专利名称：特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物学、食品与卫生检测技术领域，具体涉及特异识别沙门氏菌(血清型08，以下简称沙门氏菌08)的寡核苷酸适配子的用途。
背景技术：
目前，国内外在食品中沙门氏菌检测时常用的检测方法因其检测手段、识别对象各有不同而各具优缺点。传统检测沙门氏菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法鉴定，耗时、不灵敏是这些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好，但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应(PCR)技术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚合酶链式反应(PCR)技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应(PCR)技术，如多重 PCR技术，然而多重PCR虽简化了 PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测結果。通过指数富集配体的系统进化(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment, SELEX)技术筛选获得的寡核苷酸序列称为适配子(aptamer)。其原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20-100个碱基左右，将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶子特异结合的寡核苷酸序列得到富集，最終获得靶分子的特异寡核苷酸配基。该技术具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等优点。在临床检测方面，特别是对ー些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能以及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX技术筛选到其相应的适配子，以检测靶物质，已成为该领域的研究热点。利用SELEX技术筛选获得的适配子识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫源性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等。更重要的是，适配子的靶分子更为广泛，包括金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖苷、抗生素、碱基类似物、核苷酸和多肽等。其中蛋白质类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可以通过复合靶子SELEX技术或消减SELEX技术筛选出高亲和カ的寡核苷酸配基。适配子比抗体具有更高的特异性和精确识别能力，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。这些特性使得适配子在生物医药和食品卫生研究領域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。
发明内容
为了解决现有沙门氏菌检测中存在的检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本发明提供一种特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的应用。特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下5’ -GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’，特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA。本发明通过SELEX技术的筛选过程，获得高亲和性特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子，用于快速、准确检测沙门氏菌08。本发明以倉源性沙门氏菌08为目的靶分子，同时以大肠杆菌086:K61和猪霍乱沙门氏菌为反筛菌，获得了一条沙门氏菌08特异的适配子。本方法具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。
图I为单链寡核苷酸(ssDNA)富集库与沙门氏菌08结合率的测定结果图。图2 A为寡核苷酸适配子10号与沙门氏菌08灵敏度测定结果图。图2 B为寡核苷酸适配子9号与沙门氏菌08灵敏度测定 结果图。图3A为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与大肠杆菌结合比较图。图3B为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与猪霍乱沙门氏菌结合比较图。图3C为突光显微镜观察突光基团标记寡核苷酸适配子10号与沙门氏菌08结合比较图。图3D为荧光显微镜观察荧光基团标记寡核苷酸适配子10号与双蒸水结合洗脱后空白对照图。
具体实施例方式特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’ ；特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA。本发明通过SELEX技术的筛选过程，获得高亲和性特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子，用于快速、准确检测沙门氏菌08。下面通过SELEX筛选获得沙门氏菌08特异的寡核苷酸适配子，并对其中亲和カ最高的一条寡核苷酸适配子对沙门氏菌08识别和鉴定作进ー步说明。I.随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成 随机单链 DNA 文库5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-
35nt-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’ (注nt 代表 A、T、C、G 碱基中任意ー种)
引物 I : 5 ’ - GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’
引物 II : 5 ’ -GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3，
引物III : 5’-地高辛- GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’
