专利名称：丹参酮相关基因的检测芯片、制备及检测方法
技术领域：
本发明属于生物芯片技术领域，尤其是一种丹参酮相关基因的检测芯片、制备及检测方法。
背景技术：
中药丹参为唇形科鼠尾草属植物的干燥根部及根茎，作为传统的中药，其应用至少有1500年的历史，全国大部分地区均产，其性味苦、微温、具有活血化瘀、通经止痛、凉血消痈、清心除烦的功效，为临床常用药，以治疗冠心病及缺血性疾病效果更为突出；其化学成分主要包括脂溶性和水溶性两部分，丹参酮是其主要脂溶性成分，临床上广泛应用的丹参各种制剂均以丹参酮或丹参素为其主要成分。
丹参酮是一类化合物，国内外对此进行了大量研究工作，分离得到其活性单体，测定其结构式，分别命名为丹参酮(tanshinone，Tan)I、1IA，IIB，隐丹参酮，异丹参酮I、IIA，异隐丹参酮，羟基丹参酮A，丹参酸甲酯，二氢丹参酮，丹参新醌甲、乙和丙等。丹参酮的药理作用主要有1.抗菌作用对于葡萄球菌、痤疮丙酸棒状杆菌、分枝杆菌以及某些真菌有强大的抑制作用，尤其对革兰氏阳性球菌有明显的抑制作用，对耐药金黄色葡萄球菌仍有很好的抑制作用，而且长期使用不产生耐药性；2.扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量；3.减慢心率，增加心肌收缩力，改善缺氧后引起的心肌代谢紊乱及心功能；4.抑制凝血；5.促进组织修复；6.降低血脂；7.保护红细胞和抑制细菌生长；8.抗炎作用对组胺引起的血管通透性增加有明显抑制作用，抑制中性粒细胞的趋化运动，并能降低血浆PGE2的含量，减轻炎症的反应；9.内分泌调节作用可作用于体内的性腺靶器官，调节其激素分泌，维持体内激素平衡。
基因芯片技术是一种高通量、快速、平行核酸序列测定及定量分析技术，它将大量特定序列的核酸片段有序地固定在载体上作为探针与标记的待测核酸分子进行杂交，然后通过检测杂交信号的强弱，进而判断样品中靶分子的组成及含量。该技术与传统生物技术相比是一次重大创新和飞跃，具有十分诱人的前景。基因芯片已经被广泛应用于基因表达谱研究，通过快速高效地获取大量基因在mRNA水平的表达信息，并对在不同条件下的大量基因表达情况的平行分析，从而获得基因的初步功能信息。在基础研究中还可用于基因鉴别筛选及功能研究、快速DNA序列再测定、基因突变多态性的研究和基因表达测定等多个领域。
我国丹参资源丰富，分布广泛，品种繁多，根据丹参的形态可分为无花丹参、白花丹参、紫花丹参等；主要产地有山西、陕西、山东、甘肃、四川、河南、江苏等，各个产地各种品种的丹参均作药用，而丹参酮的含量各地各品种差别巨大，药效作用很不一致。丹参药材的质量在中国药典2000年版中以丹参酮的含量来控制，因此如何提高作为主要药理作用的丹参酮的含量是亟待解决的课题。利用基因芯片技术对丹参酮相关基因表达进行研究，进而进行基因工程改造是最佳方法之一。
但目前市场上尚无丹参酮相关基因的检测芯片。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种结构简单，设计科学合理的丹参酮相关基因的检测芯片。
本发明的另一个目的在于提供一种丹参酮相关基因的检测芯片的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种利用丹参酮相关基因的检测芯片的检测方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的一种丹参酮相关基因的检测芯片，其特征在于该基因芯片是在玻璃片基质上设置丹参酮相关基因的检测探针。
该检测探针的序列为丹参酮相关基因的检测探针编号序列1号5′GGACATCCCTCGTGCCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTTAGAGCGCCGCCA3′2号5′TACGCCCCAAAGGAACAAACTGATCGACTGGGACATCTTCAGCAGGGATGCCGAGCTCAT3′3号5′ACCAAGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCT3′4号5′GCTGCGAGAAGCATATCGTCATGAACACGGATGGCACCAGAGATTATCAAACCGAGACCG3′5号5′TGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGG3′6号5′GTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGGC3′7号5′TGTGAATCTTCGCCAGACCGTTCCGCCCCGTCCCGCCGTTAGCCATGCTCACGCGTCCGT3′8号5′GTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGGC3′9号5′GGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGCA3′10号5′AGATGATGCAATCGGGCGAGTATTTAGCGAGCGGCGGCACGATATGCTTGAACAGCGCGA3′11号5′TGCTTCCCACATAGCTCACCTCCGCAATAAAGGCCTCCCAACGATCCCAACCTCATTAGG3′12号5′CGATGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCC3′13号5′AGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGC3′
14号5′CGAAAATGGCTCGACCCTCGCTCCATGTATAAGCTTCCTCAGCCGTACACTCAGACTGTG3′15号5′GGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGCA3′16号5′CTGGATGCCGAGGATCAGCGAGCAAGGGGAAAAGACCACGTACTATAAGCGATTGCCTTG3′17号5′CAAGCGCTATGAGCTCTGCAATACCAGTGCCAGCCTCTCCAGCTCCAAGGAATAAGAATC3′18号5′AGGACCAGCAGCAAGAATTTCATCAGTCAGCTTGTCGTCCTTGCCAATCTTGTGAGCCAC3′19号5′AGTAAACAGCTCGGAGGGGTCGGGTGCGGGGATCTCCTTAGCTTTAGCAATGGCTTCATC3′20号5′AGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACAT3′21号5′TGCTCTCATCAAGGTATTCGCGGTATCAAGGTTCTGAGTGAACACTCCTGCAGCAAGACC3′22号5′TCTCTGAAATCTGCCCAAGAGCCCTGTTATGGTCCAATCCCTCGTGCCGAATTCCTGCAG3′23号5′CCGAATACCTCCGTCTTCACGTAGCTCGCCTTCAGCAGTTCCCCGGAATGTATGGCATCG3′24号5′AGGACCTTGCTCTATGCCTGCCTTGAACGGATCCCCAACAGTACGCTTCAGGGCCCGTGC3′25号5′TTCTCATCCTTGCTATACTTCTGCGCGAAGGCCAATCCACACCCCAACGGGATCTGAGCG3′26号5′AGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACAT3′27号5′GCCGTACCGCGTCGCGTTTGCTCGTCTGATCACCTCGTCGATGTCCTTGAACTTCAAGAT3′28号5′TGCCGAGGATCAGCGAGCCAAGGGGAAAAGACCACGTACTATAAGCGATTGCCTTGCCTC3′29号5′GATGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCT3′30号5′GGGAAGCATGGTGTCTCCGGGAAGATCACAGACAGCAATACCCTCTCCTGTAAGATGAGC3′31号5′CCTTTGCCCCACCCCTCGAGTACGGAGTTATCTTCAAGGAGATCATCAGCAACAGCAAGG3′32号5′ACTTGCCTTCTCTCTACCGGAGTAGCTAGGAGCCTAGTCTCGTGATGTCCCTGCTCGACC3′33号5′TCCGGTGGTGAGGGTGCAGCTTCTTGAACAAGGCGAGCGCTTGGATAGCCGATGAAGTGC3′34号5′CCGACTGCGACGCCAGCTGAGTCCCGCCTCCCACTGTCCCTACCTCAATGCAAGGCATCG3′阴性对照探针编号序列35号 5’TTGTCGGGAGGCTGCATGGAAAATAACCCTGCTACTGCGGCGCCTGGAACAGACGTGAGC3’36号 5’GGAACGGAGGTTAATGAGCTGCCTGGGACAGTTTTAATGTAGCCCGCTTCATCAGTGTCG3’37号 5’AAGAGGGGCTTGCGGCGGATGATGAGGTAGAAGGTGATGTCCTGGCGGCTGGGGCTGTCC3’空白对照点编号序列38号39号40号而且，所述的阴性对照探针中，35号为大鼠糖皮质激素受体基因探针，NCBI的序列号为M14053；36号为酵母TRP4基因探针，NCBI的序列号为X04273；37号为人乙酰胆碱δ受体基因探针，NCBI的序列号为X55019；所述的空白对照点仅含2×SSC溶液。
