表皮生长因子与绿色荧光蛋白的融合蛋白的制作方法

专利名称：表皮生长因子与绿色荧光蛋白的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物医学领域；具体地说，本发明涉及一种能高效与表皮生长因子受体结合的融合蛋白；本发明还涉及该蛋白的用途。

背景技术：
表皮生长因子(EGF)及表皮生长因子受体(EGFR)在人体许多细胞的生长、分化、增殖过程中起着重要的作用。表皮生长因子受体在很多肿瘤细胞中高表达，是肿瘤较理想的靶点。关于表皮生长因子受体的内吞及其信号转导的机理研究一直都是分子生物学和分子医学研究的热点之一，它也是肿瘤基因治疗、生物治疗的靶点。
表皮生长因子受体的内吞机理研究以往大多采用同位素标记的EGF，该种方法较为敏感，但是由于涉及到放射性物质，而且不能直观观察，不能在活体细胞上观察，所以难以广泛使用。
随着荧光标记物的发展，后来人们也采用了荧光标记的表皮生长因子(EGF)，这些荧光标记物大多是小分子化合物，如FITC，Rhodamine等。荧光化合物标记的EGF可以与EGFR结合并内吞，但是这些化合物的敏感度较低，荧光化合物容易见光淬灭，所以操作一定要避光，给操作带来了很多不便；此外荧光小分子化合物与EGF进行交联反映，也可能影响EGF的生物学活性，因此有必要寻找新的方法来解决这些问题。
绿色荧光蛋白(GFP，Green Fluorescent Protein)或增强型绿色荧光蛋白(EGFP，Enhanced Green Fluorescent Protein)作为一种标记蛋白已被应用于分子生物学及医学研究。几年前有研究人员将GFP与Heregulin融合表达，结果发现融合蛋白可以与Heregulin受体结合。
虽然将绿色荧光蛋白(GFP)或者其它荧光蛋白与一个目标蛋白进行融合是一种已被应用的技术，但人们也了解这样的事实这种融合技术会影响被融合蛋白的固有折叠形式。GFP不仅仅能影响被融合对象的折叠形式，而且当GFP与一个自身折叠形式并不恰当的蛋白进行融合时，GFP的自身折叠形式也会遭受破坏，从而导致非正常性的弱荧光出现。
因此，GFP或EGFP并非适合于与各种蛋白相融合表达，并且，其与大多蛋白融合表达时往往会导致相应的蛋白活性发生变化，或空间结构发生变化，难以发挥这些蛋白质原先的各种特性，如结合特性等。迄今为止尚没有人实现对EGFP与EGF的融合蛋白进行表达纯化。


发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白可很好地用于观察EGFR的内吞机理，检测细胞EGFR的表达状况，以及研究EGFR的信号转导机理等。
本发明的另一目的在于提供一种产生所述融合蛋白的方法。
在本发明的第一方面，提供一种分离的融合蛋白，所述的融合蛋白包括第一部分和第二部分，其中， 第一部分绿色荧光蛋白(或其活性片段)；和 第二部分表皮生长因子(或其活性片段)； 并且，所述的融合蛋白可与表皮生长因子受体结合。
在本发明的另一优选例中，所述的融合蛋白与表皮生长因子受体结合后可被细胞内吞。
在本发明的另一优选例中，所述的融合蛋白还可使表皮生长因子受体产生信号传导。
在本发明的一种优选例中，所述的绿色荧光蛋白为增效的绿色荧光蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述的绿色荧光蛋白或其活性片段位于融合蛋白的氨基端；所述的表皮生长因子或其活性片段位于融合蛋白的羧基端。
在本发明的另一优选例中，在第一部分和第二部分之间，包括4-20个氨基酸的连接子。
在本发明的另一优选例中，所述的连接子的氨基酸序列为(GGGS)n，其中，n＝1～5。
更优选的，n＝1-4，更优选的，n＝2。
更优选的，所述的连接子具有SEQ ID NO10所述的氨基酸序列(即GGGSGGGS)。
在本发明的另一优选例中，在融合蛋白的氨基端设置有His6标签。
在本发明的另一优选例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供一种核酸分子， (i)所述的核酸分子编码权利要求1所述融合蛋白；或 (ii)所述的核酸分子与(i)所述的核酸分子相互补。
在本发明的第三方面，提供一种载体，所述的载体中含有前面所述的核酸分子。
在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有前面所述的载体；或所述的细胞基因组中整合有前面所述的核酸分子。
在本发明的第五方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于 制备观察表皮生长因子的内吞及分子机理的物质；或 制备检测表皮生长因子受体的表达水平的物质。
在本发明的第六方面，提供一种产生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括培养前面所述的细胞，使所述细胞产生所述的融合蛋白。
在本发明的另一优选例中，还包括回收所述的融合蛋白；更优选的，包括分离和纯化所述的融合蛋白。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。



图1显示了pET28a-EGFP-EGF载体示意图。
