一种百日咳疫苗制剂及其联合疫苗的制作方法
【专利说明】-种百日咳疫苗制剂及其联合疫苗 -、技术领域
[0001] 本发明设及一种新型百日咳组分疫苗制剂W及含有该制剂的联合疫苗，特别是百 日咳组分中含有脂寡糖成分，W结合物状态存在，用于特定传染病的预防。 二、【背景技术】
[0002] 百日咳是一种由包特氏菌引起的急性呼吸道传染病，典型症状是突然阵发性疫咳 并带有吸气性尾声，有时伴有呕吐，可持续数月，W儿童为主要传染对象，无免疫力的成人 也能被感染。百日咳杆菌W人为唯一天然宿主，虽然有良好的疫苗接种覆盖率，每年仍有 5000万例病例并导致约30万的死亡，90%的病例发生于发展中国家。
[0003] 目前有2种百日咳疫苗，一种为全细胞百日咳疫苗（wP)，一种为无细胞百日咳疫 苗（aP)。全细胞百日咳疫苗从二十世纪四十年代就开始使用，有效的降低了百日咳的发病 率和死亡率，但全细胞百日咳疫苗副反应发生率高，而且症状严重，在英国、日本等多地遭 到抵制。经过数十年的努力，一种更安全的无细胞百日咳疫苗被研制出来，并从二十世纪 九十年代逐步替代全细胞百日咳疫苗，在全球尤其是发达国家广泛使用。无细胞百日咳疫 苗的出现提高了疫苗的大众接受度，从而大幅度提高了免疫覆盖率，将百日咳的发病率降 到历史低位。但近年来，百日咳疾病出现了明显的反弹，即便在疫苗接种覆盖率很高的地 区。如美国加州2010年的百日咳病例超过9000例，创近60年的峰值，而且华盛顿的流行状 况比加州还糟糕。在澳大利亚，自1991年至2011年，新增百日咳病例超100倍。英国2012 年百日咳的死亡率也达到自1984年来的最高值。最近，通过数学模型对澳大利亚、英国、美 国W及视视模型获得数据的分析，推断由全细胞百日咳疫苗改变为无细胞百日咳疫苗与百 日咳的复燃密切相关，尤其在视视模型中证明，无细胞百日咳疫苗虽然可W对疾病感染提 供保护，但不能完全阻止感染和疾病的传播，而且无细胞百日咳疫苗预防感染的效果明显 不如全细胞百日咳疫苗，不能有效阻断病原菌的传播。
[0004] 无细胞百日咳疫苗含1~5个抗原组分，5个抗原成分分别是百日咳毒素（PT)、丝 状血凝素（FHA)、粘附素（PRN)和2种菌毛凝集原（FAGG)，不同的生产商可有不同的处方。 该5种抗原成分都属于蛋白质，诱导产生的抗体不能直接杀灭百日咳杆菌，而且抗体的持 续期也较短。百日咳疾病的复燃需要我们重新去认识百日咳疫苗，审慎选择无细胞百日咳 疫苗组分，其中，添加可诱导杀菌活性的抗原也不失为一种可行的思路。
[0005] 针对细菌最外层多糖抗原的抗体都具有杀菌活性，因此，多糖抗原一般都是细菌 性疫苗研制的目标抗原，如W英膜多糖为目标抗原的肺炎球菌多糖疫苗和结合疫苗、流脑 多糖疫苗和结合疫苗、伤寒Vi多糖疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗等上市疫苗，W脂多 糖（LP巧为目标抗原的志贺氏菌多糖蛋白结合疫苗、副伤寒多糖蛋白结合疫苗、大肠杆菌 结合疫苗等在研疫苗。百日咳杆菌的外围多糖是脂寡糖（LOS)，相对与脂多糖的多糖重复 结构，脂寡糖只有与核屯、多糖相连的末端多糖，因此分子量更小。百日咳杆菌脂寡糖的末端 多糖是一个非重复的=糖结构，分别为a-N-己酷氨基葡萄糖，0 -2-己酷氨基-3-己酷氨 基-2, 3-双脱氧-甘露糖醒酸和0 -2-己酷氨基-4-甲氨基-海藻糖，在电泳图谱中，百日 咳杆菌脂寡糖通常显示有2个条带，迁移慢的是完整的脂寡糖，含有类脂A、核屯、多糖和末 端S糖，迁移快的仅含有类脂A和核屯、多糖，百日咳杆菌脂寡糖的示意图如下。早期的试验 已证明针对百日咳脂寡糖的抗体具有补体介导的杀菌活性，而缺乏脂寡糖的无细胞百日咳 疫苗不能诱导补体介导的杀菌活性。