一种丹参酮相关基因的检测芯片的制备方法的步骤如下(1)设计丹参酮特异性探针在基因数据库查找与丹参相关基因和表达序列标签，应用京都基因与基因组数据库软件的比对功能一一确认与丹参酮代谢相关基因作为制备芯片所用基因，然后应用oligo6.0软件设计丹参酮特异性探针；(2).合成探针应用DNA合成仪合成丹参酮特异性探针；(3).片基的处理采用载玻片蒸馏水冲洗，重铬酸钾浓硫酸洗液浸泡20～30小时，然后蒸馏水冲洗、饱和NaOH/乙醇浸泡、蒸馏水冲洗后甩干、多聚赖氨酸溶液涂片后凉干备用；(4).点样用2×SSC溶液溶解丹参酮特异性及阴性对照探针，使用点样仪在玻片上按预先设定好的顺序进行点样，在三个空白对照点只点2×SSC溶液；(5).将点好的玻片在长波紫外灯下交联3～5分钟，使制备成的探针固定在玻片上。
而且，所述的丹参酮特异性探针设计的技术要求为①.G+C含量为50％～65％；②.探针的Tm值上下波动＜5℃；③.单一碱基要保证连续重复5次以下；④.探针分子内部互补碱基少于5bp；⑤.探针之间的二聚体＜6bp；⑥.每个探针与非靶基因的相似性必须＜40％，探针连续同源的碱基数≤20个。
一种丹参酮相关基因的检测芯片的检测方法步骤如下(1).总RNA提取采用异硫氰酸胍提取法或Trizol提取法；(2).逆转录制备cDNACy3-dUTP标记一组cDNA，Cy5-dUTP标记另一组cDNA；(3).在杂交箱中与芯片进行预杂交及杂交，预杂交为20～30分钟，杂交为10～16小时；(4).共聚焦荧光扫描仪上扫描杂交结果；(5).应用微阵列分析软件进行定量分析；(6).根据分析结果确定丹参酮的相关基因表达量。
本发明的有益效果和优点是1.本发明适用于对丹参酮相关基因表达量进行检测，从而获得其功能信息。具有如下功用①检测丹参酮相关基因在不同产地和同一产地同一植株不同发育时期、不同组织器官的表达；②研究丹参酮相关基因在特定条件下如阳光、温度、各种生理胁迫、病虫害侵害、激素诱导等作用时的表达；③研究丹参酮形成的遗传机制；④预测丹参酮的生成量。此外，本发明还可以应用于作丹参种质资源的鉴定评价、丹参优势品种的早期预测、丹参育种和其新品种的产生与鉴定、丹参单核苷酸多态性(SNP)的检定、新型除草剂和新型农药的筛选等。这些功能为丹参酮的研究和丹参的基因工程改造奠定基础，对阐述丹参酮生物合成的基本规律进而通过基因工程手段提高丹参酮的产量具有重要意义。
2.本基因芯片所需基因及EST来自Genbank，使用的是KEGG比对软件，Genbank和KEGG是目前世界上最权威的基因数据库；应用oligo6.0软件设计探针，又有严格的限制条件，因而科学性较强；该芯片上的基因是针对丹参酮选择的，特异性强，能较好地说明丹参酮相关基因表达的情况；所选择的探针数量仅有几十个，Tm值一致性强；采用不同的荧光标记，可直接比较不同情况下的mRNA丰度差异。样品可采用两种荧光标记，一次实验可比较两种以上的样品。在同一张芯片杂交，克服了分开杂交的缺陷，是完全平行的检测，其敏感性较高；利用计算机扫描微阵列能提供两种不同组织mRNA丰度的量化值。本芯片同时包括了用于质量控制和数据校正的阴性对照和空白对照，准确性更强。
3.本发明所制备的基因芯片具有操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低等特点，主要适用各种丹参丹参酮相关基因的检测。
4.本发明适用于对丹参酮相关基因采用PCR扩增方法用于杂交检测，该检测方法操作简便、快速、科学，完成全部检测操作过程只需几小时，而且检测的精确度较高；且本基因芯片在常温下易保存，从而为进行大规模样品的集中检测提供了极大的方便。
5.本发明所涉及的基因芯片操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好；该基因芯片制备简单，成本低廉；使用该基因芯片检测丹参酮相关基因的检测方法简便、快速、科学，检测精确度较高，为医药制造厂家科学准确地控制丹参质量提供了支持，为患者的治疗提供了保障。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例进一步详述，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
该丹参酮相关基因的检测芯片是在基质上设置检测丹参酮的探针，该基因芯片所使用的基质是玻片。