图2显示了采用SDS-PAGE凝胶电泳确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况。其中，泳道1为标准分子量标记(marker)的电泳情况；泳道2为用NTA-0缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道3为用NTA-40缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道4-5为用NTA-80缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道6-7为用NTA-100缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道8-9为用NTA-200缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况；泳道10为用NTA-250缓冲液洗脱的蛋白的电泳情况； 图3显示了纯化后的EGFP-EGF蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。其中，泳道1为蛋白分子量标记，泳道2为0.5μg EGFP-EGF蛋白。
图4显示了EGFP-EGF蛋白与细胞表面EGFR结合及内吞图。其中， AEGFP-EGF蛋白的结合及内吞； BEGFP蛋白的结合及内吞； C用EGF蛋白竞争EGFP-EGF蛋白的结合及内吞。
图5显示了EGFP-EGF蛋白的内吞及其与网格蛋白(Clathrin)在细胞内共定位。
图6显示了EGFP-EGF蛋白的氨基酸序列。

具体实施例方式 本发明人经过长期的研究和试验，首次获得了表皮生长因子(EGF)与增效的绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)的融合蛋白。更特别的，本发明人在EGFP与EGF之间加上一段适当长度的连接子，从而大大提高融合蛋白与表皮生长因子受体的结合。本发明所形成融合蛋白可很好地用于研究EGFR的内吞机理，检测细胞EGFR的表达状况，研究EGFR的信号转导机理等。基于此完成了本发明。
含有(a)绿色荧光蛋白(更优选的为增效的绿色荧光蛋白)或其活性片段作为第一部分和(b)表皮生长因子或其活性片段作为第二部分的融合蛋白 本发明提供一种融合蛋白，该蛋白包括绿色荧光蛋白或其中的生物活性片段，和表皮生长因子或其中的生物活性片段，该分子能用于观察表皮生长因子受体的内吞及其信号转导的机理。更优选的，所述的融合蛋白是一种独立的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。
在本发明的优选方式中，所述的融合蛋白的分子量大约在38690道尔顿左右。
表皮生长因子 任何适合的表皮生长因子均可用于制备本发明的融合蛋白。本文使用的术语“表皮生长因子”是指一种多肽，能结合表皮生长因子受体并诱导内吞和/或信号传导。表皮生长因子(EGF)是一种细胞因子，其能与靶细胞膜上的表皮生长因子受体(EGFR)结合产生生物效应。而EGFR是一种酪氨酸激酶(TK)型受体，当它与EGF结合后能促进受体内的TK激活，导致受体酪氨酸残基自身磷酸化，提供持续分裂信号到细胞内，引起细胞增殖、分化。EGFR在人类组织中大量存在，在恶性肿瘤中呈高表达。
表皮生长因子或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使人们认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。表1是这种替换的一些示例。
表1 可能还有其他的类似的可替换性，这种可替换性往往可以根据经验确定或者根据已知的保守序列进行确定。
任何一种表皮生长因子的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，表皮生长因子的生物活性片段的含义是指作为一种细胞因子，其仍然能保持全长的表皮生长因子的全部或部分功能。通常情况下，表皮生长因子与表皮生长因子受体在细胞表面结合，刺激一个或多个信号传导通路或途径并引起细胞反应，例如增殖。正常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长表皮生长因子的刺激活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的刺激活性。
在本发明的一种优选方式中，所述的表皮生长因子或生物活性片段在融合蛋白中具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中第271-327位的氨基酸序列。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的表皮生长因子的氨基酸序列也包括在本发明中。
绿色荧光蛋白 如本文所用，所述的“绿色荧光蛋白”还包括“增效的绿色荧光蛋白”。
任何适合的绿色荧光蛋白均可用于制备本发明的融合蛋白。本文使用的术语“绿色荧光蛋白”是指一种标记蛋白，其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且见光不易淬灭。绿色荧光蛋白的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会。在本发明中，所述的“绿色荧光蛋白”包括各种在野生型绿色荧光蛋白基础上进行改进的蛋白，比如进行基因优化(如去除隐蔽性内含子，在隐蔽内含子的结合位点引入植物内含子，合成密码子用于优化新基因，对GFP进行环状序列改变等)；或通过氨基酸替换提高GFP脱辅基蛋白在高温(如37℃)条件下的正确折叠，以及改变GFP光谱特性等。“增效的绿色荧光蛋白”为对绿色荧光蛋白进行改进后的蛋白，例如，可克隆自质粒pEGFP-N1(购自Clontech)。
