使用阻断性寡核苷酸进行dna扩增的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及核酸样品中变体祀序列例如突变的扩增、富集和/或检测的改进。
【背景技术】
[0002] 在遗传分析中通常遇到的情形引起对在大大过量的非变体序列（"参比序列"）存 在下鉴定低百分率的变体DNA序列（"祀序列"）的需要。作为实例，在过量的正常等位基 因中灵敏可信地检测痕量的与疾病相关的突变等位基因，对于早期或确认诊断、治疗决定、 疾病监测和预后分层来说已变得必不可少。然而，使用的高灵敏度与可靠性和实用性的平 衡仍然具有挑战性。
[0003]Sanger测序运种鲁棒的标准方法只能在正常等位基因背景中检测约10-20%的 突变等位基因，而其他更灵敏的基于PCR的测定法例如限制性片段长度多态性、扩增受阻 突变系统PCR(ARMS-PCR)、变性高效液相色谱和实时PCR可能更加受限。扩增受阻突变系 统PCR运种最广泛使用的方法是一种将PCR引物设计成在相差单个核巧酸残基的模板之间 做出鉴别的扩增策略。运种方法简单省时，但是是序列特异性的，需要事先知道突变才能检 ，并且有时产生严重的假阳性结果。
[0004] 为了开发旨在克服现有技术方法的固有缺点的新的分子技术，已进行许多尝试。 对于能够非破坏性选择和富集突变等位基因的PCR阶段的革新特别有兴趣，因为运可W提 高下游测定法例如标准的测序分析的灵敏度和可信度。运些最新的富集PCR技术包括由 肤核酸（PM) (Sun等，2002)或锁核酸（LNA) 0ominguez等，2005)介导的PCR巧位（PCR clamping)，W及在较低变性溫度下共扩增PCR(Li等，2008)。每种技术在成本、可用性或富 集效率方面具有其自身的长处和限制。 阳0化]在Lee等，2011中，作者描述了一种简单实用的富集技术，被称为使用3'-修饰 寡核巧酸的突变富集（MEMO)。运种技术的概念与PNA/LNA介导的PCR巧位的概念相似，但 PM或LNA被3'-修饰的寡核巧酸代替，其廉价得多并容易设计。简单来说，两条通用引物 和一条阻断引物构成PCR反应混合物。在阻断引物的3'-末端上，附连有抑制延伸的化合 物例如C3间隔物、C6胺或憐酸醋，使得PCR不能通过阻断引物延伸DNA。阻断引物涵盖祀 突变位点并与野生型序列互补。两条通用引物之一在祀突变位点附近与阻断引物重叠几个 碱基，并因此与阻断引物竞争。阻断引物被设计成与它所竞争的通用引物相比具有更高的 解链溫度并W更高浓度使用在反应混合物中，它的DNA结合主要针对野生型序列，而它对 突变序列的亲和性由于错配而显著降低。阻断引物失去竞争力使得能够通过通用引物对选 择性扩增突变序列。
[0006] 运种MEMO-PCR被用于鉴定甲状腺结节中罕见的3bpBRAF基因缺失Qang等， 2012)O
[0007] 然而，对于具有提高的特异性的检测方法仍存在需求，特别是当变体祀序列带有 核巧酸替换时。事实上，运样的序列到目前为止辨别不良。 阳00引发明概述
[0009] 现在，本发明提供了一种特别是但不限于在过量的非变体或野生型（WT)序列 ("参比序列"）存在下检测变体DNA序列（"祀序列"）的改进的方法。
[0010] 本发明的方法是一种用于从核酸样品选择性扩增祀DNA序列的体外方法，所述方 法包括对怀疑包含至少一个祀DNA序列的核酸样品运行PCR扩增，所述祀DNA序列与所述 参比DNA序列在至少一个预定祀突变位点处不同；其中所述方法利用了阻断性寡核巧酸， 其除了所述祀突变位点外部的至少一个错配之外，与包含所述祀突变位点的一部分所述参 比DNA序列互补。 W11] 更具体来说，本发明提供了一种用于从核酸样品选择性扩增祀DNA序列的体外方 法，所述方法包括： 阳01引 a.提供怀疑包含至少一个祀DNA序列的核酸样品，所述祀DNA序列与参比DNA序 列在至少一个祀突变位点处不同；
[0013] b.添加W下物质W便形成反应混合物：
[0014] i)正向引物寡核巧酸和反向引物寡核巧酸，其与所述祀突变位点周围的一部分所 述参比DNA序列完全互补，
[0015] ii)阻断性寡核巧酸，其被设计成与所述引物寡核巧酸之一竞争，并被修饰W使其 不能被聚合酶延伸；
[0016] C.通过聚合酶链反应（PCR)对所述反应混合物进行扩增，由此延伸所述引物寡核 巧酸W便选择性扩增所述祀DNA序列；
[0017] 其中所述方法的特征在于所述阻断性寡核巧酸与包含所述祀突变位点的所述参 比DNA序列的一部分互补，但是在所述祀突变位点的外部包含至少一个与所述参比DNA序 列的错配。
