核酸信号放大序列及放大方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸信号放大序列及核酸信号放大方法。本发明所述核酸信号放大序列包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。本发明所述核酸信号放大序列可以通过前导序列将目的靶标捕获杂交，再经过若干倍数的重复序列结合相应的报告探针即可实现信号放大，从而检测到目的靶标的核酸信号。相对于PCR技术需要酶来维系杂交体系，本发明可以实现不增加检测物浓度的前提下实现核酸物质的检测，且稳定性好，重复性高，成本低，检测流程短。
【专利说明】
核酸信号放大序列及放大方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸信号放大序列及核酸信号放大方 法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的 DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其能将微量的DNA大幅增 加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的 毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。
[0003] PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互 补的寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模 板DNA经加热至93 °C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使 之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性）：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55 °C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③ 引物的延伸:DNA模板一引物结合物在72 °C、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性一退火一延伸三过程就可获得更多的"半保留复制 链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟，2~3小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
[0004] 但是，PCR技术的稳定性和重复性较差，存在严重的气溶胶污染缺陷，虽然后续的 闭管荧光PCR解决了交叉污染的问题，但是仍没能解决PCR技术的天生缺陷问题。其次PCR成 本较高，PCR反应需要建设较高的空气净化级别的专用实验室，对实验要分区管理，管理成 本大大增加;而且反应时间流程太长导致每次检测的时间成本增加。此外，PCR反应中Taq酶 或者聚合酶还容易受到样本中的物质影响，导致假阳性或者假阴性的结果出现。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷提供一种核酸信号放大序列及 其制备方法，以及利用该序列进行核酸信号放大的方法。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
[0007] -种核酸信号放大序列，包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所 述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。
[0008]在一些实施方案中，本发明所述核酸信号放大序列中，所述前导序列的Tm值为55 。(:_62°C ;所述重复序列的Tm值小于55°C。
[0009]在一些实施方案中，本发明所述核酸信号放大序列中所述前导序列5'端还包括硫 代三磷酸腺苷保护的限制性内切酶I酶切位点酶切后的片段，所述限制性内切酶I的酶切位 点酶切后为粘性末端。
[0010] 进一步的，在一些实施方案中，本发明所述核酸信号放大序列中所述核酸信号放 大序列3'端还包括限制性内切酶II的酶切位点酶切后的片段;所述限制性内切酶II的酶切 位点酶切后为平整末端。
[0011] 在一些实施方案中，本发明所述核酸信号放大序列中，所述限制性内切酶I为EcoR I、BamH I、HindII、HindIII;所述限制性内切酶II为EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、HalIII、 HPa I、Sma I〇
[0012] 进一步的，在一些实施方案中，所述核酸信号放大序列中所述重复序列的倍数为5 倍-20倍。
[0013] 本发明还提供了所述核酸信号放大序列的制备方法，具体包括以下步骤：
[0014] A、根据目的靶标设计核酸信号前导序列和若干倍数的重复序列，并分别在前导序 列5'端加上限制性内切酶I的酶切位点，在若干倍数的重复序列3'端加上限制性内切酶II 的酶切位点;所述限制性内切酶I的酶切位点与核酸信号放大序列的前导序列相连，酶切后 为粘性末端;所述限制性内切酶II的酶切位点与核酸信号放大序列的重复序列相连，酶切 后为平整末端；
