1659.)。以上细胞均由 C-DMEM 培养液加 10% 热灭活的FBS，1%青霉素和链霉素(L0nZa，WalkerSVille，MD)。一种新建立的人肝癌细胞系(Hep293TT) (Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM: Noveladeno—associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences of the United States of America2002，99(18):11854-11859.)用完全 RPMI 1640 培养基(Life Technologies)培养，添加15%热灭活FBS和1%青霉素和链霉素(Lonza，Walkersville，MD)。人原代肝细胞购于Triangle Research Labs, Research Triangle Park, North Carolina, USA 。细胞贝占壁培养在加湿，37°C，5% CO2 环境下，胰酶-EDTA 混合液(Lonza, ffalkersville, MD，USA)室温消化2-5分钟，C-DMEM冲悬后传代培养。
[0066]3.rAAV 的制备同实施例1。
[0067]4.细胞存活量及杀伤量分析
LDH 细胞毒性试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham, MA, USA)被用来评价细胞杀伤情况。细胞计数试剂盒 _8 (Cell Counting Kit-8 CCK-8,Dojindo MolecularTechnologies, Gaithersburg, USA)用来评价存活的细胞数。细胞放置在96孔板，C-DMEM培养液中，5，000个细胞每孔，24小时后空白处理或相关药物在不同浓度处理，从
0.16 μ Mol/L到20 μ Mol/L。LDH试剂盒:药物处理24小时每孔取培养液50 μ I转移到另一块96孔板，每孔加50 μ I反应混合物室温孵育30分钟，加入30 μ I终止溶液，然后VERSAmax可调节微板检测器(Sunnyvale, CA, USA)检测490nm和680nm波段的吸光度,判断细胞毒性。CCK-8试剂盒:相同96孔板中的细胞，CCK-8溶液按照制造商推荐的方法加入每个孔中。相同培养条件下培养4小时后,用VERSAmax可调节微板检测器(Sunnyvale, CA, USA)检测450nm峰值下的吸光度。
[0068]5.实验动物同实施例1。
[0069]6.人肝癌异种接种小鼠模型
6-10周鼠龄的雄性或雌性NSG小鼠右前肢腋窝皮下注射约5 X 16个Huh7或H印293TT细胞。小鼠在无菌环境中培养直到实验结束。
[0070]7.紫草素/rAAV3体内杀伤肝癌
rAAV体内感染与Fluc信号分析:同实施例1。
[0071]8.统计
结果以中位数土标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件分析，多组均数比较用单因素方差分析，两组均数比较用t检验，P〈0.05视为有统计学意义。
[0072]二、紫草素对肝癌的杀伤作用及对脏器的影响 1.紫草素对肝细胞癌的体外杀伤作用
我们选用了 3种不同肝癌细胞系:常用的肝癌细胞系Huh7、一种在2009年初次报道的取自儿童的侵袭性肝癌细胞系ifep293TT (Chen TTj Rakheja D，Hung JYjHornsby PJj Tabaczewski P， Malogolowkin M， Feusner J， Miskevich F， SchultzRj Tomlinson GE: Establishment and characterizat1n of a cancer cell linederived from an aggressive childhood liver tumor.Pediatric blood & cancer2009，53(6):1040-1047.)、一种在2007年初次报道的从一个分化较好的人肝癌组织中分离的细胞系 LH86 (Zhu H, Dong H, Eks1glu E, Hemming A, Cao M, Crawford JM,Nelson DR, Liu C: Hepatitis C virus triggers apoptosis of a newly developedhepatoma cell line through antiviral defense system.Gastroenterology 2007,133(5): 1649-1659.)