专利名称：以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的biv指示细胞系的制作方法
以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的BIV指示细胞系
技术领域：
本发明涉及一种用于检测牛免疫缺陷病毒感染的细胞系，以及该细胞系的建立方法和 它的具体应用。
背景技术：
牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus ， BIV)与人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus ， HIV)同属于反转录病毒科慢病毒属，与HIV基因组高度同源， 其遗传、复制方式、与宿主细胞的相互关系、致病机理等与HIV极其类似，用其作为一种 艾滋病研究模型,用于探讨慢病毒基因表达调控、慢病毒与其它病毒超感染后病毒间以及 病毒与宿主细胞间的相互作用，具有很高的安全性。建立BIV指示细胞系是研究BIV的分 子生物学的有力工具。
指示质粒稳定转染可以被病毒感染的细胞系，该细胞系称为指示细胞系。该细胞系的 基因组含有被病毒反式激活因子的应答元件调控的报告基因，病毒感染或病毒的反式激活 因子可以特异性启动病毒反式激活因子的应答元件下游的报告基因的表达，通过检测报告 基因产物，指示病毒的感染。传统的在细胞培养中病毒感染的识别方法主要有观察细胞病 变法。细胞病变法测定的病毒滴度依赖实验者的肉眼观察，主观性较大，不同实验者可能 得出不同的结果。与传统的检测方法相比，指示细胞系具有快速，简便，灵敏的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一株可以快速简便地检测牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子 的指示细胞系以及该细胞系的应用。
本发明提供的牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus ，BIV)感染的指示 细胞系，已于2007年5月16日保藏于"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心"(北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCCNo. 2050 。
本发明提供的细胞系的制备方法如下
首先构建成一个可以应答牛免疫缺陷病毒感染的指示质粒，其具体核苷酸序列如序列 表1所示，即将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因插入到一种特异应答牛免疫缺陷病毒 反式激活因子的应答元件下游，质粒含有G418抗性基因。所述的特异应答牛免疫缺陷病 毒反式激活因子的应答元件是BIV LTR中U3和TAR区，不含有负调控区域U5区。
将该质粒转染幼仓鼠肾细胞(Baby Hamster Kidney cell, BHK-21)，加入G418进行 筛选稳定表达的细胞系，初筛三周后，将抗性细胞进行单克隆化；通过转染BIV反式激活-
因子24小时后用荧光显微镜观测绿色荧光来分别鉴定每个单克隆特异响应BIV反式激活 因子的能力，最终挑选无本底表达但经过BIV病毒攻击后EGFP表达量高的阳性克隆即为 BIV的指示细胞系。
本发明的检测牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子的新方法是BIV感染或BIV反 式激活因子Tat转染BIV指示细胞系，BIV指示细胞系的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因表达，使细胞发出绿色荧光，在荧光显微镜下观 察绿色荧光间接指示BIV的感染或BIV Tat的激活，激活作用也可以用流式细胞仪定量检
该细胞系应用可示例于如下研究BIV Tat及JDV Tat的激活机制，研究BIV原克 隆的感染性，研究病毒的超感染，检测BIV病毒在上清或冻融裂解液中的感染性，鉴定某 种因子对BIV复制的抑制或促进作用，鉴定某种因子对BIV Tat的抑制或促进作用。
本发明的优点和积极效果
本发明细胞系具有以下优点以EGFP为报告基因，无需外加底物或裂解细胞，操作 简便易行；可以通过荧光显微镜实时观察，了解感染的动态过程；可以通过流式细胞仪定 量检测；在病毒感染或反式因子转染12小时后细胞即可观察到绿色荧光，即使一两个绿 色荧光细胞也可以检测出来，灵敏快速。
本发明的应用价值在于-
(1) BIV分子生物学研究的有力工具。对BIV的深入了解，有助于了解同属反转录病 毒的HIV的分子特性，推动慢病毒的基础研究。
(2) 应用于JDV的分子生物学的研究。JDV是近年新发现的一种使牛急性发病的反转 录病毒，但目前对其了解甚少。JDV基因组与BIV有很高同源性。JDV Tat同样能够激活 BIV LTR，应用指示细胞系可以指示JDV Tat的激活作用。
