专利名称：一种无细胞百日咳疫苗的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗生产菌株研发领域，具体涉及一种无细胞百日咳疫苗的生产方法。
背景技术：
百日咳是由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病。其临床特征为阵发性痉挛性咳嗽伴有深长的“鸡鸣”样吸气性吼声。百日咳杆菌，Bordetella pertussis，其主要侵犯的对象是孩童，有一半的个案是一岁以下的婴儿。百日咳杆菌的致病因子主要是百日咳毒素，pertussis toxin, PT,是由五个不同亚基sl-s5 (编码基因为ptxA, ptxB, ptxD, ptxE, ptxC组成的蛋白复合物,其毒性来自于si 亚基的ADP-核糖转移酶的活性。已采用的无细胞百日咳疫苗中，除PT外，还包含其他抗原分子如丝状血凝素，filamentous hemagglutinin, FHA,和百日咳粘着素，pertactin, Prn,而现有的无细胞百日咳疫苗生产工艺中，采用野生型百日咳杆菌菌株对抗原组分FHA，Pt，Prn进行发酵生产，FHA的纯化过程中Pt的含量高于规定的指标，往往使用一系列的化学试剂如甲醛对抗原FHA进行Pt脱毒处理。然而,这样的脱毒方法有如下的不利因素I.毒性逆转；2.在脱毒处理过程中的剧烈条件下降低FHA的免疫原性和得率；3.大量实验来评价每一批制剂中Pt毒性回复的程度，非常耗时；4.脱毒处理过程接触到有毒试剂，对于实验人员存在危险。此外，采用野生型百日咳杆菌菌株对抗原组分Prn进行发酵生产，其表达水平过低。因此，现有技术的针对无细胞百日咳疫苗中组分FHA，Pt，Prn采用野生型百日咳杆菌菌株进行发酵生产，无法做到使得每一个抗原的表达量在已掌握的技术能力下达到最优水平，会造成发酵工艺优化的瓶颈；此外，FHA，Pt和Prn同时在同一野生型百日咳杆菌菌株菌种中表达在纯化过程中会造成相互干扰，这些不利因素无疑增加了生产的人力，物力以及生产时间上的延长。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分别使用单独的百日咳杆菌基因工程改造菌株无细胞百日咳疫苗的生产方法。本发明的技术方案概述如下一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是包括如下步骤(I)将pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分fha ；(2)将fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分Pt ；(3)将fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分prn ；(4)将所述抗原组分fha、pt和prn配制成一种无细胞百日咳疫苗。
所述pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株是通过下述方法获得的(I)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的pertussis toxin编码基因(NCBI Reference Sequence :NC002929. 23987858-3992567)，所述 pertussis toxin 用 Pt 表不；(2)选择步骤(I)中得到的Pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株。所述fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株是用下述方法获得的(I)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的fha 编码基因(NCBI Reference Sequence:NC002929. 21968781-1979553)；(2)选择步骤(I)中得到的敲除fha编码基因的百日咳杆菌菌株antIK A fha ；(3)将野生型百日咳杆菌基因组中的PT编码基因(NCBI Reference Sequence:NC 002929. 23987858-3992567)进行克隆并与第二种抗生素抗性基因连接成基因盒cassette pt-antll ；(4)通过同源重组用所述的基因盒cassette :pt_antll替换步骤(2)得到的百日咳杆菌菌株antIK A fha中基因组上的anti抗生素抗性基因；(5)选择步骤(4)中得到的fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株。所述fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株是用下述方法获得的(I)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的fha编码基因；(2)选择步骤(I)中得到的敲除fha编码基因的百日咳杆菌菌株antIk A fha ；(3)将野生型百日咳杆菌基因组中的PRN的编码基因(NCBI Reference Sequence:NC_002929. 