，以及正常肝脏原代培养细胞，在用不同浓度的紫草素处理24小时后用CCK-8试剂盒检测了其对这些细胞的增殖抑制作用[图7.A]。检测结果显示，紫草素对肝癌细胞系普遍具有增殖抑制作用，而对于原代培养的人肝细胞增殖抑制作用相对较弱，这也符合了其他人研究的发现:人的癌细胞比正常细胞对于蛋白酶体的抑制作用更为敏感。这种现象也更利于将来的临床应用:选择性抑制癌细胞而对正常细胞影响较小。为了鉴别紫草素是直接杀伤肝癌细胞，还是抑制细胞增值，接下来针对Huh7和HepRG两种细胞系进行了 CCK-8试剂盒与LDH检测试剂盒同时进行的检测比较。同样浓度梯度的紫草素处理，CCK-8试剂盒检测活细胞比例[图7.B]，LDH试剂盒检测被杀伤细胞比例[图7.C]。结果显示紫草素有明确的直接杀伤作用。
[0073]2.紫草素对肝细胞癌的体内杀伤作用
选用免疫缺陷性小鼠品系，NSG小鼠，皮下种植Huh7-Fluc (携带Fluc基因的Huh7细胞系)肿瘤，待肿瘤生长至5_X 5mm时开始腹腔注射紫草素lmg/kg/day (实施例1中测得的小鼠体内增强rAAV感染效率的最佳浓度)，连续注射2周，活体荧光成像仪图片[图8.A]及荧光信号[图8.B]统计显示:用药期间，用药组的肿瘤细胞荧光强度显著性低于DMSO对照组。而停止用药后，用药组小鼠的肿瘤荧光强度再次快速上升。这说明:紫草素可以抑制NSG小鼠体内Huh7-Fluc移植瘤的生长。在停止用药5天后对小鼠称重，两组间没有发现显著性差异[图8.C]，提示治疗剂量紫草素对NSG小鼠的毒性作用不明显。
[0074]3.对正常脏器的影响。
[0075]为了解紫草素对小鼠主要脏器功能的毒性，我们进行了一系列检测。健康C57BL/6雄性小鼠15只，随机分为三组:DMS0组，紫草素Img组和紫草素4mg组，同时开始腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day,或紫草素4mg/kg/day,连续注射10天后处死小鼠,检测血清AST、ALT、ALP值。结果显示:AST两个不同剂量治疗组与空白对照组之间没有显著性差异[图9.A] ；ALT和ALP，Img治疗剂量组与空白对照组没有显著性差异，4倍治疗剂量组对比空白对照组均有明显降低[图9.B.C]。
[0076]三、携带天花粉蛋白基因的优化rAAV3对肝癌的杀伤作用 1.天花粉蛋白基因对肝癌细胞的体外影响
根据已知的TCS基因序列[图10.BKSEQ ID N0.3)，我们对其进行了合成，为了方便检测其合成的蛋白质的表达，我们还在其基因序列末端加入了一个旗帜标签(Flag tag)[图10.C] (SEQ ID N0.4)。
[0077]基于已有包含报告基因的rAAV基因组质粒:含有肝癌特异性AFP启动子pdsAAV-AFP-EGFP [图11.A]，我们将含有旗帜标签或不含有旗帜标签的TCS基因序列通过分子克隆技术分别替换质粒中原有的EGFP基因，得到2种新的质粒:pdsAAV-AFP-TCS-Flag [图 11.B]，pdsAAV-AFP-TCS-TAA [图 11.C]。在包装病毒之前，我们进行了质粒转染实验来测试上述6种质粒对肝癌细胞生长的影响。Huh7细胞转染48小时后CCK-8试剂盒检测存活细胞相对数量[图11.A]。结果显示pdsAAV-AFP-TCS-Flag质粒组细胞数量最少，与pdsAAV-CB-EGFP组相比有显著差异(p〈0.01)。
[0078]根据转染效果，我们选择包装了 rAAV3-T492V+S663V-AFP-TCS-Flag病毒来进一步研究。此病毒由突变型外壳蛋白携带一个由人甲胎蛋白启动子(AFPp)驱动的TCS基因。这种AFPp启动子理论上只有在高表达AFP的肝癌细胞内才可以被提高效率。首先我们进行了体外感染实验，100, 000Μ0Ι感染Huh7细胞48小时，然后用CCK-8试剂盒检测判断细胞存活量，吸光度数值提示携带TCS基因的优化rAAV3在体外对肝癌细胞的生长有明显抑制作用[图12.B]。
[0079]2.TCS基因对肝癌细胞的体内影响
接下来进行了体内试验。为了在肿瘤的早期，未触摸到明显肿瘤的时候就开始治疗，我们还构建了一个基因修饰的人肝细胞癌细胞系:Huh7-Fluc，这个细胞系被一个由CBAp启动子驱动Fluc基因的质粒稳定转染，可以随着细胞分裂在子代细胞中稳定表达Fluc蛋白，这样的细胞形成的体内肿瘤在无法触及的时候就可以被活体成像仪探测到。NSG小鼠右前肢腋窝皮下种植Huh7-Fluc肿瘤，2周后经拍摄活体荧光照片判断移植成功，小鼠分为