[0006] 早在2005年，TomaszNie化iela等就W百日咳杆菌脂寡糖为目标抗原研究了其 免疫原性。由于脂寡糖的内毒素活性，在制备结合物前采用了酸水解，使脂寡糖核屯、多糖的 糖巧键断裂，制备出含末端S糖的五糖结构（如下），利用水解端的醒基，通过还原氨法与 载体蛋白质破伤风类毒素共价结合获得结合物。百日咳脂寡糖结合物免疫家兔后，可诱导 与脂寡糖反应的IgG，产生免疫反应的主要位点是末端=糖。
[0007]
[000引百日咳脂寡糖水解后的五糖结构
[0009] 在无细胞百日咳疫苗各组分中，最核屯、的是百日咳毒素，仅含百日咳毒素的无细 胞百日咳疫苗在瑞典临床试验中表现出良好的有效性，而丹麦注册使用的无细胞百日咳疫 苗也只含有百日咳毒素一个组分，10多年的疫苗使用基本控制了百日咳疫情。其他的无细 胞百日咳疫苗组分虽被认为可提高百日咳疫苗的保护率，但直接证据并不充分。因此，我 们认为一个含有百日咳毒素和脂寡糖的无细胞百日咳疫苗不仅可W消除百日咳的疾病症 状，减少疾病传播，还可W通过补体介导的杀菌活性，彻底杀灭菌体，从根本上消灭传染源， 对疾病防控起到良好的效果。该种含有百日咳毒素和脂寡糖的新型百日咳组分疫苗在小鼠 体内可诱导针对2种抗原的免疫应答，2种抗原免疫免疫干扰现象存在。
[0010] 目前的百日咳疫苗都是与破伤风和白喉联合，W全细胞百白破疫苗或无细胞百白 破疫苗等联合疫苗形式进行免疫接种。研制的新型百日咳组分疫苗也可与破伤风和白喉组 分联合成为新的联合疫苗。小鼠的免疫学试验证明，该种新型联合疫苗各组分都能诱导产 生相应的免疫应答。百白破疫苗使用于2月龄~6月龄的儿童，需要免疫多针，与其他儿童 疫苗联合使用，可W充分发挥联合疫苗的优势，节约政府和家庭资源，提高疫苗接种的依从 性，降低副反应的发生率，减少儿童痛苦。W百白破疫苗为核屯、开发的联合疫苗制剂已有多 种上市，包括百白破-Hib联合疫苗、百白破-己肝联合疫苗、百白破-己肝-Hib联合疫苗、 百白破-IPV-H化联合疫苗、百白破-己肝-IPV-H化联合疫苗等，还有将流脑结合疫苗及肺 炎球菌结合疫苗与百白破疫苗联合的研究报道。含本发明新型百日咳组分的百白破疫苗也 可与上述各疫苗组分联合成为预防多种疾病的联合疫苗。 H、
【发明内容】
[0011] 本发明提供一种新型百日咳组分疫苗，含有百日咳毒素和脂寡糖组分，所述百日 咳毒素组分可经化学脱毒或基因工程脱毒；所述脂寡糖组分可由细菌培养物纯化或化学合 成获得，其中纯化获得的脂寡糖经水解去除内毒素活性，化学合成的脂寡糖主要包含有末 端=糖结构，将无内毒素活性的脂寡糖与载体蛋白质偶联制备成具有免疫原性的结合物， 即为脂寡糖组分。百日咳毒素组分的化学脱毒可使用甲醒、戊二醒、或二者同时使用，也可 使用过氧化氨脱毒。脂寡糖组分与载体蛋白质偶联的技术为目前多糖蛋白质结合物制备通 用技术，为本行业专业人员都熟知的常规技术，可利用寡糖上的醒基、駿基或氨基等与载体 蛋白质直接相连，也可通过桥联剂与载体蛋白质相连接，所述桥联剂包括但不限定为了二 酷二阱（SDH)、己二酷二阱（ADH)、3-(2-化晚二琉基）丙酸N-哲基班巧酷亚胺醋（SPD巧 等，所述载体蛋白质包括但不限定为破伤风类毒素（TT)、白喉类毒素值T)、突变白喉毒素 中的交叉反应物质（CRM9，CRM197)、百日咳类毒素（PT)、B群流脑外膜蛋白质复合物（OMP)、 流脑64K外膜蛋白、流感嗜血杆菌P1、P2、P4、P5、P6外膜蛋白、重组铜绿假单胞菌外毒素 AbEPA)、大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素B亚单位中的任何一种或数种。