[0015] B、合成序列插入载体后进行克隆复制；
[0016] C、限制性内切酶I和限制性内切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷对限制性酶切末端 进行保护；
[0017] D、核酸外切酶ΙΠ 酶切获得核酸信号放大序列。
[0018] 其中，所述核酸信号放大序列的制备方法中，所述载体为pGEM-3ZF( + )载体。
[0019] 本发明还提供了一种核酸信号放大的方法，将含有目的靶标的样品包被在微孔板 上，然后加入上述核酸信号放大序列杂交，之后加入报告探针杂交后加入化学发光底物读 取结果。
[0020] 进一步的，在一些实施方案中，本发明所述核酸信号放大的方法还包括以核酸信 号放大序列中的重复序列为前导序列进行次级信号放大的步骤。
[0021] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种核酸信号放大序列及其制备方法，以及 利用该序列进行核酸信号放大的方法。本发明所述核酸信号放大序列包括一个前导序列和 一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告 探针序列互补。本发明所述核酸信号放大序列可以通过前导序列将目的靶标捕获杂交，再 经过若干倍数的重复序列结合相应的报告探针即可实现信号放大，从而检测到目的靶标的 核酸信号。相对于PCR技术需要酶来维系杂交体系，本发明可以实现不增加检测物浓度的前 提下实现核酸物质的检测，且稳定性好，重复性高，成本低，检测流程短。
【附图说明】
[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0023] 图1示核酸信号放大序列结构示意图；
[0024] 图2示核酸外切酶ΙΠ 酶切获得核酸信号放大序列的示意图；
[0025] 图 3 示pGEM-3ZF( + )载体图谱；
[0026] 图4示初级信号放大加次级信号放大构象图。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0028] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
[0029] -种核酸信号放大序列，包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所 述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。
[0030] 本发明所述核酸信号放大序列为针对目的靶标设计并合成的一种非自然存在的 基因序列，该基因序列是由一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成。其结构如图1所 不。
[0031] Tm值是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构在热变性过程中紫外吸收值达到最大 值的1/2时的温度。
[0032] 本发明所述核酸信号放大序列中所述前导序列可以与目的靶标序列互补形成双 螺旋结构。所述若干重复序列可以与报告探针序列互补形成双螺旋结构。
[0033]为了保证结构的稳定，本发明所述核酸信号放大序列中所述前导序列的Tm值保证 在60°C左右。在一些实施方案中，所述前导序列的Tm值为55°C-62°C。
[0034] 同样的，本发明所述核酸信号放大序列中所述核酸信号放大序列中所述重复序列 的Tm值小于55°C，以确保重复序列的特异性杂交。
[0035] 如，在一些实施例中所述核酸信号放大序列中所述前导序列具体为 ACGITTTAGAGAGAGATATGAT，所述重复序列为 TCCCGGGAGGCGAGCA。
[0036] 如，在一些实施例中所述核酸信号放大序列中所述前导序列具体为 TCCCTGAATGCCTAACGAT，所述重复序列为 AGGTCTTTACCACCAATATTCTITT。
[0037]在一些实施方案中，所述核酸信号放大序列中所述前导序列5'端还包括硫代三磷 酸腺苷保护的限制性内切酶I酶切位点酶切后的片段，所述限制性内切酶I的酶切位点酶切 后为粘性末端。即所述前导序列5'端连接有限制性内切酶I的酶切位点，而该酶切位点经酶 切后形成粘性末端，随后粘性末端经硫代三磷酸腺苷进行保护后补齐为平末端，获得包括 硫代三磷酸腺苷保护的限制性内切酶頂每切位点酶切后的片段。
[0038] 在一些实施方案中，本发明所述核酸信号放大序列3'端还包括限制性内切酶II的 酶切位点酶切后的片段;所述限制性内切酶II的酶切位点酶切后为平整末端。
[0039] 本领域技术人员可以理解，所述核酸信号放大序列中，所述限制性内切酶I可以为 任意一种酶切后形成粘性末端的任何一种酶，如为EcoR 13&111!11、把11(111、把11(1111等。在一 些实施方案中，所述限制性内切酶I为Hindll。
[0040] 所述限制性内切酶II可以为任意一种酶切后形成平整末端的任何一种酶，如为 EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、HalIII、HPa I、Sma I等。在一些实施方案中，所述限制性内 切酶Π 为EcoR V。
[0041] 本发明所述核酸信号放大序列中所述重复序列的倍数为5倍-20倍。在一些实施例 中，所述重复序列为20倍。在另一些实施例中，所述重复序列为10倍。