该探针的序列为丹参酮相关基因的检测探针编号序列1号5′GGACATCCCTCGTGCCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTTAGAGCGCCGCCA3′2号5′TACGCCCCAAAGGAACAAACTGATCGACTGGGACATCTTCAGCAGGGATGCCGAGCTCAT3′
3号5′ACCAAGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCT3′4号5′GCTGCGAGAAGCATATCGTCATGAACACGGATGGCACCAGAGATTATCAAACCGAGACCG3′5号5′TGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGG3′6号5′GTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGGC3′7号5′TGTGAATCTTCGCCAGACCGTTCCGCCCCGTCCCGCCGTTAGCCATGCTCACGCGTCCGT3′8号5′GTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCTGGC3′9号5′GGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGCA3′10号5′AGATGATGCAATCGGGCGAGTATTTAGCGAGCGGCGGCACGATATGCTTGAACAGCGCGA3′11号5′TGCTTCCCACATAGCTCACCTCCGCAATAAAGGCCTCCCAACGATCCCAACCTCATTAGG3′12号5′CGATGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCC3′13号5′AGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGC3′14号5′CGAAAATGGCTCGACCCTCGCTCCATGTATAAGCTTCCTCAGCCGTACACTCAGACTGTG3′15号5′GGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACATTTGCAGCA3′16号5′CTGGATGCCGAGGATCAGCGAGCAAGGGGAAAAGACCACGTACTATAAGCGATTGCCTTG3′17号5′CAAGCGCTATGAGCTCTGCAATACCAGTGCCAGCCTCTCCAGCTCCAAGGAATAAGAATC3′18号5′AGGACCAGCAGCAAGAATTTCATCAGTCAGCTTGTCGTCCTTGCCAATCTTGTGAGCCAC3′19号5′AGTAAACAGCTCGGAGGGGTCGGGTGCGGGGATCTCCTTAGCTTTAGCAATGGCTTCATC3′20号5′AGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACAT3′21号5′TGCTCTCATCAAGGTATTCGCGGTATCAAGGTTCTGAGTGAACACTCCTGCAGCAAGACC3′22号5′TCTCTGAAATCTGCCCAAGAGCCCTGTTATGGTCCAATCCCTCGTGCCGAATTCCTGCAG3′23号5′CCGAATACCTCCGTCTTCACGTAGCTCGCCTTCAGCAGTTCCCCGGAATGTATGGCATCG3′24号5′AGGACCTTGCTCTATGCCTGCCTTGAACGGATCCCCAACAGTACGCTTCAGGGCCCGTGC3′25号5′TTCTCATCCTTGCTATACTTCTGCGCGAAGGCCAATCCACACCCCAACGGGATCTGAGCG3′26号5′AGTCTGCAGGTCGAGGGAGTCGCGTCGCCAAACCAAGTTCATATGCCTTAGCAGCTACAT3′27号5′GCCGTACCGCGTCGCGTTTGCTCGTCTGATCACCTCGTCGATGTCCTTGAACTTCAAGAT3′28号5′TGCCGAGGATCAGCGAGCCAAGGGGAAAAGACCACGTACTATAAGCGATTGCCTTGCCTC3′29号5′GATGTGGTTGTAGGCATCAAGCGTGAGAAAATCGTCCAAGACCTGCGCCGTGCATTGCCT3′30号5′GGGAAGCATGGTGTCTCCGGGAAGATCACAGACAGCAATACCCTCTCCTGTAAGATGAGC3′31号5′CCTTTGCCCCACCCCTCGAGTACGGAGTTATCTTCAAGGAGATCATCAGCAACAGCAAGG3′32号5′ACTTGCCTTCTCTCTACCGGAGTAGCTAGGAGCCTAGTCTCGTGATGTCCCTGCTCGACC3′33号5′TCCGGTGGTGAGGGTGCAGCTTCTTGAACAAGGCGAGCGCTTGGATAGCCGATGAAGTGC3′34号5′CCGACTGCGACGCCAGCTGAGTCCCGCCTCCCACTGTCCCTACCTCAATGCAAGGCATCG3′阴性对照探针编号序列35号 5’TTGTCGGGAGGCTGCATGGAAAATAACCCTGCTACTGCGGCGCCTGGAACAGACGTGAGC3’36号 5’GGAACGGAGGTTAATGAGCTGCCTGGGACAGTTTTAATGTAGCCCGCTTCATCAGTGTCG3’37号 5’AAGAGGGGCTTGCGGCGGATGATGAGGTAGAAGGTGATGTCCTGGCGGCTGGGGCTGTCC3’空白对照点编号序列38号39号40号本芯片共有34个丹参酮相关基因的探针，3个阴性对照探针(35号为大鼠糖皮质激素受体基因探针，NCBI的序列号为M14053；36号为酵母TRP4基因探针，NCBI的序列号为X04273；37号为人乙酰胆碱δ受体基因探针，NCBI的序列号为X55019)。三个空白对照点仅含2×SSC溶液，不含任何基因探针。
丹参酮相关基因的检测芯片的制备方法包括如下步骤1.设计丹参酮特异性探针在NCBI(The National Center for BiotechnologyInformation，美国国立生物技术信息中心)的Genbank(基因数据库)查找与丹参相关基因和EST(Expressed Sequence Tags，表达序列标签)，然后应用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，京都基因与基因组)数据库软件的比对功能一一确认与丹参酮代谢相关基因并加以确定，作为制备芯片所用基因。在确定了所用基因之后，应用oligo6.0软件设计探针。为减少非特异性杂交，保证芯片杂交的敏感度和精确度，探针设计遵循以下6条基本原则①G+C含量为50％～65％②探针的Tm值上下波动小于5℃③避免单一碱基连续重复5次以上；④探针分子内部互补碱基少于5bp⑤探针之间的二聚体小于6bp⑥每个探针与非靶基因的相似性必须＜40％，探针连续同源的碱基数≤20个。对备选探针进行筛选时，各种参数尽量控制在最佳范围，以保证同一张芯片上的探针在相同的杂交、清洗条件下得到最佳的杂交效果。
2.合成探针应用DNA合成仪合成上述丹参酮特异性探针。
3.片基的处理市售载玻片蒸馏水冲洗，重铬酸钾浓硫酸洗液浸泡24小时，蒸馏水冲洗，饱和NaOH/乙醇浸泡，蒸馏水冲洗后甩干，多聚赖氨酸溶液涂片后凉干备用。
4.点样用2×SSC溶液溶解丹参酮特异性及阴性对照探针，使用点样仪在玻片上按预先设定好的顺序进行点样，三个空白对照只点2×SSC溶液。
5.将点好的玻片在长波紫外灯下交联3-5分钟，使制备成的探针固定在玻片上。
丹参酮相关基因的检测芯片检测方法的步骤如下1.总RNA提取采用异硫氰酸胍提取法或Trizol提取法。
2.逆转录制备cDNACy3-dUTP标记一组cDNA，Cy5-dUTP标记另一组cDNA。
3.在杂交箱中与芯片进行预杂交及杂交，预杂交为20～30分钟，杂交时间为12小时或过夜。
4.共聚焦荧光扫描仪(Scan Array Express)上扫描杂交结果。
5.应用微阵列分析软件进行定量分析。
6.根据分析结果确定丹参酮的相关基因表达量。
采用该基因芯片检测丹参酮含量的检测方法包括如下步骤(1).准备工作预热恒温水浴箱、预冷低温高速离心机、超净工作台紫外线消毒灭菌、预冷。
(2).取丹参样品约50mg，液氮下研磨。
(3).将上面已经研磨成面的样本倒入eppendorf管中。
(4).加入异硫氰酸胍提取液或Trizol1ml，放置10分钟；用吸头反复吹打数次，使混合均匀。
(5).加入氯仿200ul，混匀，室温放置15分钟；然后，4℃，12000g，离心15分钟；吸取上层水相至另一eppendorf管中。
(6).加入异丙醇0.5ml，混匀，室温放置10分钟；4℃，12000g，离心10分钟；弃上清，RNA沉淀于管底。
(7).加入75％乙醇1ml，温和震荡悬浮沉淀；4℃，8000g，离心5分钟，弃上清，用吸水纸吸干多余乙醇，凉干15-20分钟。
