专利名称：人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白表达系统，尤其涉及一种人血清白蛋白与白介素I受体拮抗剂融合蛋白的表达系统。
背景技术：
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近些年来一个较为成功的外源蛋白真核表达系统，与大肠杆菌表达系统相比，它能更好地表达结构复杂的蛋白质，并且能够完成如二硫键形成这样的翻译后修饰。与哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统相比，它具有操作简单、表达量高、容易产业化放大等优势。白介素 I 受体拮抗剂(Interleukin I receptor antagonist, ILlra),是一种可与ILl受体结合的蛋白，当其与ILl受体结合后可阻断ILl的生物学活性。因此一定浓度的 ILlra能使这两个细胞因子在生理学和病理生理学以及炎症反应中的生物学活性被中和。2001年11月14日美国FDA正式公布批准美国Amgen公司生产的商品名为Kineret的重组(rh-) ILlra用于治疗类风湿性关节炎，批准适应症为“ 18岁以上的中度和严重的类风湿性关节炎患者，在使用一种或多种改善疾病的抗风湿药物后失效时，明显减轻病人的体征和症状”。由于ILlra分子量只有17kDa，易被肾小球滤过，因而在临床治疗时，血药半衰期较短，一般需要大剂量频繁用药，如100mg/day。为了提高重组ILlra在体内的血药时间，中国专利200810060568. 7利用基因工程手段将其与HSA融合后插入毕赤酵母中并表达，经融合后的蛋白(IGH)在小鼠体内血药半衰期显著提高，但该融合蛋白基因在毕赤酵母中为单拷贝，蛋白表达量不够高。
发明内容
本发明提供了一种人血清白蛋白与白介素I受体拮抗剂融合蛋白的表达系统，以解决现有表达系统融合蛋白表达量不闻的问题。一种人血清白蛋白与白介素I受体拮抗剂融合蛋白的表达系统，包括宿主细胞和转化入宿主细胞的表达载体，所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插入有二硫键异构酶基因的第二表达载体，所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素I受体拮抗剂基因，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。二硫键异构酶(PDI)是硫氧化还原酶家族中的一种，主要功能是在内质网上催化新合成的蛋白形成正确的二硫键。在毕赤酵母的内质网上有一套严格的质量控制体系，只有形成正确结构的蛋白才能从内质网分泌到高尔基体当中。如果蛋白没有形成正确的结构，则会被降解或积聚在内质网上，最终降低该蛋白的表达。IGH融合蛋白中含有18对_■硫键，更多的PDI可以帮助融合蛋白形成正确的二硫键，以提高表达量。在第一表达载体中包含IGH融合蛋白基因为目的基因，它插入在启动子的下游，在第二表达载体中包含二硫键异构酶基因为目的基因，它同样插入在启动子的下游。
在第一表达载体中，人血清白蛋白基因和白介素I受体拮抗剂基因可以直接连接，也可以通过连接肽序列连接，所述连接肽序列是指编码连接肽的DNA序列，连接肽用于连接人血清白蛋白和白介素I受体拮抗剂。该连接肽的氨基酸残基序列可以由甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸中的一种或多种连接组成，具体可以为[GGGS]n，n为不大于4的自然数。在融合蛋白基因中，人血清白蛋白基因和白介素I受体拮抗剂基因两者之间的相对位置是任意的。所述融合蛋白基因还包括限制性酶切位点，使得酶切后可以产生粘性末端，便于基因序列的连接。关于融合蛋白的基因结构可以参考中国专利200810060568. 7公开的内容。所述第一表达载体和第二表达载体为真核表达载体，优选的，所述第一表达载体包含信号肽，所述第二表达载体不包含信号肽，如此融合蛋白可以分泌到胞外，而PDI可以存留在胞内，便于融合蛋白的分离纯化。更优选的，所述第一表达载体和第二表达载体的原始载体优选为PPIC系列载体，其中第一表达载体的原始载体优选为pPICZ α B，第二表达载体的原始载体优选为PPIC3. 5Κ。在本发明中第一表达载体可以为单拷贝，但为了提高表达量，最好选用为多拷贝，拷贝数至少为2个，优选为3 4个。 本发明还提供所述表达系统的构建方法，包括(a)用限制性内切酶将融合蛋白基因(IGH基因)从pPIC9_IGH上切下并回收；(b)将步骤(a)中得到的IGH基因插入到pPICZ α B相应的酶切位点中；(c)将步骤(b)中得到的pPICZ a B-IGH线性化后电转到表达宿主GSl 15中，转化了的细胞在含有Zeocin的平板上筛选单克隆；(d)鉴定步骤(C)中得到的单克隆菌株表达量及IGH基因拷贝数。(e)将二硫键异构酶(PDI 基因)插入 pPIC3. 5K，得到 pPIC3. 5K-PDI ；(f)将步骤(e)中得到的pPIC3. 