[0042]本发明还提供了上述核酸信号放大序列的制备方法，具体包括以下步骤：
[0043] A、根据目的靶标设计核酸信号前导序列和若干倍数的重复序列，并分别在前导序 列5'端加上限制性内切酶I的酶切位点，在若干倍数的重复序列3'端加上限制性内切酶II 的酶切位点;所述限制性内切酶I的酶切位点与核酸信号放大序列的前导序列相连，酶切后 为粘性末端;所述限制性内切酶II的酶切位点与核酸信号放大序列的重复序列相连，酶切 后为平整末端；
[0044] B、合成序列插入载体后进行克隆复制；
[0045] C、限制性内切酶I和限制性内切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷对限制性酶切末端 进行保护；
[0046] D、核酸外切酶IΠ 酶切获得核酸信号放大序列。
[0047] 本发明所述制备方法是通过硫代三磷酸腺苷对酶切后的片段进行保护，利用核酸 外切酶III不能切割含有硫代三磷酸腺苷序列的特点，将未被硫代三磷酸腺苷保护的片段 切割成单链探针。
[0048]核酸外切酶III具有外切酶活性，该酶作用于双链DNA，从3MH末端方向逐 步切去单核苷酸。每次酶与底物结合催化，只有几个核苷酸被除掉，从而在DNA分子群内产 生渐进缺失。尽管可以作用于双链DNA的切刻产生单链缺口，但该酶最适底物是平齐末端或 3'凹陷末端DNA。由于对单链DNA无活性，因此该酶无法切割3'突出末端。且核酸外切酶III 的3' 外切酶活性对底物的切割程度随3'突出末端的长度而变化，四碱基或更长的突出 末端完全不能被切割。
[0049]由于核酸外切酶III不能作用于粘性末端，本发明所述制备方法在需要保护的那 条链前段聚合上若干个硫代三磷酸腺苷后，核酸外切酶III只能切割未保护的那条链，而保 留硫代三磷酸腺苷保护的那条链，从而制备出单链特异性探针，即核酸信号放大序列。具体 如图2所示。
[0050] 其中，所述硫代三磷酸腺苷有α-dAtp、a-dTtp、a-dGtp和α-dCtp四种，结构式分别 如下：
[0052]本发明所述核酸信号放大序列的制备方法中，所述载体为pGEM_3ZF(_)载体。序列 插入载体后，命名为pGEM-3ZF( + )-Amplifier。图谱如图3所示。
[0053]本发明所述核酸信号放大序列的制备方法中，步骤C具体为使用限制性内切酶I单 酶切载体序列产生5 '粘性末端，使用Kelnow大片段聚合酶和硫代三磷酸腺苷对5 '粘性末端 进行补平操作;再用限制性内切酶II将目的条带从载体上切除下来。
[0054] 本发明所述核酸信号放大序列的制备方法中，步骤D具体为使用核酸外切酶III对 硫代保护的双链进行单链消化，确保5 '硫代保护的序列能够转换成单链探针结构。
[0055] 本发明还提供了一种核酸信号放大的方法，将含有目的靶标的样品包被在微孔板 上，然后加入上述核酸信号放大序列杂交，之后加入报告探针杂交后加入化学发光底物读 取结果。
[0056]其中，所述核酸信号放大序列杂交的温度为50°C~55°C，所述杂交时间为40~ 50min〇
[0057] 而所述核酸信号放大的方法中，与报告探针杂交的条件为51°C~53°C反应30~ 40min〇
[0058] 本发明所述核酸信号放大的方法中所述化学发光底物可以为任何一种可以识别 报告探针的化学发光底物。在一些实施方案中，所述化学发光底物为lumi-Phos Plus。
[0059] 本发明所述核酸信号放大的方法中实验结果采用化学发光分析仪读取数据。
[0060] 进一步的，本发明所述核酸信号放大的方法还包括以核酸信号放大序列中的重复 序列为前导序列进行次级信号放大的步骤。具体构象如图4所示。
[0061] 在初级信号放大的基础上进行次级信号放大可以形成倍数的累积放大，从而进一 步提供检测的灵敏度。如初级核酸信号放大重复序列为20倍，而次级信号放大再20倍的放 大，初级加次级信号放大累积可以达到400倍放大，大大提高了检测灵敏度。
[0062] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种核酸信号放大序列及其制备方法，以及 利用该序列进行核酸信号放大的方法。本发明所述核酸信号放大序列包括一个前导序列和 一个若干倍数的重复序列构成，所述前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告 探针序列互补。本发明所述核酸信号放大序列可以通过前导序列将目的靶标捕获杂交，再 经过若干倍数的重复序列结合相应的报告探针即可实现信号放大，从而检测到目的靶标的 核酸信号。相对于PCR技术需要酶来维系杂交体系，本发明可以实现不增加检测物浓度的前 提下实现核酸物质的检测，且稳定性好，重复性高，成本低，检测流程短。
[0063] 为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊 说明，本发明所使用的试剂及仪器均为本领域常用试剂及仪器。本发明所涉及的方法均为 本领域的通用方法。其中化学发光底物为lumi-Phos Plus，购自美国Beckman Coulter Lumigen。
[0064] 实施例1、核酸信号放大序列的制备
[0065] 根据引物序列1设计前导序列，同时设计不同倍数的重复序列，并分别在前导序列 5'端加上Hindll的酶切位点，在重复序列3'端加上EcoR V的酶切位点，合成不同构象序列 后插入pGEM-3ZF(_)载体后进行克隆复制;Hindll单酶切载体序列产生5'粘性末端，使用 Kelnow大片段聚合酶和硫代三磷酸腺苷对5'粘性末端进行补平，再用EcoR V将目的条带从 载体上切除下来，核酸外切酶ΙΠ 酶切成单链DNA探针。各序列如表1所示。