引物IV :5’ -生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3’。2.沙门氏菌08 {Salmonella嫩)的制备
沙门氏菌08 {Salmonella 08’购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心CICC)接种于营养琼脂平板37°C培养15 18小时，刮取菌苔于O. 9%无菌生理盐水试管，6000 rpm 4°C离心10 min，洗涤菌体3次，弃上清，重悬于O. 9%无菌生理盐水，用比浊仪调浊度为O. 5，约相当于I. 5X 108/ml沙门氏菌08菌悬液。3. SELEX筛选获得沙门氏菌08特异的寡核苷酸适配子
I)SELEX筛选过程
a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA1/3 OD (I(^g)加入到400ul IX结合缓冲液，95度变性5min，然后迅速置于冰上IOmin ； b.加入ImL菌悬液I.5X IO8 ,于37° C摇床100 rpm结合I小时(以后可减少结合时间)，使单链DNA文库与菌充分作用；
c.更换离心管，以去除与管壁结合的单链DNA,室温下离心10000 rpm离心 IOmin分离未与菌结合的单链DNA文库；
d.弃上清,加入600μ IX冲洗缓冲液,离心10 000 rpm离心IOmin,重复此过程4次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；
e.接上步离心后去上清，加入IOOPL去离子水99°C加热3min，高速离心18 000rpm离心15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中)，-20° C保存备用。2) PCR富集与沙门氏菌08特异结合的寡核苷酸适配子
每轮筛选后获得的与沙门氏菌08特异结合的寡核苷酸适配子文库通过PCR扩增得到富集；
a.以上述上清为模板，通过引物I和引物IV扩增产生一端带生物素标记的双链DNA；
b.PCR扩增条件95° C预变性3min，然后进行30循环95° C变性30s，60° C退火30s，72。C 延伸 30s，最后 72。C 延伸 IOmin ;
c.PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作用与链亲合素交联的磁珠结合，经过IX连接(the standard Binding and Washing Buffer,B&ff)缓冲液洗涤3次，用IOOmM的新鲜NaOH 37° C变性30 min,使不带生物素的单链DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，測定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富集库。3)重复筛选重复上述SELEX筛选过程和PCR扩增富集过程，共进行9轮筛选，其中第5、8轮分别用大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌进行反筛。4)富集寡核苷酸适配子与菌结合率的測定
a.第1、3、5、7、9、11轮SELEX筛选的产物，以标记地高辛的引物III和标记生物素的引物IV进行PCR扩增，纯化的PCR产物与链亲和素标记的磁珠充分反应并用NaOH解链，地高辛标记的单链DNA游离在上清中；
b.按单链DNA:沙门氏菌08=300pmol:l. 5X108在IX结合缓冲液中结合，离心，弃上清，加入抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶反应15 min,重复洗漆,洗去未与沙门氏菌08上单链DNA-地高辛结合的抗地高辛抗体结合的碱性磷酸酶，以5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐/四唑硝基蓝(BCIP/NBT)显色，終止反应后用酶联仪于405 nm测定吸光度A值，见图I。5)富集寡核苷酸适配子文库的测序结果与分析
a.将最后的富集文库扩增为双链，连接pEGM-Τ载体，转化^:coli DH5 α，随机挑取22个阳性克隆进行DNA序列測定，其中19个为可用序列，见表I ;
b.采用ClustalW、RNA STRUCTURE和DNAMAN软件分析19条序列一级结构的同源性并进行ニ级结构的预测；
c.结合亲和力高低和配基高级结构，选出亲和カ最高、能级较低的两条寡核苷酸适配子的序列(寡核苷酸适配子10号、寡核苷酸适配子9号)，进行下一歩的鉴定。4.荧光基团标记寡核苷酸适配子(寡核苷酸适配子10号)与沙门氏菌08的荧光显微镜鉴定
1)将寡核苷酸适配子10号序列送上海生物工程有限公司合成并在5’端标记羟基荧光素(FAM)。5’-FAM-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’ ；
2)将FAM标记的寡核苷酸适配子10号分别与沙门氏菌08，猪霍乱沙门氏菌和大肠杆菌在IX结合缓冲液中结合，37° C孵育I小吋，离心弃上清，洗涤数次，直到上清没有荧光为止；
3)将菌沉淀用10μ IX洗涤缓冲液重悬，涂在载玻片上，过火固定； 4)将载玻片置于缓冲液中洗涤2-3次，2分钟/次，最后用无菌蒸馏水冲洗2秒钟；
5)晾干，加封片剂、盖玻片。荧光显微镜下观察结合情况见图3。实验结果
通过SELEX筛选和亲和カ分析，获得了一条亲和カ最高、能级最低的沙门氏菌08特异的寡核苷酸适配子10号，且对寡核苷酸适配子10号序列进行荧光基团标记应用后，上显微镜能明显观察到与沙门氏菌08发生特异性的結合。由图I可见，随着筛选轮数的増加，单链DNA富集库的结合力逐渐增加，第9轮筛选获得了很好的亲和力，但当沙门氏菌上的结合位点达到ー个饱和状态时，吸附到沙门氏菌上的单链DNA就不再增加。表I为SELEX筛选获得的寡核苷酸适配子序列 寡核苷酸适配子I号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCCACACCCCACAACCACCCAGCCCCAGCCCGCTATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子2号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACAACACCCAGCCAACGACCACAACTCCAACTCATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子3号