5K-PDI载体用BspE I线性化后电转化步骤(d)得到的含有pPICZ a B-IGH的GSl 15菌株，转化后的细胞先涂布到RDB平皿，然后在含有O. 5或I. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选转化子；(g)将步骤(f)中挑选到的转化子在摇瓶条件下表达IGH蛋白，培养基上清用SDS-PAGE分析表达量。步骤(a)中，IGH基因即为本发明所述的融合蛋白基因，其碱基序列如SEQ IDNO. I所示，质粒PPIC9-IGH结构及其构建方法已在中国专利200810060568. 7中公开，切下的IGH基因上游序列含有Xho I酶切位点，下游含有Not I酶切位点。步骤(b)中，空质粒pPICZ α B首先用Xho I和Not I酶切，然后与IGH基因连接，得到pPICZ a B-IGH质粒。步骤(c)中，pPICZ a B-IGH质粒用Pme I线性化后电转化GS 115表达宿主，转化后的细胞涂布于含有100，700或1500μ g/mLZeocin的平板上筛选单克隆菌株。步骤(d)中，将步骤(C)中挑选的克隆在摇瓶条件下表达IGH蛋白，培养基上清用SDS-PAGE分析表达量，挑选的克隆中IGH基因的拷贝数用RT-PCR鉴定，可参考Norden等(Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporinsin Pichia pastoris, BMC biotechnology, 2011)公开的方法。步骤(e)中，PDI基因的碱基序列可以如SEQ ID NO. 2所示。
毕赤酵母GS 115、质粒 pPICZ α B 为商业化产品(Invitrogen Corp. San Diego.California. USA)。与现有技术相比较，本发明具有的有益效果为(I)毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，因此，高分泌的外源蛋白易从培养基中分离；另外与酿酒酵母相比，赤酵母不产生过度的糖基化，所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。(2)本发明构建PDI与IGH共表达的宿主，使得IGH的表达量显著提高，由于HH在胞内表达，而IGH分泌表达到胞外，所以收集的培养基上清中IGH浓度增加的同时不会新产生其他蛋白。
图I为重组质粒pPICZ a B-IGH的构建示意图。
图2为IGH融合蛋白在不同Zeocin浓度下挑选得到的克隆菌株的PAGE分析。a为SDS-PAGE电泳图，其中L1-L5为100 μ g/mLZeocin的平板上筛选单克隆菌株，H1-H4为700 μ g/mLZeocin的平板上筛选单克隆菌株；b为所对应的菌株用蛋白定量软件QuantityOne定量然后计算出单位菌体表达量比较(方差来自三个平行)。图3为重组质粒pPIC3. 5K-PDI的示意图。图4 为导入了 PDI 或 BiP (immunoglobulin binding protein)基因的多拷贝 IGH宿主表达上清SDS-PAGE分析图。a为SDS-PAGE电泳图，其中I为IGH单拷贝菌株，2为步骤(c)得到的多IGH拷贝菌株，3为0. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了 PDI的多IGH拷贝单克隆菌株，4，5为I. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了 PDI的多IGH拷贝单克隆菌株，6为0. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了 BiP的多IGH拷贝单克隆菌株，7，8为I. 5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了 BiP的多IGH拷贝单克隆菌株。b为所对应的菌株用Biorad公司的蛋白定量软件Quantity One定量然后计算出单位菌体表达量比较(方差来自三个平行)。图5为Real Time PCR鉴定PDI是否被诱导结果图。图6为Real Time PCR鉴定BiP是否被诱导结果图。
具体实施例方式实施例I构建质粒pPIC9-IGH，并获得可表达IGH蛋白的DNA序列使用专利申请号200810060568. 7公开的质粒PGEM-T-HSA和PGEM-T-ILlra作为模板，根据ILlra基因和HSA基因的序列设计引物ILlra up (SEQ ID NO. 16) ,ILlra dn(SEQID NO. 17)、HSAup (SEQ ID NO. 18)和 HSA dn (SEQ ID NO. 19)进行 PCR 扩增。鉴于 BamH I酶切位点的碱基序列正好编码-GS-，特将编码连接肽-GGGGS-的密码子设计在ILlra dn5’端，如此也设计入了 BamH I酶切位点。且在HSA up 5’端也添加BamHI酶切位点，如此可通过BamH I酶切、连接从而融合ILlra基因和HSA基因。将ILlra基因扩增产物用XhoI和BamH I酶切后回收，将HSA基因扩增产物用BamH I和EcoR I酶切后回收，将pPIC9空质粒用Xho I和EcoR I酶切后回收。将酶切后的ILlra基因、HSA基因和pPIC9基因三片段相连得到质粒PPIC9-IGH，其中IGH表达序列见SEQ ID NO. I。