21098091-1100823)进行克隆并与第二种抗生素抗性基因连接成基因盒cassette prn-antll ；(4)通过同源重组用所述的基因盒cassette prn-antll替换步骤(2)得到的antIE A fha百日咳杆菌菌株中基因组上的anti抗生素抗性基因；(5)选择步骤(4)中得到的fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株。所述fha、pt 和 prn 的质量比为 2. 5-20:5-20:2-5。所述第一种抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、庆大霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。所述第一种抗生素抗性基因和第二种抗生素抗性基因不同，各自选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因。所述野生型百日咳杆菌为百日咳杆菌Tohoma I菌株(ATCC，BAA-589 )或Bordetella pertussis Cs百日咳杆菌Cs菌株(中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号CMCC58003。anti表示为第一种抗生素抗性基因；antll表示为第二种抗生素抗性基因；卡那霉素抗性基因(pCfffi 2. IVector, Invitrogen)、四环素抗性基因(GenBank:AY532632. ICloning vector pLAFR)、氯霉素抗性基因(GenBank:AY952933. !Cloning vector pHTSUB-106)。
本发明的优点本发明的方法在百日咳杆菌内进行特定抗原基因的敲除或拷贝数的增加，或基因启动子的替换，从而构建出用于特定抗原生产的百日咳杆菌基因工程菌株，一方面使用单独的百日咳杆菌基因工程菌株，有利其单个目的抗原表达的发酵工艺优化，实现单个目的抗原的高效表达，在Prn和Pt百日咳杆菌基因工程菌株基因组DNA上的fha基因的敲除，Prn和Pt百日咳杆菌基因工程菌株生长速度明显加快，使得发酵周期从48 52h缩短为36 40h ;另一方面FHA百日咳杆菌工程菌株实现Pt基因敲除后，克服了现有技术存在的FHA生产过程中需要pt脱毒处理的工艺步骤，从而避免了 Pt脱毒工艺中的弊端，有利于保持抗原FHA的免疫原性和提高了 FHA的抗原得率，降低了生产时间和生产成本。本发明提供的prn的百日咳杆菌基因工程菌株，其prn基因在fha启动子的作用下，其表达水平提高了 5倍以上，提高了抗原组分Prn的得率，简化了生产工艺和降低了生产成本。
图I为不同百日咳菌株的生长曲线。图2为来自野生型百日咳菌株制备的Fha样品的SDS-PAGE图谱。图3为来自野生型百日咳菌株制备的Fha样品的层析图谱。图4为来自Pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株制备的Fha样品的SDS-PAGE 图谱。图5为来自pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株制备的Fha样品的层析图谱。图6来自fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株和来自fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株制备的Pt和Prn的SDS-PAGE图谱。
具体实施例方式本发明涉及的野生型百日咳菌株来源Bordetella pertussis Tohoma I百日咳杆菌 Tohoma I 菌株(ATCC, BAA-589 ) > Bordetella pertussis Cs 百日咳杆菌 Cs 菌株(中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号CMCC58003。文献微生物学报5 (4) 4111957)下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的说明是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。 实施例中的方法若无特殊说明均为常规方法。实施例Ipt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株是通过下述方法获得的(I) pBS-ptx_up-KANA-ptx_down (SEQ ID. No. I)线性 DNA 的获得利用质粒pBSptx_up_KANAptx_down上的单酶切位点ScaI酶切后得到线性DNA进行电转化。(2)电转化和同源重组2ug以上的线性DNA在1500V/lmm的电压强度下电转200ul百日咳杆菌CS菌株感受态细胞(制备方法见参考文献I)涂布于含有25ug/ml卡那霉素的抗性平板上进行抗性筛选，含有25ug/ml卡那霉素的培养平板上生长出的菌落进行筛选Pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株。卡那霉素抗性基因也可以替换为四环素抗性基因或氯霉素抗性基因。实施例2fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株是用下述方法获得的(I) pBS-fha_up-TET-ptx_down(SEQ ID. No. 2)质粒线性 DNA 的获得利用质粒pBS-fha_up-TET_ptx_down上的单酶切位点ScaI酶切后得到线性DNA进行电转化。