绿色荧光蛋白或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性。可采用的一部分氨基酸替换的示例见表1。可能还有其他的类似的可替换性，这种可替换性往往可以根据经验确定或者根据已知的保守序列进行确定。
任何一种绿色荧光蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，绿色荧光蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种标志分子，其仍然能保持全长的绿色荧光蛋白的全部或部分功能。正常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长绿色荧光蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
具体地说，绿色荧光蛋白或生物活性片段在融合蛋白中具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中第11-262位的氨基酸序列。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的绿色荧光蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。
连接 作为本发明的一种特别优选的方式，所述的表皮生长因子或其活性片段和绿色荧光蛋白或其活性片段通过多肽连接子连接，从而形成融合蛋白。本发明人出乎意料地发现，在表皮生长因子和绿色荧光蛋白的氨基酸序列之间连接上一段适当长度的氨基酸接头，可大大提高融合蛋白与表皮生长因子受体的结合和内吞。
在本发明的一种优选方式中，所述的连接子包括4-20个氨基酸。在本发明的更优选的方式中，所述的连接子的氨基酸序列为(GGGS)n(其中，n＝1～5)；更优选的，所述的n＝1-4；最优选的，所述的n＝2，即所述连接子为GGGSGGGS(SEQ ID NO10)。
作为一种优选的方式，所述的增效的绿色荧光蛋白或其活性片段位于融合蛋白的氨基端(N端)；所述的表皮生长因子或其活性片段位于融合蛋白的羧基端(C端)。可选择地，也可互换两种蛋白所处的位置，也即所述的增效的绿色荧光蛋白或其括性片段位于融合蛋白的羧基端；所述的表皮生长因子或其活性片段位于融合蛋白的氨基端。
此外，作为另一种方式，将所述的表皮生长因子和绿色荧光蛋白或它们的活性片段直接连接，比如把绿色荧光蛋白与表皮生长因子的编码基因直接连接，融合表达，二者之间不加氨基酸连接子。但是，本发明人的结果显示，不加连接子所获得的蛋白与表皮生长因子受体的结合不如表皮生长因子与绿色荧光蛋白之间带有本发明优选的连接子的情况。
纯化标签 作为本发明的一种优选方式，所述的融合蛋白的氨基端(或羧基端)还可含有一个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His，AU1，EE，T7，4A6，∈，B，gE以及Ty1(见表2)。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。
表2可使用的标签系统 对上述可用的标签的描述可参见如下文献Prickett等，BioTechniques，7(6)580-584(1989)；Xie等，Endocrinology，139(11)4563-4567(1998)；Nagelkerke等，Electrophoresis，182694-2698(1997)；Tolbert和Lameh，J.Neurochem.，70113-119(1998)；Chen和Katz，BioTechniques，25(1)22-24(1998)；Tseng和Verma，Gene，169287-288(1996)；Rudiger等，BioTechniques，23(1)96-97(1997)；Olah等，Biochem.，22194-102(1994)；Wang等，Gene，169(1)53-58(1996)；Grose，U.S.Patent No.5,710,248；Bastin等，Mol.Biochem.Parasitology，77235-239(1996)Invitrogen，Sigma，Santa Cruz Biotech。
在本发明的优选方式中，在融合蛋白的氨基端设置有His6标签，以便于融合蛋白的纯化。
核酸分子 另一方面，本发明提供了编码所述的融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。
并且，本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。
任何编码表皮生长因子或其活性片段的合适的DNA结构都适用于本发明。任何编码绿色荧光蛋白或其活性片段的合适的DNA结构也适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。