[001引本发明新型百日咳组分疫苗中，百日咳毒素含量为1-50yg;优选百日咳毒素含 量为5-40yg;更优选百日咳毒素含量为15-30yg;最优选百日咳毒素含量为25yg。本发 明新型百日咳组分疫苗中，脂寡糖含量为1-50yg;优选脂寡糖含量为2-30yg;更优选脂 寡糖含量为5-20yg;最优选脂寡糖含量为10yg。
[0013] 本发明的新型百日咳组分疫苗可包含佐剂和/或缓冲液，所述的佐剂选自侣佐 剂，如氨氧化侣、磯酸侣、硫酸侣等。水包油或细菌细胞壁成份，如MF59、SAE、RAS等。或者 皂角类佐剂，如如ilA、QS-21。或者细菌脂多糖或合成类脂A佐剂。细胞因子，如白细胞介 素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、共刺激分子B7-UB7-2等。或者毒素亚单位类佐 剂，如霍乱毒素及亚单位、百日咳毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素（LT)等。所述的缓冲液选自 磯酸缓冲液或Tris缓冲液，也可W是生理氯化钢溶液。缓冲液浓度可W是0. 01 - 0. 05M， 优选 0. 01 - 0. 02M，最优选 0. 01M。
[0014] 本发明的新型百日咳组分疫苗还可包含稳定剂和/或分散剂，稳定剂选自氨基 酸，氨基酸可W是组氨酸，优选k组氨酸，使用浓度1-lOOmM，优选2-50mM，更优选3-lOmM， 最优选5mM。组氨酸可W组氨酸缓冲液的形式出现。分散剂选自多聚山梨醇醋，优选Tween 80,使用浓度 0. 01-1 %，更优选 0. 01-0. 1 %，最优选 0. 02-0. 05%。
[0015] 本发明的新型百日咳组分疫苗可W制成供临床用的各种制剂形式，所述的制剂选 自液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型、片剂、丸剂中的一种，优选剂型是液体剂型、冻干剂型、胶 囊剂型，更优选液体剂型和冻干剂型，最优选液体剂型。
[0016] 本发明的新型百日咳组分疫苗，其接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、 口服，还包括口腔、鼻腔、肛n、阴道黏膜途径。
[0017] 本发明新型百日咳组分疫苗可与破伤风类毒素、白喉类毒素联合，制备为新型无 细胞百白破疫苗。W新型无细胞百白破疫苗免疫小鼠后，能产生针对各组分的特异性抗体， 与各组分分别免疫的小鼠抗体滴度相比，新型无细胞百白破疫苗各组分间未发现免疫干扰 现象。
[0018]W下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：
[0019] 新型无细胞百白破疫苗小鼠免疫力实验
[0020] 选用NIH小鼠，分为5组。组1;新型无细胞百白破疫苗免疫组；组2;百日咳毒素 免疫组；组3 ;脂寡糖结合物免疫组（W破伤风类毒素为载体蛋白质）；组4 ;破伤风类毒素 免疫组；组5 ;白喉类毒素免疫组。每组10只小鼠，皮下免疫S针，每针间隔2周，第S针免 疫后2周取血，进行血清特异性抗体测定。另取10只阴性小鼠，采血测定特异性抗体水平， 作为滴度cutoff值计算标准。小鼠每针免疫剂量0. 1ml，分别含百日咳毒素5yg、脂寡糖 结合物2yg、破伤风类毒素0.化f、白喉类毒素化f，W氨氧化侣为佐剂。
[002U 血清测定采用间接化ISA,W相应的抗原包被酶标板（脂寡糖抗体测定W牛血清 白蛋白为载体的脂寡糖结合物为包被抗原）。测定结果见表1。
[0022] 表1.新型无细胞百白破疫苗免疫原性研究
[0023]
[0024] 本发明制备的新型无细胞百白破疫苗还可W与其他疫苗制备联合疫苗，如己肝疫 苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗化ib)、注射脊髓