(2)电转化和同源重组2ug以上的线性DNA在1500V/lmm的电压强度下电转200ul百日咳杆菌CS菌株感受态细胞(制备方法见参考文献I)涂布于含有lOug/ml四环素的抗性平板上进行抗性筛 选，含有lOug/ml四环素的培养平板上生长出的菌落进行筛选fha基因敲除四环素抗性的TetK&AFHA。百日咳杆菌菌株。四环素抗性基因也可以替换为卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。(3) pBS-fha_up-Pt-KANA-ptx_down(SEQ ID. No. 3)线性 DNA 的获得利用质粒pBS-ptx_up-KANA_ptx_down上的酶切位点DraI酶切后得到线性DNA进行电转化。(4)电转化和同源重组2ug以上的线性DNA在1500V/lmm的电压强度下电转200ul TetK A FHA百日咳杆菌感受态细胞(制备方法见参考文献I)涂布于含有25ug/ml卡那霉素的抗性平板上进行抗性筛选，含有25ug/ml卡那霉素的培养平板上生长出的菌落进行筛选fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株。卡那霉素抗性基因也可以替换为四环素抗性基因或氯霉素抗性基因。实施例3fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株是用下述方法获得的(I) pBS-fha_up-TET-ptx_down(SEQ ID. No. 2)质粒线性 DNA 的获得利用质粒pBS-fha_up-TET_ptx_down上的单酶切位点ScaI酶切后得到线性DNA进行电转化。(2)电转化和同源重组2ug以上的线性DNA在1500V/lmm的电压强度下电转200ul百日咳杆菌CS菌株感受态细胞(制备方法见参考文献I)涂布于含有lOug/ml四环素的抗性平板上进行抗性筛选，含有lOug/ml四环素的培养平板上生长出的菌落进行筛选fha基因敲除四环素抗性的TetK&AFHA。百日咳杆菌菌株。四环素抗性基因也可以替换为卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。(3) pBS-fha_up-Prn-KANA-ptx_down (SEQ ID. No. 4)线性 DNA 的获得利用质粒pBS-fha_up-Prn_KANA-ptx_down上的酶切位点DraI酶切后得到线性DNA进行电转化。(4)电转化和同源重组2ug以上的线性DNA在1500V/lmm的电压强度下电转200ul TetK A FHA百日咳杆菌感受态细胞(制备方法见参考文献I)涂布于含有25ug/ml卡那霉素的抗性平板上进行抗性筛选，含有25ug/ml卡那霉素的培养平板上生长出的菌落进行筛选fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株。卡那霉素抗性基因也可以替换为四环素抗性基因或氯霉素抗性基因。实施例4、pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株、fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株、fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株与野生型百日咳菌株发酵及生长曲线比较取上述三种工程菌和一种野生型百日咳菌株按下述方法分别发酵初级培养取一管冻存的菌种，取出200ul加入到百日咳培养基平皿中，均匀涂布，36±2° C，250rpm摇床中培养24个小时后，OD长到I. 5-2. 0，接种到发酵罐中进行培养。二级培养在2L发酵罐(含有IL百日咳杆菌培养基)，为1:100接种IOOmL时 OD为I. 5-2. 0的菌液，培养温度为36±2° C，pH通过自动加入I. 25M磷酸水溶液维持在
7.2±0. I，溶解氧控制在30%，偶联搅拌速度200-600rpm，空气流量为500_100L/h，通过加入道康宁1520消泡剂维持泡位。培养24小时后，待OD长至3. 5-4. 0，开始以，4ml/h的速度流加补料，再培养24个小时，待OD不在长高时，收获培养物。图I中的各百日咳菌株的生长曲线比较可以看，相对于野生型百日咳菌株，fha基因敲除的Prn生产菌株和Pt生产菌株其生长速度明显加快，缩短了 Prn和Pt生产的发酵时长和有利于发酵条件的控制，同时也增加了 Prn和Pt的总的蛋白产量。实施例5、FHA的制备和纯化野生型百日咳杆菌菌株培养物上清和PT基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株培养物上清分别采用下述方法进行fha的分离纯化。IL培养物上清加入250g硫酸铵沉淀，I IOOOg离心30min弃上清，沉淀加入50ml (50mMPB, IM NaCl, pH=8. 0)水溶液复溶，复溶后的样品利用孔径50kd超滤膜包超滤换液至含有50ml 50mM PB，2M尿素，pH=8. 0的水溶液中；后者调pH至6. 0过CM SFF层析柱，CM柱采用含50mM PB, 2M尿素，pH=6. 0溶液平衡上样，用含有50mM PB, 2M尿素，pH=7. 4水溶液预洗杂蛋白，用含有50mM PB,300mM NaC12M尿素，pH=7. 4的水溶液洗脱目的蛋白，洗脱的目的产物透析至PBS溶液中，进行SDS-PAGE检测。图2和图3表明，层析图谱和SDS-PAGE显示纯化后的洗脱的野生型百日咳菌株制备的Fha样品中明显的Pt的存在；(图2中I. CP-2L-100 (WT) 25%沉淀复溶液2. Cp CM上柱样 3.