(3) BIV与HIV的分子生物学特性相近，但BIV不感染人，可以不用在P3实验室操 作。应用该指示细胞系和BIV病毒建立抗反转录病毒感染的药物筛选模型，对有抗AIDS 活性的药物进行初筛，从而降低研究的安全风险，操作简便。
具体实施方式
实施例1
以EGFP为报告基因的BIV指示细胞系的建立 1.构建指示质粒
以BIV原克隆质粒BIV127为模板，PCR反应扩增BIV LTR中U3+TAR区段，不含有
负调控区U5,这一段启动子可以更好地响应Tat激活。将其连接到去除CMV启动子的真 核表达载体pEGFP-Nl中，构建成BIV指示质粒。pEGFP-Nl载体上含有neo基因，可以使 转染该质粒的细胞具有G418抗性。该质粒中，U3+TAR区在报告基因EGFP上游，直接调 控报告基因的表达。BIV反式激活因子Tat可以结合在TAR上，从而起始下游报告基因的 转录，通过观察EGFP蛋白的绿色荧光可以判断BIV感染水平。瞬时转染BIV Tat和指示 质粒，观察绿色荧光，鉴定指示质粒具有指示BIV感染的功能。 2.建立稳定整合指示质粒的指示细胞系
将指示质粒转染B服-21细胞，转染后第二天，在培养基中加入600ug/ml的G418， 一星期后细胞开始大量死亡，到第14天对照孔细胞全部死亡，至20天，细胞开始成簇生 长，此时生长的细胞即为细胞基因组中己经整合了质粒的阳性克隆；经过初筛后，有限稀 释法进行单克隆化进行单克隆操作，将分离到的单克隆细胞株扩大培养，转染BIVTat进 行指示功能的鉴定，筛选无本底表达但相应BIVTat蛋白的激活发出较强绿色荧光的阳性 克隆，再用FBL-R29共培养检测其对BIV病毒的响应。
实施例2
应用BIV指示细胞系指示BIV病毒的感染
将BIV R29感染的FBL与BIV指示细胞系以1: 1的比例共培养，使用荧光显微镜观 察绿色荧光，感染12小时后即可看见微弱荧光，荧光的强度随时间而增强，发绿色荧光 的细胞和合胞体也逐渐增多，在24小时后即可明显看到绿色荧光的细胞和合胞体。BIV 指示细胞系的指示功能长期有效，长期培养感染BIV后的指示细胞系，感染两周后仍可见 绿色荧光。
实施例3
应用BIV指示细胞系指示反式激活因子的激活
1. 指示BIV Tat的激活
以105接种量将BIV指示细胞系铺到12孔板的两个孔，24小吋后以PEI为转染试剂 进行转染，BIV Tat真核表达质粒和pCDNA3. 1为负对照各500ng， 12小时后转染BIV Tat 的孔即可观察到绿色荧光，24小时后绿色荧光明显可见，而转染空载体的负对照孔无绿 色荧光。
2. 指示JDV Tat的激活
JDV反式激活因子JDV Tat也能够激活BIV LTR，而且JDV Tat对BIV LTR的激活作 用更加强烈。
同上述方法，转染JDV Tat的真核质粒，以pCDNA3. 1为负对照，以BIV Tat为正对 照，JDV Tat转染细胞系24小时后后绿色荧光明显可见，且比BIV Tat转染后细胞发出 更强的绿色荧光，而转染空载体的负对照孔无绿色荧光。
研究JDVTat的分子机理有助于了解JDV的致病机制，解释为什么与BIV同是反转录 病毒中的慢病毒，JDV引起牛的病变更加强烈。而JDV目前尚不能体外培养，BIV指示细 胞系是研究JDV Tat的有力工具。
实施例4
指示BIV原克隆的感染性
在病毒的分子生物学研究中经常用到病毒的原克隆。BIV127是BIV的原克隆质粒。 将BIV127转染指示细胞系，每天在荧光显微镜下观察，转染3天后个别细胞呈现绿色荧 光，之后绿色荧光细胞逐渐增多，开始出现绿色的合胞体。而负对照转染pCDNA3. 1(-) 则不产生荧光。利用指示细胞系观察绿色荧光的方法检测原克隆的感染性，比观察病变的 方法更灵敏快速，观察病变的方法在5天后能够看到典型合胞体。
实施例5
应用BIV指示细胞系研究病毒超感染
病毒携带者伴随有其它病毒的交叉感染，称为超感染(superinfection) 。 H IV与其 它病毒的超感染不但能激活处于潜伏态的H IV病毒，使已表现A IDS症状的个体症状加 剧，而且可能使处于潜伏期的携带者突发成为AIDS患者；同时H IV又可以相同的效应反 作用于超感染的病毒，比如加剧超感染病毒的症状等，这使得病毒病的治疗更加扑朔迷 离，困难重重。
以BIV为模型研究其它病毒与BIV的超感染是研究超感染的良好模型。 已知牛泡沫病毒BFV能够激活BIV LTR，在病毒的超感染中起到重要作用。应用BIV
指示细胞系验证BFV能够激活BIV LTR。将牛泡沫病毒原克隆质粒pCMV—BFV转染BIV指
示细胞系，每天在荧光显微镜下观察，转染3天后个别细胞呈现绿色荧光，之后绿色荧光
细胞逐渐增多，而负对照转染pCDNA3. 1(-)则不产生荧光。
这种较微弱的超感染作用只有以EGFP为报告基因，才能在细胞水平显示出来，并且
实时观察。
实施例6
利用BIV指示细胞系鉴定BIV上清感染性