用Xho I和Not I双酶切质粒PPIC9-IGH，将含有IGH基因片段的酶切产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。实施例2重组质粒pPICZ a B-IGH构建将空pPICZ α B载体用Xho I和Not I酶切，电泳回收载体片段。将酶切后的pPICZ α B载体和实例I中得到的IGH表达序列以适当比例混合，用Τ4连接酶在16°C水浴中连接12小时，形成pPICZ aB_IGH(构建原理见图I)。pPICZ a B-IGH转化入DH5 α后，铺于含25yg/mL Zeocin的LB琼脂平皿，37°C培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含25 μ g/mLZeocin的LB液体培养基中，37°C培养过夜。获得的阳性克隆送上海生工测序验证正确。实施例3重组质粒pPICZ a B-IGH转化GSl 15将实例2中得到的验证正确的pPICZ a B-IGH质粒用Pme I线性化后以电转化的方式转化入毕赤酵母GS115，转化后的细胞在YPD液体培养基中30°C孵育2小时，然后涂布到含有 100, 700 或 1500 μ g/mL Zeocin 的 YPDS 琼脂平皿(I % yeast extract, 2% peptone, 2%葡萄糖，IM山梨醇，2%琼脂糖，IM山梨醇)。在30°C培养3天后，100，700或1500 μ g/mL Zeocin的YPDS琼脂平皿上分别长出约200个，4个，O个单菌落。在100和700 μ g/mLZeocin的YPDS琼脂平皿上分别挑取5个(命名为LI 5)和4个(命名为Hl 4)单菌落。实施例4融合蛋白IGH在多拷贝宿主中提高表达参考 Norden 等(Increasing gene dosage greatly enhances recombinantexpression of aquaporins in Pichia pastoris,BMC biotechnology,2011)公开的方法，用Real Time PCR确定实施例3中挑选的9个克隆IGH拷贝数，结果见表I。表I
权利要求
1.一种人血清白蛋白与白介素I受体拮抗剂融合蛋白的表达系统，包括宿主细胞和转化入宿主细胞的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插入有二硫键异构酶基因的第二表达载体，所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素I受体拮抗剂基因，所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。
2.如权利要求I所述的表达系统，其特征在于，所述融合蛋白基因包括连接人血清白蛋白基因和白介素I受体措抗剂基因的连接妝序列。
3.如权利要求I所述的表达系统，其特征在于，所述融合蛋白基因的碱基序列如SEQID NO. I 所示。
4.如权利要求I所述的表达系统，其特征在于，所述的二硫键异构酶基因的碱基序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
5.如权利要求I所述的表达系统，其特征在于，所述第一表达载体和第二表达载体的原始载体均为PPIC系列载体。
6.如权利要求5所述的表达系统，其特征在于，所述第一表达载体包含信号肽，所述第二表达载体不包含信号肽。
7.如权利要求6所述的表达系统，其特征在于，所述第一表达载体的原始载体为pPICZa B。
8.如权利要求6所述的表达系统，其特征在于，所述第二表达载体的原始载体为pPIC3. 5K。
9.如权利要求I所述的表达系统，其特征在于，所述第一表达载体的拷贝数为3 4个。
10.如权利要求I所述的表达系统，其特征在于，所述第二表达载体的拷贝数为至少两个。
全文摘要
本发明公开了一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统，包括宿主细胞和转化入宿主细胞的表达载体，所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插入有二硫键异构酶基因的第二表达载体，所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。本发明构建PDI与IGH共表达的宿主，使得IGH的表达量显著提高，由于PDI在胞内表达，而IGH分泌表达到胞外，所以收集的培养基上清中IGH浓度增加的同时不会新产生其他蛋白。
文档编号C12R1/84GK102766648SQ20121025970
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者沈其, 陈枢青 申请人:浙江大学