表达载体 任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体实验室手册(Elsevier最新版)中所描述的。在本发明的优选方式中，所述的载体为原核载体，如pET28a载体。
表达载体包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合蛋白DNA序列，如哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。调节序列包括转录启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点或控制转录和翻译起始和终止的合适序列。在融合蛋白序列需要调节序列功能的时候，则连接合适的调节序列。这样，启动子序列被连接在编码融合蛋白DNA序列前端。在宿主细胞内的复制的能力通常由复制起始点控制。用于转化株识别的筛选基因也可加入表达载体。
另外，非天然的表皮生长因子或绿色荧光蛋白的信号肽的编码序列可以引入表达载体。例如信号肽(分泌引导物)序列可以和与融合蛋白编码序列融合，从而使翻译的融合蛋白可分泌到细胞外。信号肽可增强宿主细胞向胞外分泌嵌合多肽。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
宿主细胞 此外，含有编码所述融合蛋白的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。在本发明的一种方式中，该细胞可为原核细胞。更优选的，所述细胞可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。
生产融合蛋白的方法 生产融合蛋白的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有融合蛋白编码核酸的重组细胞。所述的融合蛋白包括表皮生长因子或其有活性的片段以及绿色荧光蛋白或其活性片段。所述方法可包括让细胞表达编码的融合蛋白，以及使表达的融合蛋白的复性。在一个实例中，所述方法还可包括复性的融合蛋白的分离和/或纯化。所述方法的产物也被保护。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜，例如Millipore、Amicon、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。SP基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
可利用含有表皮生长因子或绿色荧光蛋白的抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合性多肽进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。
重组蛋白以及编码该重组蛋白的核酸可利用适当的方法制备，例如，化学合成、重组表达，或其合并应用。参见John Wiley & Sons，Inc 2000年出版的《Current Protocolsin Molecular Biology》，以及Cold Spring HarborLaboratory Press1989年出版的《Molecular ConingA Laboratory Manual》。在一个实例中，编码融合蛋白的核酸序列是利用PCR技术制备的，方法参见Prodromou等(Protein Eng.5(8)827-29；1992)论著。
融合蛋白的用途 本发明的表皮生长因子与绿色荧光蛋白的融合蛋白可用于观察表皮生长因子受体的内吞、信号转导机理、以及表达情况。采用本发明的融合蛋白，不仅能够在观察表皮生长因子受体的内吞及其信号转导机理时提高敏感性和灵敏度，并且还便于进行直观观察和活体观察。由于表皮生长因子及表皮生长因子受体在人体许多细胞的生长、分化、增殖过程中起着重要的作用，并且表皮生长因子受体在很多肿瘤细胞中高表达，是肿瘤较理想的靶点，因此观察表皮生长因子受体的内吞及其信号转导机理是非常有意义的，有利于找到肿瘤基因治疗、生物治疗的靶点。
当获得了所述的融合蛋白后，本领域技术人员可通过一些手段来观察表皮生长因子受体的内吞、信号转导或表达等一系列性状。比如，首先将本发明所述的融合蛋白与受试细胞(如其细胞膜上包含表皮生长因子受体)相接触；接着借助荧光显微镜拍照，或通过免疫荧光检测的手段观察绿色荧光蛋白的位置、以及定量结果，从而获知表皮生长因子受体的内吞或信号转导情况、或获知表皮生长因子受体的表达情况。
本发明所提供的融合蛋白在浓度为1.5ng/ml(指的是所含EGF的量)时，就可以在共聚焦荧光显微镜下观察到EGF的内吞，并且可以观察到它与网格蛋白(Clathrin)共定位，可见所述的融合蛋白是高度灵敏的，并且易于观察。
本发明的主要优点在于 (1)首次提供且制备出表皮生长因子与绿色荧光蛋白的融合蛋白，绿色荧光蛋白与表皮生长因子的融合不影响表皮生长因子与其受体的结合；为观察表皮生长因子受体的内吞、检测细胞表皮生长因子受体的表达状况以及研究表皮生长因子受体的信号转导机理创造了极其良好的条件。
