基于柯丹靶点的comt基因突变检测方法，及其引物、试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属分子生物学技术领域，涉及基于柯丹靶点的C0MT基因突变检测方法，及 其引物、试剂盒。
【背景技术】
[0002] 帕金森病（Parkinson'sdisease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病。我国65 岁以上人群ro的患病率大约是1. 7%。其临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直 和姿势步态障碍等运动和非运动症状。
[0003] 通过文献检索确定，大约10% -20%的ro患者具有家族史，在这部分家族史的患 者中少数（大约5-10% )患者是由单个基因的显性或隐性遗传而导致的，绝大多数的患者 都受到了年龄、环境和遗传等多种因素影响，其中遗传因素起到了不可忽视的作用，目前对 于散发ro患者中遗传易感基因的研究主要集中在多巴胺代谢系统基因，其中包括单胺氧 化酶（MonoamineOxidase，ΜΑ0)基因、儿茶酸氧位甲基转移酶（C0MT)基因、多巴胺转运体 (dopaminetransporter，DAT)基因以及多巴胺受体（DopamineReceptor，DR)基因等。人 类C0MT基因定位于22号染色体长臂1区1带2亚带（22qll.2)，其cDNA已获全长克隆。 该基因有6个外显子，2个启动子，2个（多少是重叠的）开放性阅读框（0RF)，即663bp和 813bp。C0MT基因单核苷酸多态性包括rs6269A>G，rs4633C>T，rs4818C>G三个同义突变位 点和rs4680G>A(Vall58Met)的非同义突变位点组成的不同单倍型对蛋白功能的影响最明 显。因此，检测C0MT基因突变对患者的诊断、治疗具有重要的意义。现有技术的显著缺点 是：不能确定不同的C0MT基因型。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服上述不足，提供一种基于柯丹靶点的C0MT基因突变检测 方法，其解决了对C0MT基因上rs4680突变位点检测，获得C0MT基因在rs4680位点的突变 谱，确定不同的C0MT基因型的问题。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于柯丹靶点的C0MT基因突 变检测方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
[0006] 样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0007] DNA提取，取200μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0008] 1)加200μ1BufferBL，震荡混合，于70°C孵育10分钟；
[0009] 2)加200μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0010] 3) 12000rpm离心 1 分钟；
[0011] 4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
[0012] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1HBsolution，室温放置5分钟；
[0013] 6) 12000rpm离心 2 分钟；
[0014] 7)加入 700μlwashBuffer，12000rpm离心 2 分钟；
[0015] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1washBuffer，12000rpm离心2分 钟；
[0016] 9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min;
[0017] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离心管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 温放置l_2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA;
[0018] PCR扩增
[0019] PCR反应体系：
[0020] 10XPCR Buffer 2μ1；
[0021] HotStarTaq DNA Polymerase按kit标准调整；
[0022] dNTP mix 2μ1 ;
[0023]上游引物PrimerU1μ1 ;
[0024] 下游引物PrimerL1μ1 ;
[0025] DNA模板xμ1 ;
[0026] 灭菌蒸馏水25μ1 上述总体积；
[0027] PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0028] PCR产物纯化
[0029] 每管内加入100μ1PCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min;
[0030]弃收集管内液体，加入700μ1 washing buffer，12000rpm离心2min;
[0031]弃收集管内液体，加入400μ1 washing buffer，12000rpm离心2min;
[0032] 弃收集管内液体，12000rpm离心2min;
[0033] 柱内加入30μ1 70°C预热洗脱液，12000rpm离心3min;
[0034] 测序反应
[0035]反应体系：0· 8μ1 BigDye+1. 5μIBigDye Seq Buffer+3μ1引物+1μ1 PCR纯化 产物+3. 5μldd Η20;
[0036] 测序PCR热循环条件：
[0037]1)变性的条件，96°C lOsec;
[0038] 5)退火的条件，（首先 96°ClOsec，其次 50°C5sec，然后 60°C4min)X25 个循 环；
[0039] 6)延伸的条件，60°C4min;
[0040] 7)4°C保温；
[0041] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
[0042] 测序产物纯化
[0043] 10μ1反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
[0044] 1)每管加入100μ1 100 %酒精，或每管加入1μ1 125mMEDTA到管底，或每管加 入1μ1 3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min;
[0045] 2) 10°C，4000rpm离心 30min，马上倒置，1200rpm离心lmin;
[0046] 3)每管加入100μL70 %酒精，离心15min;5°C，3600rpm离心30min，马上倒置， 1200rpm离心lmin;
[0047] 4)室温挥发净酒精，加入10μLHi-Di Formamide溶解DNA ;
[0048] 5) 95°C变性 5min，4°C保温 4min，加样上机；
[0049] PCR检测，包括：
[0050] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔；
[0051] 在C0MT基因突变位点两端设计一对特异性引物；
[0052] 所述引物C0MT-F的核苷酸序列为：
[0053]5'-CCTACTGTGGCTACTCAGCTG-3'，
[0054] 所述引物C0MT-R的核苷酸序列为：
[0055] 5'-CAGTGAACGTGGTGTGAACAC-3'；
[0056] 所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[0057] 所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10_20ng/μ1，作为检 测阴性对照用；
[0058] 2) 25μ1反应体系检测：
[0059]
[0060] 混合均匀；所有样本混合完后，将ABI Veriti Dx PCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0061] 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0062] 本发明的另一目的在于提供一种基于柯丹靶点的C0MT基因突变检测引物，其特 征在于，所述引物序列包括：
[0063] SEQ IDN0:15'-CCTACTGTGGCTACTCAGCTG-3'
[0064] SEQ ID N0:25,-CAGTGAACGTGGTGTGAACAC-3，。
[0065] 本发明的还一目的在于提供一种包括所述引物的基于柯丹靶点的COMT基因突变 检测试剂盒。
[0066] 本发明的有益效果为：
[0067] 能对多个突变位点进行同时检测，也能对分布于多个外显子的位点进行同时检 测，简单、快速、准确、有效的对强直性肌营养不良两种突变类型进行检测和临床诊断，利用 多种特异性引物同时对患者可能存在的多个突变位点进行检测，使用该方法能保证95% 以上的疾病检出率。解决了对C0MT基因上rs4680两个突变位点检测，获得C0MT基因在 rs4680位点的突变谱，确定不同的C0MT基因型的问题。
【附图说明】
[0068] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申 请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0069] 图1是本发明C0MT致病基因检测分析结果示意图。
【具体实施方式】
[0070] 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0071] 实施例1
[0072] 样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0073]DNA提取，取200μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0074] 1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70°C孵育10分钟；
[0075] 2)加200μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0076] 3) 12000rpm离心 1 分钟；
[0077] 4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
[0078] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1HBsolution，室温放置5分钟；
[0079] 6) 12000rpm离心 2 分钟