流穿 4. Elute PT5. Elute FHA6. 30-200Protein Marker)图4和图5中(泳道9)，可以发现层析图谱和SDS-PAGE图谱表明pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株明显没有Pt的存在，说明pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株制备的Fha消除了后续的Pt脱毒处理过程，同时也在一定程度上保持了 Fha的得率和免疫原性。(图4中1. I. 30-200Marker2.超滤前复溶液3.上柱样4.流穿(前部分)5.流穿(后边部分)6. elute FHA8. 16-94maker9. elute (野生型纯化时该位置峰为PT，但敲除PT的菌株此位置为杂蛋白)10. PT纯化标准品。)实施例6、Pt的制备和纯化Pt来自于fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株培养物分泌上清。IL培养物上清用300g硫酸铵沉淀后，I IOOOg离心30min弃上清，沉淀加入50ml (50mMPB, IM NaCl，pH=8. 0)水溶液复溶，复溶后的样品利用孔径30kd超滤膜包超滤换液至含有50ml 30mM PB, 2M尿素，pH8. 0的水溶液中；后者过CM SFF层析柱。CM层析柱采用含有30mM PB，2M尿素，pH6. 0的水溶液平衡上样，用含有30mM PB，2M尿素，70mM NaCl,PH7. 4的水溶液洗脱目的蛋白；将洗脱峰样品用2M尿素稀释三倍调pH至7. 4过羟基磷灰石层析(CHT)柱，CHT层析柱采用含IOmM磷酸钾缓冲液，IOmM NaCl，2M尿素，pH7. 4的缓冲液平衡上样，30mM磷酸钾缓冲液，pH7.4溶液预洗杂蛋白，含有75mM磷酸钾缓冲液，225mMNaCl,pH7. 4的溶液洗脱目的蛋白；透析至PBS溶液中，然后SDS-PAGE检测、Lowry法进行蛋白定量。 图6中可以看出，来自fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株制备的Pt样品中，没有了 Fha蛋白的存在和干扰，同时Pt的蛋白含量同时增加了，为后续的产品制剂的工艺的开展和最后成品疫苗的制备节省了成本(图6中1. 16-94kd Marker2. 139 (PT A FHA)3. 140 (PT A FHA)4. 141 (PT A FHA)5. 143 (PT A FHA)6. 144 (PT A FHA)7. 145 (PT A FHA)
8.PT 标准品 9. Prn (Pfha-prn A fha) 10FHA (FHA A PT)注A表示敲除 11. Marker 实施例7、Prn的制备和纯化Prn来自于fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株培养物分泌上清。IL培养物上清经350g硫酸铵沉淀，11000g，30min离心后，沉淀用50ml 50mMTris-HCl, pH=8. 0复溶后，再加入12. 5g硫酸铵沉淀，IlOOOg, 30min离心后的沉淀经50ml50mMTris-HCl, IM NaCl，pH=8. 0 溶液复溶，30kd超滤膜包超滤换液至 50ml 50mM Tris-HCl,pH=8. 5 中，过 Fractogel EMD TMAE 层析柱，TMAE 层析柱采用 50mM Tris-HCl, pH=8. 5 溶液平衡上样，50mM Tris-HCl, 120mM NaCl，pH=8. 5溶液洗脱目的蛋白；洗脱峰中蛋白样品用30kd超滤膜包超滤至5mM PB, pH=8. 0中，过轻基磷灰石层析柱,轻基磷灰石层析柱采用5mMPB，pH=8. 0平衡上样，取流穿下来的蛋白透析换液至PBS中，SDS-PAGE检测、Lowry法进行蛋白定量。图6中可以看出，来自fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株制备的Prn样品中，没有了 Fha蛋白的存在和干扰，同时PRN的蛋白含量同时也增加了。实施例8、无细胞三组分百日咳疫苗配制将发酵及纯化所制备的抗原组分按照表I各种组分进行疫苗配置，可以制备出适于婴幼儿及成人所使用的疫苗。表I无细胞三组分百日咳疫苗配制
组分介. (Ug)FM (实施例5 FIX实施例6制I (实施例7
__制备纯化) 备纯化)_备纯化)
HdZi I__20_ 20I 3
KJj 2 S 103
gdi/3__2^5_ 5[ 2上述配制的疫苗还可以加入其他抗原成分，例如白喉类毒素，破伤风类毒素已经b型嗜血流感结合疫苗，用于婴幼儿或者成人的免疫接种。参考文献
I. Zealey GR, Loosmore SM，Yacoob RK, Cockle SA, Boux LJ, Miller LD, KleinMH. Gene replacement in Bordetella pertussis by transformation with linear DNA.Biotechnology(N Y). 1990Nov :8(11) :1025_9。 ·
权利要求