(2)在操作时无需避光，不存在放射等污染因素，操作简单便捷。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 pET28a-EGFP-EGF载体的构建 以带有增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-N1(购自Clontech)为模板，用引物GFPNde和GFPECOR扩增EGFP序列，然后用Ndel及EcoRl酶切，然后插入Ndel/EcoRl双酶切的pET28a载体(购自Novagen)骨架，其中， GFPNde(SEQ ID NO2) 5’-GGGAATTCCATATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’； GFPECOR(SEQ ID NO3) 5’-CCGGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。
测序鉴定获得含有EGFP的载体，命名为pET28a-EGFP。为了便于在EGFP编码序列的3’端插入其他蛋白的编码序列，本发明人在pET28a-EGFP的酶切位点EcoRI和XhoI之间插入以下序列MCSU，以引入BamHI和HindIII酶切位点 5’-AATTCAGCCAGCCGAAGCTTCGCGGATCCTAAC-3’(SEQ ID NO4)；及 5’-TCGAGTTAGGATCCGCGAAGCTTCGGCTGGCTG-3’(SEQ ID NO5)。
经测序鉴定，本发明人把该载体命名为pET28a-GFPmcs。
随后，本发明人以M13KO7-EGF载体(详见Liang Y，Shi B，Zhang J，et al.(-)gene leads to better gene expression than(+)gene in phage gene delivery systems.Biotechnology Progress.2006 May-Jun；22(3)626-30.)为模板，用引物EGF-2及EGF-11扩增EGF，然后用BamHI/HindIII双酶切，琼脂糖凝胶回收插入BamHI/HindIII双酶切的pET28a-GFPmcs的载体骨架，即获得pET28a-GFPmcsEGF载体。
EGF-2(SEQ ID NO6) 5’-CGCGGATCCGCGCAGTTCCCACCACTTC-3’； EGF-11(SEQ ID NO7) 5’-CCCAAGCTTAATAGTGACTCTGAATGTCCC-3’ 为了减少EGF和EGFP蛋白之间的构象互相影响，本发明人在EGF和EGFP之间，也就是EcoRI和HindIII酶切位点之间插入了连接子序列Link1和Link2，从而获得载体pET28a-EGFP-EGF，其中， Link1(SEQ ID NO8) 5’-AGCTTAGAGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCG-3’； Link2(SEQ ID NO9) 5’-AATTCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCTCTA-3’。
获得的pET28a-EGFP-EGF载体见图1。
实施例2 EGFP-EGF蛋白的表达及纯化 将经过鉴定的pET28a-EGFP-EGF质粒转化宿主菌大肠杆菌HMS174(DE3)(购自ATCC)感受态细胞中，挑取单菌落接种于含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
次日，1∶20稀释于300ml含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，继续振荡培养至OD600约为0.6，加入IPTG使终浓度为1mM，30℃诱导3h。离心收集菌体，用30ml PBS重新悬浮起菌体，超声至细胞完全裂解，4℃，13000rpm，10分钟离心，收集上清。
取Ni-NTA resin溶液(购自Qiagen)加入蛋白上清中，4℃，旋转孵育7～8小时。将孵育液转移至洗脱柱中，用5倍NTA Resin体积的NTA-0 Buffer洗涤树脂，收集洗脱液，依次用5倍Ni-NTA resin体积的NTA-40 Buffer，NTA-80Buffer，NTA-100 Buffer，NTA-200 Buffer，NTA-250 Buffer洗涤树脂，收集洗脱液，每管收集一个NTA Resin体积。在12％SDS-PAGE凝胶中电泳，确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况，结果见图2。
然后使用Amicon Ultra-4离心过滤装置对含有蛋白的洗脱液进行脱盐、浓缩。收集浓缩蛋白，采用BCA及SDS-PAGE电泳确定EGFP-EGF蛋白的浓度，结果见图3。
最后将蛋白保存于HBS(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)缓冲液及50％甘油中，-20℃长期保存。
