祀突变位点是确定或预定的。一 般来说，它是包含祀突变的约5至约30个核巧酸的区域。在特定实施方式中，突变可能是 单个核巧酸替换，其准确位置是已知的，因此祀突变位点可能是突变的核巧酸本身的位置。
[0034] 当在本文中使用时，术语"解链溫度"或"Tm"是指多核巧酸从其互补序列解离时 的溫度。一般来说，Tm可W被定义为双链核酸分子中一半的Watson-化ick碱基对被打断或 解离（即被"解链"）而另一半Watson-化ick碱基对保持完整处于双链构象时的溫度。换 句话说，Tm被定义为两个互补序列的50 %的核巧酸被退火（双链）并且50 %的核巧酸变 性（单链）时的溫度。因此，Tm定义了从双链向单链核酸分子的转变中（或相反，从单链向 双链核酸分子的转变中）的中点。Tm可W通过许多方法来估算，例如按照Wetmur1991通 过最近邻计算和通过商业化程序包括OligoTM引物设计和可W在因特网上获得的程序。或 者，Tm可W通过实际实验来确定。例如，可W在解链曲线测定法中使用双链DNA结合或嵌入 染料例如漠化乙锭或SYBR-green(Mole州IarProbes)来确定核酸的实际Tm。用于确定核 酸的Tm的其他方法在本领域中是公知的。
[0035] 当在本文中使用时，"同源性"是指两个聚合分子例如两个多核巧酸之间的亚单 位序列相似性。适用于确定百分序列一致性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2. 0算法，其分别描述在Altschul等，1997和Altschul等，1990中。用于执行BLAST分 析的软件可W通过美国国家生物技术信息中屯、（化tionalCenterforBiotechnology Information)化ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
[0036] 核酸样品
[0037] 当在本文中使用时，"样品"是指含有或推测含有目标核酸（祀和/或参比序列） 的任何物质，或其本身是含有或推测含有目标祀核酸的核酸。因此，术语"样品"包括核酸、 细胞、生物体、组织、流体或物质的样品，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋己液、滑 液、尿液、泪液、粪便、皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道的外分泌物、唾液、血细胞、肿瘤、器 官、组织、体外细胞培养物组分的样品、天然分离物（例如饮用水、海水、固体材料）、微生物 样本，W及已用核酸示踪剂分子"标记"的物体或样本。还涵盖福尔马林固定的石蜡包埋的 (FF阳）组织。 阳03引祀（和参比序列）可W从各种不同来源获得，包括基因组DNA、互补DNA(CDNA)、病 毒DNA、哺乳动物DNA、胎儿DNA或细菌DNA。在一种实施方式中，在本发明的方法中使用的 核酸样品通常包含基因组DNA，例如具有祀和参比序列的基因组DNA。基因组DNA可W从血 液、组织或细胞，按照公知的方法例如通过使用商品化试剂盒（例如Qiagen的QIAmpDNA提 取试剂盒，用于从FFPE或血液提取）来分离。在另一种实施方式中，核酸来源可W是RNA， 可W从其通过标准方法产生cDNA。
[0039] 在特定实施方式中，本发明的方法的核酸样品包含W前在核酸扩增反应中扩增的 祀和/或参比序列。本领域技术人员应该认识到，有许多方法可用于扩增核酸。
[0040] 尽管一般来说参比序列是野生型等位基因并且祀序列是突变等位基因，但反过来 也可能成立。突变等位基因可能包括任一个或多个核巧酸缺失、插入或改变。在某些实施 方式中，突变等位基因是体细胞突变。
[0041] 反应混合物
[0042] 本发明的方法使用两条引物，其在PCR反应期间退火到祀和参比序列的相反链，W便形成扩增产物。扩增子的尺寸通常在约60至约SOObp之间，优选为约80至约25化P。
[0043] 引物寡核巧酸一般包含10至40个核巧酸，优选地10至30个核巧酸，优选地15 至25个核巧酸。引物寡核巧酸优选地具有56-64°C左右的Tm。引物寡核巧酸与参比和祀 序列的一部分100%互补。一般来说，所述引物在其3'或5'末端处不被修饰。 W44] 在本发明中，一条引物寡核巧酸是"竞争性"或"竞争"引物，即它意图与阻断性寡 核巧酸竞争向参比或祀序列的结合。因此，正如下面解释的，竞争性引物至少部分地与阻断 性寡核巧酸序列重叠。
[0045] 当在本文中使用时，"阻断性寡核巧酸"是工程化改造的单链核酸序列。阻断性寡 核巧酸可能是单链DNA、RNA、肤核酸或锁核酸之一。优选地，它是DNA寡核巧酸。阻断性寡 核巧酸一般包含10至40个核巧酸，优选地15至30个核巧酸。
[0046] 阻断性寡核巧酸被修饰，使得它不能被聚合酶延伸。
