LSECtin作为黑色素瘤免疫治疗的靶点的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及LSECtin作为黑色素瘤免疫治疗的祀点。
【背景技术】
[0002] 黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，恶性程度极高，占 皮肤肿瘤死亡病例的极大部分。多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，也见于软脑膜和脉络膜。 其发病率随人种、地域，种族的不同而存有所差异，白种人的发病率远较黑种人高，居住在 澳大利亚昆±兰州的白种人其发病率高达17/10万，我国虽属黑色素瘤的低发区，但近年 来发病率却呈不断上升趋势。
[0003] 目前对于黑色素瘤的治疗手段主要包括；原发病灶的手术切除、放疗、化疗W及免 疫治疗。其中免疫治疗手段是近年来逐步发展起来的治疗黑色素瘤的有效手段。肿瘤免疫 学治疗的目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和 杀伤肿瘤细胞。肿瘤免疫学治疗的方法种类繁多，已与现代生物高科技技术结合，发展成为 继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式一肿瘤生物学治疗方法。肿瘤免疫治疗手 段也包括多种策略；（1)主动免疫；给机体输入具有抗原性的肿瘤疫苗，刺激机体产生特异 性抗肿瘤免疫，W达到治疗肿瘤、预防肿瘤转移和复发的目的；（2)免疫导向疗法；将具有 细胞毒作用的杀伤因子与单克隆抗体偶联制成"生物导弹"，并利用单抗能特异性结合肿瘤 抗原的特性使杀伤因子"导向"集中到肿瘤病灶，杀伤肿瘤细胞；（3)肿瘤过继免疫疗法；将 自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肤等激 活剂进行诱导、激活和扩增，然后转输给肿瘤患者，提高患者抗肿瘤免疫力，W达到治疗和 预防复发的目的；（4)细胞因子疗法：该疗法是近期随着高纯化或重组细胞因子的生产得 W实现。细胞因子疗法的原理是某些细胞因子注射体内后可调节、增强一种或多种免疫细 胞的功能，发挥更强的抗肿瘤免疫功能。目前临床常用的细胞因子有IL-2、TNF-a、IFN-g及 CSF等；（5)肿瘤的基因疗法；其原理是克隆某些可用于肿瘤治疗的目的基因，将目的基因 在体外转染受体细胞，然后回输体内，或直接将目的基因体内注射，使目的基因在体内有效 表达，增强体内抗肿瘤作用或改善肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫力。
[0004] 近年来，肿瘤的主动免疫策略应用较为广泛，美国食品和药品监督管理局（抑A) 2011年批准了CTLA4的抗体（Ipilimumab)用于治疗黑色素瘤患者。CTLA4是T细胞表面 的具有抑制T细胞免疫反应功能的跨膜分子，针对该一祀点的单克隆抗体，能够激活病人 的抗肿瘤免疫反应，从而减缓黑色素瘤的疾病进程。因为CTLA4具有非常重要的生理功能， 导致该一药物在治疗过程中有比较大的毒副作用。
[0005]LSECtin化iverSinusoidalElndothelialCellslectin)是II型跨膜糖蛋白，位 于人类19pl3. 3,是C型凝集素家族的新成员。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供抑制LSECtin活性的物质的应用。
[0007] 本发明提供了抑制LSECtin活性的物质在制备具有如下（a)、（b)、（c)中的至少一 种功能的产品中的应用：
[0008]a)治疗肿瘤或者抑制肿瘤生长；
[0009]b)促进肿瘤患者的抗肿瘤免疫反应；
[0010] C)促进肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y;
[0011] 所述LSECtin为如下（1)或（2);
[0012] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0013] (2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
[0014] 上述应用中，所述抑制LSECtin活性的物质为抗LSECtin抗体或小分子抑制剂。
[0015] 上述应用中，所述抗LSECtin抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述抗LSECtin抗 体具体为多克隆抗体，所述多克隆抗体具体为兔抗鼠LSECtin多克隆抗体。
[0016] 上述应用中，所述广品为药品；
[0017] 所述肿瘤为黑色素瘤。
[0018]LSECtin或其编码基因或含有LSECtin编码基因的重组载体在制备促进肿瘤生长 产品中的应用也是本发明保护的范围；
[0019]所述LSECtin为如下（1)或（2);
[0020] (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0021] (2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。
[0022] 上述应用中，所述LSECtin编码基因的核巧酸序列为序列表中的序列2。
[0023] 上述应用中，所述促进肿瘤生长通过如下1) -3)中至少一种实现：
[0024] 1)抑巧IJ肿瘤特异性T细胞的增殖；
[00巧]2)增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期；
[0026] 3)抑制肿瘤特异性T细胞产生干扰素-Y。
[0027] 上述应用中，所述增长肿瘤特异性T细胞的细胞周期为使肿瘤特异性T细胞细胞 周期的G1期到S期的时间增长；
[0028] 所述使肿瘤特异性T细胞细胞周期的G1期到S期的时间增长体现在抑制CDK2、 CDK4和/或CDK6的表达和/或促进P21的表达。
[0029] 上述应用中，所述产品为药物；
[0030] 所述肿瘤为黑色素瘤。
[0031]LSECtin作为肿瘤免疫治疗的祀点也是本发明保护的范围；
[0032] 或LSECtin作为祀点在筛选、开发和/或设计预防和/或治疗肿瘤产品中的应用； 所述LSECtin的氨基酸序列为序列表中的序列1;
[0033] 上述应用中，所述肿瘤具体为黑色素瘤。
[0034] 本发明通过实验证明；（1)黑色素瘤病人的肿瘤组织表达LSECtin;(2)小鼠黑色 素瘤细胞系B16细胞表达LSECtin;(3)B16细胞表达的LSECtin促进小鼠黑色素瘤的生 长，该一功能依赖于T细胞的存在；（4)B16细胞表达的LSECtin抑制肿瘤特异性T细胞的 增殖和效应功能。因此，本发明证明抑制LSECtin的活性的物质可W用于制备预防和/或 治疗黑色素瘤的药品，而作为肿瘤免疫治疗的祀点；LSECtin在筛选、开发和/或设计预防 和/或治疗黑色素瘤产品。本发明具有较大的社会意义和经济价值。
【附图说明】
[00巧]图1为检测黑色素瘤病人肿瘤组织LSECtin的表达。
[0036] 图2为检测小鼠黑色素瘤细胞系B16细胞LSECtin的表达。
[0037] 图3为判定B16-mock和B16-LSECtin稳定株体外生长结果图。
[0038] 图4为野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞之后的肿瘤生长情况。
[0039] 图5为野生型小鼠免疫B16细胞后注射anti-LSECtin之后的肿瘤生长情况。
[0040] 图6为抗体清除小鼠体内CD4+和CD8+T细胞的结果。
[00川图7为清除小鼠CD4+和CD8+T细胞之后，野生型小鼠免疫B16-mock和B16-LSECtin细胞之后的肿瘤生长情况。
[0042] 图8为LSECtin在体外抑制肿瘤特异性T细胞的增殖。
[0043] 图9为LSECtin在体外劫持肿瘤特异性T细胞的细胞周期。
[0044] 图10为LSECtin在体外抑制肿瘤特异性T细胞的效应功能。
[0045] 图11为LSECtin在体内抑巧IJ肿瘤特异性T细胞的效应功能。
[0046] 图12为LSECtin促进肿瘤特异性CD8+T细胞干扰素-Y的分泌情况。
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]C57化/6小鼠；体重20 + 2克，6-8周，购自华