经测序，所述的融合蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO1) MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MMVSKGEELF TGVVPILVEL DGDVNGHKFS VSGEGEGDAT60 YGKLTLKFIC TTGKLPVPWP TLVTTLTYGV QCFSRYPDHM KQHDFFKSAM PEGYVQERTI120 FFKDDGNYKT RAEVKFEGDT LVNRIELKGI DFKEDGNILG HKLEYNYNSH NVYIMADKQK180 NGIKVNFKIR HNIEDGSVQL ADHYQQNTPI GDGPVLLPDN HYLSTQSALS KDPNEKRDHM240 VLLEFVTAAG ITLGMDELYK EFGGGSGGGS KLNSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK300 YACNCVVGYI GERCQYRDLK WWELRGS327 实施例3 EGFP-EGF蛋白与细胞结合及内吞 为了分析EGFP-EGF蛋白的内吞，接种3×104Hela细胞(购自ATCC)于24孔板；第二天，于实验前3小时将细胞培养液换为无血清的DMEM培养液。血清饥饿3小时后，将纯化的EGFP-EGF蛋白加入细胞中，使EGFP-EGF的终浓度为200ng/ml，37℃孵育1小时，在室温下用PBS洗涤3次，每次10分钟。同时以EGFP蛋白(200ng/ml)作为阴性对照。
用荧光显微镜拍照(Axioskop 2；Carl Zeiss，Gottingen Germany)。为了证明EGFP-EGF中是通过EGF介导内吞的，在竞争对照组中的EGFP-EGF同时添加了200倍过量(质量比)的EGF。
结果见图4，其中A为EGFP-EGF蛋白的结合及内吞情况；B为EGFP蛋白的结合及内吞情况；C为用EGF蛋白竞争EGFP-EGF蛋白的结合及内吞情况。显示了EGFP-EGF中通过EGF介导内吞。
实施例4 免疫荧光检测EGFP-EGF蛋白的内吞途径 将Hela细胞培养基换成含EGFP-EGF蛋白(终浓度为1.5ng/ml)的DMEM培养基，在4℃孵育60分钟，转移到37℃孵育20～30分钟。细胞用PBS洗涤3次，每次10分钟，然后用含4％多聚甲醛，0.1％Triton X-100的PBS固定及通透10分钟，接着在室温下用PBS再次洗涤。
然后，用含5％山羊血清的PBS封闭3分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟；然后与用PBS1∶500稀释的网格蛋白小鼠抗体室温作用3小时。随后，用PBS洗3次，每次10分钟。
然后，添加用PBS 1∶50稀释的TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate)标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体(H+L；KPL，Guildford，UK)，孵育30分钟。
接着，用PBS洗3次，每次10分钟。
最后可用Zeiss LSM共聚焦荧光显微镜观察细胞及荧光。
实施例5 EGFP-EGF蛋白与网格蛋白在细胞内共定位 Hela细胞种于盖玻片上，过夜，血清饥饿3小时。添加含终浓度为1.5ng/mlEGFP-EGF的DMEM，4℃孵育60min，转移到37℃，孵育30min，固定，免疫荧光检测网格蛋白。
Zeiss LSM共聚焦荧光显微镜下观察。
结果见图5，其中，A为EGFP-EGF内吞(绿色)；B为免疫荧光检测网格蛋白(红色)；C为A和B的叠加影像(黄色)。
上述结果表明，EGFP-EGF融合蛋白能够发生内吞并可与网格蛋白在细胞内共定位。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海市肿瘤研究所
<120>表皮生长因子与绿色荧光蛋白的融合蛋白
<130>063929
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>327
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>融合蛋白
<400>1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
20 25 30
Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys
35 40 45
Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu
50 55 60
Thr Leu Lys PheIle Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro
65 70 75 80
Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr
85 90 95
Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu
100 105 110
Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr
115 120 125
Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg
130 135 140
Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly
145 150 155 160