[0047] 在优选实施方式中，阻断性寡核巧酸上的3'-末端被修饰，W抑制由聚合酶引起 的延伸。
[0048] 运样的阻断性序列可W通过任何已知方法来合成。首先，可W使用允许序列的 3'-末端修饰的标准寡核巧酸合成方法通过直接合成来制造参比阻断性序列。3'-末端可 能含有憐酸基团、氨基、双脱氧核巧酸或阻断5'到3'聚合酶延伸的任何其他组成部分。或 者，可W在产生单链DNA作为终产物的PCR反应期间通过聚合酶合成来制造参比阻断性序 列。
[0049] 阻断性寡核巧酸的3'-末端的阻断可WW本领域技术人员公知的几种方式来实 现。例如，可W利用在双脱氧核巧酸（ddNT巧存在下，在溶液中使用末端脱氧核巧酸转移酶 (TdT)的反应，W向单链参比阻断性序列的末端添加单个ddNTP。ddNTP起到阻断聚合酶延 伸的作用。或者，可W使用与阻断性序列的3'-末端互补的寡核巧酸模板来提供暂时的双 链结构。然后可W使用聚合酶在与杂交的寡核巧酸相反的参比阻断性序列的3'-末端处插 入单个ddNTP。
[0050] 例如，阻断性寡核巧酸的3'-末端可能包含C3间隔物、C6胺或憐酸基团。
[0051] "C3间隔物"修饰向寡核巧酸的3'端添加S个碳的间隔物，其变成例如
[0052]
[0053] C6胺修饰将胺官能团并入到寡核巧酸的3'端。
[0054] 阻断性寡核巧酸被设计成与一条引物寡核巧酸竞争。 阳化5] 因此，阻断性寡核巧酸的序列与引物寡核巧酸之一的序列交叠。交叠（即竞争引 物与阻断性寡核巧酸之间的共有序列）可W包含至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或 85%的阻断性寡核巧酸或由其构成。或者交叠可W包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13或14 个核巧酸或由其构成。所述交叠不包含祀突变位点。
[0056] 阻断性寡核巧酸序列与它所竞争的引物寡核巧酸至少部分交叠，但是被设计成与 它所竞争的引物寡核巧酸相比具有更高的解链溫度（Tm)(例如高出约1至约15°C之间，优 选地高出约1至约l〇°C之间）和/或W更高的浓度添加。
[0057] 例如，阻断性寡核巧酸W比它所竞争的引物寡核巧酸的浓度高至少2倍、优选地 至少3倍、至少4倍或至少5倍的浓度添加。
[0058] 阻断性寡核巧酸与参比DNA序列的一部分互补，所述部分包含对应于祀突变位点 的（非突变的或野生型）核巧酸。除了在祀突变位点处之外，参比DNA序列的所述部分与 祀DNA序列的相应部分一致。
[0059] 在优选实施方式中，阻断性寡核巧酸被设计成使得它的序列的中央部分结合参比 或祀DNA序列的祀突变位点。 W60] 竞争性引物与阻断性寡核巧酸在祀突变位点附近交叠几个碱基。
[0061] 根据本发明，阻断性寡核巧酸还包含至少一个不与参比或祀DNA序列上的相应核 巧酸互补的核巧酸。当然应该理解，所述核巧酸不位于祀突变位点处。
[0062] 不与参比或祀DNA序列上的相应核巧酸互补的核巧酸优选为A或T核巧酸而不是 G或C核巧酸。
[0063] 阻断性寡核巧酸中的运种错配（即所述核巧酸不与参比序列上的相应核巧酸互 补）优选地位于祀突变位点的上游。
[0064] 也是优选地，运个错配可能位于阻断性寡核巧酸的与竞争性引物交叠的部分中。 阳〇化]与竞争性引物的结合相比，阻断性寡核巧酸的结合偏向于参比（或野生型）序列。 因此，不能发生参比序列的PCR延长。
[0066] 在祀DNA序列中存在突变的情况下，阻断性寡核巧酸对突变或变体序列的亲和性 由于所述错配而明显降低，并且存在竞争引物的偏好性结合，其允许PCR延长。因此，存在 通过引物对的祀（突变或变体）序列的选择性扩增（参见图1)。
[0067] 不通过任何机制相联系，本发明人相信运样的错配破坏阻断性寡核巧酸结合的稳 定，运引起竞争性引物偏好性结合于祀序列，并因此引起祀序列的更多鉴别性扩增。
[0068] 反应混合物通常包含其他成分，例如酶、碱基（例如A、T、G、C)或对执行扩增或检 测有用的寡核巧酸。
[0069] 具体来说，反应混合物可W包括核酸聚合物，它是催化核巧酸=憐酸聚合的酶。一 般来说，所述酶在退火到祀序列的引物的3'-末端处启动合成，并沿着模板在5'方向上前 进。已知的DNA聚合酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、嗜热栖热菌灯hermus thermophiIus) (Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽抱杆菌度aciIlusStearothermo地iIus) DNA聚合酶、海滨嗜热球菌（Thermococ州Slitoralis)DNA聚合酶、水生栖热菌（Thermu