某些情况下，需要得到无细胞病毒储液(cell free virus stock),排除因共培养加 入的已经感染病毒的细胞的影响。而BIV的无细胞储液的获得一直是个难题，研究BIV病 毒的方法都是将病毒感染的细胞与待测细胞共培养。利用BIV指示细胞系可以实时观察上 清的感染性。
收集BIV感染FBL后的培养基上清，2800rpm离心3分钟，取上清，经过0. 45um滤 膜过滤，去除细胞或细胞碎片，制得BIV上清。
将上清加入BIVE指示细胞系，每天观察绿色荧光，经过7天后细胞发出绿色荧光， 说明上清具有感染性。
通过超速离心或蔗糖密度梯度离心从上清中制备高浓度的病毒颗粒，加入BIV指示细 胞系检测，观察绿色荧光，看能否富集上清中有感染性的病毒颗粒。
实施例7
指示细胞系与CPE方法的比较
传统的病毒测定是基于细胞病变，其中一种经典的方法就是TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50%),即50%组织细胞感染量的测定。在免疫缺陷病毒滴度的测定中， 这种方法被广泛应用，直到指示细胞系的出现。
BIV R29与FBL共培养，待细胞出现典型的核胞体后，将细胞用0. 25%胰酶消化，分 成等份。将FBL (P10)和指示细胞系分别按1X104细胞铺96孔板，按照1: 10的稀释 倍比接入BIV R29感染的FBL。从第二天开始每天观测细胞病变(FBL)和绿色荧光蛋白 的表达情况， 一直记录到病毒维持最高滴度。指示细胞系检测到的最大滴度出现在感染后 4天，而基于细胞病变的检测到的最大滴度出现在感染后6-7天。此外，指示细胞系检测 到的病毒滴度要比病变检测到的病毒滴度高2个数量级，即前者是后者的100倍。由此可 见，BIV指示细胞系方法比CPE的方法更灵敏。
序列表
〈110〉南开大学
〈120〉以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的BIV指示细胞系 〈160〉 1 〈210〉 1 〈211〉 488 <212〉 DNA
〈213〉牛免疫缺陷病毒(Bovine Immunodeficiency Virus, BIV) <400>1
cgagctcttacgcgtgctagcccgtagctagccttsaaagggtggactgt50
ggggcsgggtgggacctcaggacaacagcagcccccggacttcccatatg100
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tagctccgsgctcccca^cctacagcctga488
权利要求
1、一种用于构建指示细胞系的可以应答牛免疫缺陷病毒感染的指示质粒，具有序列表所示核苷酸序列；该指示质粒是将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因插入到一种特异应答牛免疫缺陷病毒反式激活因子的应答元件下游构建而成，质粒含有G418抗性基因。
2、 根据权利要求1所述的指示质粒，其特征是所述的一种特异应答牛免疫缺陷病毒 反式激活因子的应答元件是BIV LTR中U3和TAR区，不含有负调控区域U5区。
3、 一株由权利要求1中的指示质粒构建的指示牛免疫缺陷毒感染的细胞系，其保藏 号为CGMCC No. 2050 。
4、 根据权利要求3所述的细胞系，其特征是该细胞系的构建过程如下将权利要求 1中的指示质粒转染BHK-21细胞，加入G418进行筛选稳定表达的细胞系，初筛三周后， 将抗性细胞进行单克隆化；通过转染BIV反式激活因子24小时后，用荧光显微镜观测绿 色荧光来分别鉴定每个单克隆特异响应BIV反式激活因子的能力，最终挑选无本底表达但 经过BIV病毒攻击后EGFP表达量高的阳性克隆即为BIV的指示细胞系。
5、 一种权利要求3所述的细胞系的应用，其特征是利用该细胞系实现快速灵敏实时 指示BIV感染性及响应BIV反式激活因子的激活。
全文摘要
一株指示牛免疫缺陷病毒BIV感染的细胞系及其应用。该细胞系可以在BIV感染的特定条件下表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，从而通过检测该蛋白的表达来间接指示牛免疫缺陷病毒的感染。该细胞系(其保藏号为CGMCC No.2050)的构建过程首先构建成一个可以应答牛免疫缺陷病毒感染的具有序列表所示核苷酸序列的报告质粒，之后，将该质粒转染BHK-21细胞，筛选稳定表达的细胞系并单克隆化；挑选无本底表达但经过BIV病毒攻击后高表达EGFP的阳性克隆即为BIV的指示细胞系。本发明具有快速简便且可以实时指示BIV感染和BIV反式激活因子激活作用的特点。
文档编号C12N5/10GK101100675SQ20071005767
公开日2008年1月9日 申请日期2007年6月19日 优先权日2007年6月19日
发明者乔文涛, 雪 姚, 耿运琪, 陈启民 申请人:南开大学