[0018] 所述祀突变可能包含一个或几个核巧酸的替换、一个或几个核巧酸的缺失或一个 或几个核巧酸的插入。最优选地，它是或包含单个核巧酸替换。
[0019] 所述方法是已知的PCR巧位方法的改进。
[0020] 根据本发明，已发现在所述阻断性寡核巧酸中添加序列错配显著提高了所述祀序 列检测的特异性。特别是，序列错配的添加极大提高了W核巧酸替换为特征的变体序列的 鉴别。
[0021] 本发明的方法对于包含祀序列的核酸样品与包含参比序列的核酸样品的鉴别特 别有用，例如用于诊断目的。
[0022] 本发明还提供了一种用于在核酸样品中检测和/或确定祀突变的方法，所述方法 包括对怀疑包含至少一个祀DNA序列的核酸样品进行本文中所描述的扩增方法，所述祀 DNA序列与参比DNA序列在至少一个祀突变位点处不同，W及检测和/或确定已被扩增的祀 DNA序列的所述祀突变。
[0023] 因此，所述方法可W包括通过使用选自下列的一种或多种方法确定已被扩增的祀 DNA序列的祀突变:MLDI-T0F、高分辨率烙解（皿烙解）、双脱氧测序、单分子测序、焦憐酸 测序、第二代高通量测序、单链构象多态性（SSCP)、限制性片段长度多态性（RFLP)、变性高 效液相色谱（地PLC)、数字PCR、ARMS-PCR和定量PCR。
[0024] 附图简述
[00巧]Ml是使用含有序列错配的3'修饰的寡核巧酸阻断物的本发明方法的示意图。在 野生型序列存在下，寡核巧酸阻断物（I)杂交它的祀序列，引起PCR扩增抑制。在任何序列 变异存在下，竞争引物（2)优选地结合于祀序列，引起变体序列的特异性扩增，运可W例如 通过来自于水解探针（3)的巧光发射来监测。
[0026] 图2示m了I畑1R132突变的序列和位置。在I畑1基因的野生型序列中下划线的 是在变体序列中可W被其他核巧酸替换的两个核巧酸（在R132密码子内）。对于每个变体 序列来说，相应的被替换的核巧酸用粗体示出。
[0027] 详细描述 W測定义
[0029] 当在本文中使用时，术语"扩增"祀序列是指增加祀序列的量。术语"选择性扩增" 意味着仅仅（或基本上仅仅）扩增祀序列。术语"富集"更具体来说意味着提高样品中祀 序列相对于相应的参比序列的比例。例如，当样品中祀序列与参比序列的比例一开始为5 % 比95%时，祀序列可能在扩增反应中被优选地扩增，W便产生70%祀序列比30%参比序列 的比例。因此，祀序列相对于参比序列可能存在14倍的富集。
[0030] 当在本文中使用时，术语"祀序列"是指待检测和扩增的目标序列。祀序列与对应 的参比序列通常至少50%同源，优选地至少60%同源，优选地至少70%同源，但是必须与 参比序列相差至少1个核巧酸。祀序列可W使用与用于参比序列的相同的引物对而通过 PCR扩增。在特定实施方式中，核酸样品中祀序列的普遍性低于相应的参比序列。祀序列优 选地占样品中参比序列+祀序列的总量的少于50%。祀序列可能是突变等位基因。例如， 样品（例如血样）可能含有大量正常细胞和很少癌细胞。正常细胞含有非突变的或野生型 等位基因，而少量癌细胞含有体细胞突变。在运种情况下，突变体是祀序列，而野生型序列 是参比序列。
[00川当在本文中使用时，术语"参比序列"意味着可W使用与用于祀序列的相同的引物 对扩增，但是其扩增是不想要的。运样的序列涵盖了非变体或野生型序列。优选地，"参比序 列"完全或至少部分已知。在特定实施方式中，术语"参比序列"是指核酸样品中比相应的 祀序列更普遍的核酸。参比序列优选地占样品中参比序列+祀序列总量的超过50%。优选 地，参比序列在RNA和/或DNA水平上表现为超过祀序列10X、15X、20X、25X、30X、35X、40X、 45X、50X、60X、70X、80X、90X100X、150X、200X或更多。
[0032] 当在本文中使用时，术语"野生型"是指在群体中对于某个基因来说最常见的多核 巧酸序列或等位基因。一般来说，野生型等位基因从正常细胞获得。
[0033] 当在本文中使用时，术语"祀突变"是指核酸序列中的核巧酸变化（即单个或多个 核巧酸替换、缺失或插入）。带有突变的核酸具有在序列上与相应的野生型多核巧酸序列不 同的核酸序列（突变等位基因）。本发明广泛设及体细胞突变和多态性。本发明的方法在 选择性扩增或富集在1至10个核巧酸位置处含有变化的突变等位基因中特别有用，尽管即 使具有更大数量的序列变化时也是有用的。突变等位基因通常从患病组织或细胞获得，并 且与疾病状态相关。术语"祀突变位点"意味着包含或怀疑或可能包含祀突变的DNA序列区 域。尽管祀突变本身的本质或准确位置可能是未知的，但