2组，一组尾静脉注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS 病毒(第 O 天)，5X 101° vgs/mouse ；另外一组尾静脉注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP 病毒，5 X 101° vgs/mouse,作为对照。病毒注射的第O天、第3天、第8天和第11天，拍摄小鼠全身活体荧光照片。结果如[图13.A]，尽管rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP组的小鼠Huh7_Fluc肿瘤渐进地生长，但rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS组小鼠的肿瘤却被明显抑制，直到第11天(p〈0.05)，而最大的肿瘤抑制效果出现在第8天(p〈0.01)。第8天各组具有代表性的小鼠全身Fluc信号照片见[图13.B]。第11天处死小鼠后获取血清检测AST，ALT，两组之间无明显差别[图13.C]，提示rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS病毒有效抑制小鼠体内肝癌生长的同时对肝功能无明显损伤。
[0080]四、紫草素与携带TCS基因的优化rAAV3共同治疗肝癌
1.紫草素与携带TCS基因的优化rAAV3共同治疗肝癌的体内效果接下来我们将紫草素和携带TCS基因的优化rAAV3联合在小鼠体内应用，来观察联合抗肝癌效果。
[0081]NSG小鼠共20只，全部右前肢腋窝皮下接种Huh7_Fluc肿瘤，2周后经活体成像仪检测接种成功后，随机分为5组，每组4只。分别是:①空白对照组:第O天尾静脉注射PBS，第O天至第11天腹腔注射PBS;②非治疗基因组:第O天尾静脉注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP 病毒 5 X 101° vgs/mouse,第 O 天至第 11 天腹腔注射 PBS ；③紫草素加非治疗基因组:第O天尾静脉注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP病毒5 X 101°vgs/mouse,第O天至第11天腹腔注射紫草素lmg/kg/day ;④治疗基因组--第O天尾静脉注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag 病毒 5 X 101° vgs/mouse,第 O 天至第 11 天腹腔注射PBS 紫草素加治疗基因组:第O天尾静脉注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag病毒SXlOw vgs/mouse,第O天至第11天腹腔注射紫草素lmg/kg/day。病毒注射日期为第O天，在第0、3、8、11天使用活体成像仪拍摄小鼠全身照片，分析肿瘤组织中Fluc信号强度。结果如[图14]，第11天时，非治疗基因组与紫草素加非治疗基因组之间有明显差异(p〈0.05)，紫草素加非治疗基因组更低，提示紫草素对肿瘤的生长有抑制作用；另外，非治疗基因组与治疗基因组之间有明显差异(P〈0.05)，治疗基因组更低，提示携带TCS基因的优化rAAV3对肿瘤的生长有抑制作用；还有，治疗基因组与紫草素加治疗基因组之间也有明显差异(P〈0.05)，紫草素加治疗基因组更低，提示紫草素联合携带TCS基因的优化rAAV3可以更大程度抑制肿瘤的生长。据此得出的结论是:紫草素联合携带TCS基因的外壳蛋白优化rAAV3对小鼠体内人肝癌种植瘤的抑制效果，比单独使用紫草素或单独使用携带TCS基因的外壳蛋白优化rAAV3都更强。
[0082]第11天处死小鼠，解剖获得肿瘤，并测量直径，结果如[图15]，与肿瘤细胞表达的Fluc信号呈相同趋势。
[0083]2.紫草素与携带TCS基因的优化rAAV3共同治疗肝癌对小鼠的肝功能影响在上述实验中，第11天处死小鼠时获得血清，并检测AST、ALT[图16]，各组之间均无显著差异，提示治疗剂量的紫草素和/或携带TCS基因的优化rAAV3治疗小鼠肝癌时，对肝功能影响不明显。
[0084]五、结论
1.紫草素本身具有体外、体内抗肝癌的作用；