(8).加入经过DEPC处理的去离子水50ul，60℃，10分钟，取出检测其完整性及纯度。
DnaseI消化总RNA中残留的DNA(1).取20μg总RNA，加入5×Dnase缓冲液4μl，Dnase I(1U/μl)5μl，加DEPC水至总体积为20μl，37℃温浴10min。
(2).反应结束，加入180μlDEPC水，200μl水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(50∶49∶1)抽提一次。
(3).取上清液加入3M的醋酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3M，并加2.5倍的无水乙醇，-80℃1h。
(4).12000rpm，4℃离心15min，弃上清。
(5).沉淀物用75％的乙醇洗两次，空气干燥后加入20μl DEPC处理水，调RNA浓度为1μg/μl，-80℃保存备用。
(6).探针标记使用Amersham Pharmacia Biotech公司生产的Cy3dUTP/Cy5dUTP标记试剂；(7).在杂交箱中与芯片进行预杂交及杂交，预杂交为20～30分钟，杂交为10小时或过夜。
(8).共聚焦荧光扫描仪(Scan Array Express)上扫描杂交结果(9).应用微阵列分析软件进行定量分析。
(10).根据分析结果即可确定丹参酮的含量。
权利要求
1.一种丹参酮相关基因的检测芯片，其特征在于该基因芯片是在玻璃片基质上设置丹参酮相关基因的检测探针。
2.根据权利要求1所述的丹参酮相关基因的检测芯片，其特征在于该探针的序列为丹参酮相关基因的检测探针
阴性对照探针
空白对照点
3.根据权利要求2所述的丹参酮相关基因的检测芯片，其特征在于所述的阴性对照探针中，35号为大鼠糖皮质激素受体基因探针，NCBI的序列号为M14053；36号为酵母TRP4基因探针，NCBI的序列号为X04273；37号为人乙酰胆碱δ受体基因探针，NCBI的序列号为X55019；所述的空白对照点仅含2×SSC溶液。
4.一种如权利要求1所述丹参酮相关基因的检测芯片的制备方法，其特征在于该制备方法步骤如下(1)设计丹参酮特异性探针在基因数据库查找与丹参相关基因和表达序列标签，应用京都基因与基因组数据库软件的比对功能一一确认与丹参酮代谢相关基因作为制备芯片所用基因，然后应用oligo6.0软件设计丹参酮特异性探针；(2).合成探针应用DNA合成仪合成丹参酮特异性探针；(3).片基的处理采用载玻片蒸馏水冲洗，重铬酸钾浓硫酸洗液浸泡20～30小时，然后蒸馏水冲洗、饱和NaOH/乙醇浸泡、蒸馏水冲洗后甩干、多聚赖氨酸溶液涂片后凉干备用；(4).点样用2×SSC溶液溶解丹参酮特异性及阴性对照探针，使用点样仪在玻片上按预先设定好的顺序进行点样，在三个空白对照点只点2×SSC溶液；(5).将点好的玻片在长波紫外灯下交联3～5分钟，使制备成的探针固定在玻片上。
5.根据权利要求4所述丹参酮相关基因的检测芯片的制备方法，其特征在于所述的丹参酮特异性探针设计的技术要求为①.G+C含量为50％～65％；②.探针的Tm值上下波动＜5℃；③.单一碱基要保证连续重复5次以下；④.探针分子内部互补碱基少于5bp；⑤.探针之间的二聚体＜6bp；⑥.每个探针与非靶基因的相似性必须＜40％，探针连续同源的碱基数≤20个。
6.一种如权利要求1所述的丹参酮相关基因的检测芯片的检测方法，其特征在于，该检测方法步骤如下(1).总RNA提取采用异硫氰酸胍提取法或Trizol提取法；(2).逆转录制备cDNACy3-dUTP标记一组cDNA，Cy5-dUTP标记另一组cDNA；(3).在杂交箱中与芯片进行预杂交及杂交，预杂交为20～30分钟，杂交为12～16小时；(4).共聚焦荧光扫描仪上扫描杂交结果；(5).应用微阵列分析软件进行定量分析；(6).根据分析结果确定丹参酮的相关基因表达量。
全文摘要
本发明属于涉及一种丹参酮相关基因的检测芯片、制备及检测方法，它是在玻片上设置特异性探针制成基因芯片，然后与经过标记的丹参样品的cDNA杂交，经扫描结果和定量分析确定丹参酮的相关基因表达量。该芯片是针对丹参酮相关基因而设计，特异性强，能够准确的检测丹参酮相关基因的表达，适用于对丹参酮相关基因表达进行检测以获得其功能信息，这为丹参酮的研究奠定了基础，对丹参的基因工程改造具有十分重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK101041861SQ20071005717
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月20日 优先权日2007年4月20日
发明者张伯礼, 王庆浩, 王瑞菊 申请人:天津中医药大学