GATCCGGGCCTCATGTCGAAACCACAACCCAACAACAAGAACCACAAAGAGCCCCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子4号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACACACAGAACCACAACCACTAAACACGAGGGCCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子5号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子6号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC寡核苷酸适配子7号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACAAGGCAGAAAGAAACCGACAAACCGCACTGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子8号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCGAACGACTCAAAGATCAAGCCAAGCCACGCCCGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子9号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACCAACCCAACACCAAAGAGACCACCACCACACGAGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子10号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子11号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACACGAGCCACCAACGCACCAAAACCCGTCCTCCACTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子12号
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGCACGCGCACCAAAACACAAACTCCCCCCGCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子13号
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGCCACCTAACCACCTCTGCCAATACCCCCCGCGTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子14号
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGAAGTCATGGCATGGATGCGCTCCCCGCCCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子15号
GATCCGGGCCTCATGTCGAAGGGAAGTCATGGCATGGATGCGCTCCCCGCCCACCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子16号
GATCCGGGCCTCATGTCGAACGGCGCAGTGACACGGTAGGGAGTCGTGCCGCGGCTTGAGCGTTTATTCTGAG
CTCCC
寡核苷酸适配子17号
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGTGGGCGGGCGGCGTTGCTGTTCTTTTGCTGGTGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
寡核苷酸适配子18号
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGAGGCGGCCTGTTCGCTTGTTGTGGGTCCGCTTGGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
寡核苷酸适配子19号
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGCACTGGGTGGTGATGTTTTGTTTGTCTGGCGGTTCGACATGAGGCCC
GGATC寡核苷酸适配子20号
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGGGGGGGTGGAGGGGTATGCAGTTTCGGTGGCCGTTCGACATGAGGCCC
GGATC
表I列出了 20条序列,一般来说，自由能最低的ニ级结构最稳定。我们选择自由能较低的寡核苷酸适配子10号和寡核苷酸适配子9号来測定其亲和力。由图2可见，寡核苷酸适配子10号的解离常数(Kd)为32. 04，寡核苷酸适配子9号的解离常数(Kd)为175.9。根据解离常数(Kd)值越低，适体的亲和カ就越高，最終我们挑选寡核苷酸适配子10号为最优适配体，并做进一歩验证。由图3可以得到结论荧光基团标记寡核苷酸适配子10号能特异识别沙门氏菌08，有较强的荧光，而与大肠杆菌和猪霍乱沙门氏菌无明显结合，只存在极少量的荧光。
总之，筛选得到的寡核苷酸适配子10号能特异识别沙门氏菌08，敏感性高、速度快，该发明可用于检测试剂盒的制备。本发明用于特异性检测沙门氏菌08的具体方法如实施例中步骤4。
权利要求
1.特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的用途，所述寡核苷酸适配子的核苷酸序列如下5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAACACCCCCCAACTAAAACAACAAAACACCACCGCCATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA-3’，其特征在于所述寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA，其在沙门氏菌08检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及特异识别沙门氏菌的寡核苷酸适配子的用途。所述寡核苷酸适配子是一条78个碱基长的单链DNA，其在沙门氏菌O8检测中的应用。本发明以食源性沙门氏菌O8为目的靶分子，同时以大肠杆菌O86:K61和猪霍乱沙门氏菌为反筛菌，获得了一条沙门氏菌O8特异的适配子。本方法具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。
文档编号C12N15/115GK102808022SQ20121025865
公开日2012年12月5日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者余晓峰, 张萍, 宗凯, 孙娟娟, 李云飞, 陈雪娇, 郑海松 申请人:安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心