2.TCS基因经过介导具有在体外、体内抗肝癌的作用；
3.紫草素与携带TCS的优化rAAV3联合应用，对小鼠体内人肝癌移植瘤的抑制效果优于紫草素或携带TCS的优化rAAV3任何一个单独使用；
4.有效治疗剂量的紫草素和/或携带TCS基因的rAAV3不会对小鼠肝脏造成明显损害。
[0085]通过一系列的体外和动物体内实验研究，证明了“紫草素联合携带天花粉蛋白基因的优化3型重组腺相关病毒用于治疗人肝细胞癌比单独应用紫草素或携带天花粉蛋白基因的优化3型重组腺相关病毒能获得更好的治疗效果”，此结果为在基因治疗领域开展中西医结合研究提供了科学的实验依据。
[0086]实施例4紫草素衍生物对rAAV感染效率的影响一、实验材料与方法
1.化合物
高效液相层析(HPLC)级别的乙酰紫草素(Acetylshikonin)，β, β-二甲基丙烯酰紫草素(β , β -Dimethylacrylshikonin),溶解于 DMS0,20mmol 浓度作为储存液。
[0087]2.细胞系培养
人宫颈癌细胞系 HeLa,由完全 Dulbecco’ s modified Eagle medium 培养液(C-DMEM，Mediatech Inc.Herndon, USA)加 10% 热灭活的胎牛血清(FBS, Sigma-Aldrich C0.LLC,St.Louis，USA)，1%青霉素和链霉素(Lonza，Walkersville，MD)。细胞贴壁培养在加湿，37°C, 5% CO2环境下，需要时用胰酶-EDTA混合液(Lonza，ffalkersville, MD，USA)室温消化2-5分钟，C-DMEM冲悬后传代培养。
[0088]3.rAAV体外感染
细胞放置于白色96孔板，C-DMEM培养液中，10，000个细胞每孔。24小时后，细胞被空白处理或用相关药物处理I小时，rAAV2-UF50在C-DMEM中感染细胞2小时，同时伴有或不伴有相关的药物处理。PBS冲洗细胞，并换C-DMEM继续培养。感染48小时之后进行荧光检测、荧光素酶信号检测或流式细胞术检测，分析转基因表达。
[0089]4.统计
结果以中位数土标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件分析，多组均数比较用单因素方差分析，两组均数比较用t检验，两个构成比比较用卡方检验。P〈0.05视为有统计学意义。
[0090]5.结论
请参见附图17和附图18，由图示结果可知，乙酰紫草素，β，β - 二甲基丙烯酰紫草素，在一定浓度下作用细胞，可以显著增强rAAV的感染效率。
[0091]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.紫草素及其衍生物在制备基因治疗增敏剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因治疗是指基于病毒为载体的基因治疗。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的病毒是腺相关病毒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的腺相关病毒是2型、3型、8型腺相关病毒。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因治疗是以腺相关病毒为载体对肝癌的基因治疗。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的紫草素衍生物是乙酰紫草素、去氧紫草素、消旋乙酰紫草素、1-甲氧基乙酰紫草素、β，β二甲基丙烯酰紫草素、2，3-二甲基戊烯酰紫草素、β -羟基异戊酰紫草素、β，β - 二甲基丙烯阿卡宁、乙酰阿卡宁、β -乙酰氧基异戊酰阿卡宁、羟基异戊酰阿卡宁。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的紫草素衍生物是乙酰紫草素、β， 二甲基丙烯酰紫草素。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因治疗是以携带天花粉蛋白基因的优化3型腺相关病毒为载体对肝癌的基因治疗。
【文档编号】A61K48/00GK104127885SQ201410334493
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】凌昌全, 王园, 王丽娜, 张院辉 申请人:中国人民解放军第二军医大学