1.一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是包括如下步骤 (1)将Pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分fha； (2)将fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分Pt； (3)将fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分prn； (4)将所述抗原组分fha、pt和prn配制成一种无细胞百日咳疫苗。
2.根据权利要求I所述的一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是所述Pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株是通过下述方法获得的 (1)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的pertussis toxin 编石马基因，所述 pertussis toxin 用 Pt 表不； (2)选择步骤(I)中得到的Pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株。
3.根据权利要求I所述的一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是所述fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株是用下述方法获得的 (1)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的fha编码基因； (2)选择步骤(I)中得到的敲除fha编码基因的百日咳杆菌菌株antIKA fha ； (3)将野生型百日咳杆菌基因组中的PT编码基因进行克隆并与第二种抗生素抗性基因连接成基因盒cassette :pt_antll ； (4)通过同源重组用所述的基因盒cassette:pt_antll替换步骤(2)得到的百日咳杆菌菌株antIk A fha中基因组上的anti抗生素抗性基因； (5)选择步骤(4)中得到的fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株。
4.根据权利要求I所述的一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是所述fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株是用下述方法获得的 (1)通过同源重组用第一种抗生素抗性基因替换野生型百日咳杆菌基因组上的fha编码基因； (2)选择步骤(I)中得到的敲除fha编码基因的百日咳杆菌菌株antIKA fha ； (3)将野生型百日咳杆菌基因组中的PRN的编码基因进行克隆并与第二种抗生素抗性基因连接成基因盒cassette :prn_antll ； (4)通过同源重组用所述的基因盒cassette:prn_antll替换步骤(2)得到的antIE A fha百日咳杆菌菌株中基因组上的anti抗生素抗性基因； (5)选择步骤(4)中得到的fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株。
5.根据权利要求I所述的一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是所述fha、pt和prn 的质量比为 2. 5-20:5-20:2-5。
6.根据权利要求2所述的一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是所述第一种抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、庆大霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。
7.根据权利要求3或4所述的一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是所述第一种抗生素抗性基因和第二种抗生素抗性基因不同，各自选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因。
8.根据权利要求2、3或4所述的一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，其特征是所述野生 型百日咳杆菌为ATCC, BAA-589 或CMCC58003。
全文摘要
本发明公开了一种无细胞百日咳疫苗的生产方法，包括如下步骤将pt基因敲除的Fha百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分fha；将fha基因敲除的Pt百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分pt；将fha基因敲除的Prn百日咳杆菌基因工程菌株发酵纯化得到抗原组分prn；将所述抗原组分fha、pt和prn配制成一种无细胞百日咳疫苗。本发明的方法实现单个目的抗原的高效表达，使百日咳杆菌基因工程菌株生长速度明显加快；降低了生产时间和生产成本。
文档编号C12N15/09GK102793915SQ20121025991
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者朱涛, 段磊, 宇学锋, 邵忠琦, 毛慧华, 邱东旭 申请人:天津康希诺生物技术有限公司