[0066] 表1各序列
[0068] 实施例2、初级信号放大
[0069] 1、将lOOpmol浓度的表1中的目的靶标包被在微孔板上；
[0070] 2、按照实施例1的方法合成各序列并制备成单链探针，将合成序列1、合成序列2和 合成序列3制备的探针分别命名为预放大1、预放大2、预放大3;
[0071] 3、控制杂交温度控制在5 0 °C~5 5 °C之间，每孔加入预放大1、2、3的浓度均为 lOOpmol/yL，杂交 40 ~50 分钟；
[0072] 4、分别加入报告探针（AAAAGAATATTGGTGGTAAAGACCT-AP)，51°C ~53°C 反应 30 ~ 40min；
[0073] 5、加入化学发光底物lumi-Phos Plus(Beckman Inc.)，读取实验结果。
[0074] 其中布板设计如表2,对应数据结果如表3。
[0075]表2布板设计
[0078]表3对应数据结果
[0080]由表3结果可见，预放大1、2、3分别在背景发光值的基础上大约放大了20倍、10倍、 5倍的化学发光信号值，与预期设计是一致的。
[0081] 实施例3、次级信号放大
[0082] 在实施例2基础上再设计一种核酸信号放大序列-合成序列4,其前导序列与实施 例2合成序列的重复序列互补，合成序列4的序列具体为:AAAAGAATATTGGTGGTAAAGACCT-20X-GATATCATTTCTTGATGGC)。
[0083] 方法：
[0084] 1、将lOOpmol浓度的的表1中的目的靶标包被在微孔板上；
[0085] 2、按照实施例1的方法合成各序列并制备成单链探针，将合成序列1、合成序列2、 合成序列3和合成序列4制备的探针分别命名为预放大1、预放大2、预放大3和放大1;
[0086] 3、控制杂交温度控制在5 0 °C~5 5 °C之间，每孔加入预放大1、2、3的浓度均为 lOOpmol/yL，杂交 40 ~50 分钟；
[0087] 4、控制杂交温度控制在50°C~55°C之间，每孔加入50pmolAiL的放大1，杂交40~ 50分钟；
[0088] 5、加入报告探针(GCCATCAAGAAATGATATC-AP)，51°C ~53°C 反应 30 ~40min。
[0089] 6、加入化学发光底物lumi-Phos Plus(Beckman Inc.)，读取实验结果。
[0090] 其中布板设计如表4,对应数据结果如表5。
[0091] 表4布板设计
[0094]表5对应数据结果
[0096]由表5结果可见，预放大1、2、3与放大1分别在背景发光值的基础上大约放大了330 倍、160倍、40倍的化学发光信号值，与预期设计是一致的。
【主权项】
1. 一种核酸信号放大序列，包括一个前导序列和一个若干倍数的重复序列构成，所述 前导序列与目的靶标序列互补，所述重复序列与报告探针序列互补。2. 根据权利要求1所述的核酸信号放大序列，所述前导序列的Tm值为55°C-62°C;所述 重复序列的Tm值小于55°C。3. 根据权利要求1或2所述的核酸信号放大序列，所述前导序列5'端还包括硫代三磷酸 腺苷保护的限制性内切酶I酶切位点酶切后的片段，所述限制性内切酶I的酶切位点酶切后 为粘性末端。4. 根据权利要求1-3任意一项所述的核酸信号放大序列，所述核酸信号放大序列3'端 还包括限制性内切酶II的酶切位点酶切后的片段;所述限制性内切酶II的酶切位点酶切后 为平整末端。5. 根据权利要求1-4任意一项所述的核酸信号放大序列，所述限制性内切酶I为EcoR I、BamH I、Hind II、HindIII;所述限制性内切酶II为EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、 HalIII、HPa I、Sma I。6. 根据权利要求1-5任意一项所述的核酸信号放大序列，所述重复序列的倍数为5倍-20倍。7. 权利要求1所述核酸信号放大序列的制备方法，包括以下步骤： A、 根据目的靶标设计核酸信号前导序列和若干倍数的重复序列，并分别在前导序列5' 端加上限制性内切酶I的酶切位点，在若干倍数的重复序列3'端加上限制性内切酶II的酶 切位点;所述限制性内切酶I的酶切位点与核酸信号放大序列的前导序列相连，酶切后为粘 性末端;所述限制性内切酶II的酶切位点与核酸信号放大序列的重复序列相连，酶切后为 平整末端； B、 合成序列插入载体后进行克隆复制； C、 限制性内切酶I和限制性内切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷对限制性酶切末端进行 保护； D、 核酸外切酶III酶切获得核酸信号放大序列。8. 根据权利要求7所述的制备方法，所述载体为pGEM-3ZF (+)载体。9. 一种核酸信号放大的方法，将含有目的靶标的样品包被在微孔板上，然后加入权利 要求1-6任意一项所述核酸信号放大序列杂交，之后加入报告探针杂交后加入化学发光底 物读取结果。10. 根据权利要求9所述的方法，还包括以核酸信号放大序列中的重复序列为前导序列 进行次级信号放大的步骤。
【文档编号】C12Q1/68GK105886501SQ201610267807
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】张鹭鹭, 李先坤, 张爱国
【申请人】科蒂亚(新乡)生物技术有限公司