His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn ValTyr Ile Met Ala
165 170175
Asp Lys GIn Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn
180 185 190
Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr
195 200 205
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
210 215 220
Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
225 230 235 240
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
245 250 255
Glu Leu Tyr Lys Glu Phe Gly Gly G1y Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu
260 265 270
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
275 280 285
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
290 295 300
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
305 310 315 320
Trp Trp Glu Leu Arg Gly Ser
325
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
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gggaattcca tatggtgagc aagggcgag 29
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>3
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<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>连接子
<400>10
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 权利要求
1.一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括第一部分和第二部分，其中，
第一部分绿色荧光蛋白；和
第二部分表皮生长因子；
并且，所述的融合蛋白可与表皮生长因子受体结合。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的绿色荧光蛋白为增效的绿色荧光蛋白。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的绿色荧光蛋白或其活性片段位于融合蛋白的氨基端；所述的表皮生长因子或其活性片段位于融合蛋白的羧基端。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，在第一部分和第二部分之间，包括4-20个氨基酸的连接子。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接子的氨基酸序列为(GGGS)n，其中，n＝1～5。
6.一种核酸分子，其特征在于，
(i)所述的核酸分子编码权利要求1所述融合蛋白；或
(ii)所述的核酸分子与(i)所述的核酸分子相互补。
7.一种载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的核酸分子。
8.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求7所述的载体；
或所述的细胞基因组中整合有权利要求6所述的核酸分子。
9.权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于
制备观察表皮生长因子的内吞及分子机理的物质；或
制备检测表皮生长因子受体的表达水平的物质。
10.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括培养权利要求8所述的细胞，使所述细胞产生所述的融合蛋白。
全文摘要
本发明属于生物学和生物医学领域，公开了一种融合蛋白，所述的融合蛋白的第一部分为绿色荧光蛋白或其活性片段；第二部分为表皮生长因子或其活性片段；更特别的，上述两个部分之间还包括一段适当长度的氨基酸连接子。本发明的融合蛋白可以用于表皮生长因子受体的内吞及其分子机理研究，以及表皮生长因子受体表达水平的检测等。本发明的融合蛋白在用于检测时敏感性好且无需避光操作，不存在放射等污染因素。
文档编号C07K14/435GK101096383SQ20061002834
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者李宗海, 顾健人, 华 蒋, 徐宇虹 申请人:上海市肿瘤研究所