一种前列腺特异性抗原异构体、编码基因及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种前列腺特异性抗原异构体、编码基因及其应用，该蛋白在体外表现明显的明胶酶的活性功能，该蛋白的缺乏和减少是导致男性不育的重要因素，因此该蛋白可作为男性不育症的一个新的指标；同时缺乏该蛋白的精子不能完成受精，因此该蛋白也可作为人工辅助生殖IVF和ICSI技术选择的指标；此外该蛋白也是男性不育症的重要的药物筛选靶分子。
【专利说明】
一种前列腺特异性抗原异构体、编码基因及其应用 (一)
技术领域
[0001] 本发明涉及一种精子调控蛋白，特别涉及一种调控人类受精的新型蛋白酶、编码 基因及其应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 受精是精子与卵子融合为一个合子，从而起保证双亲遗传的关键过程。精子离开 精巢时还不具有使卵子受精的能力，还需要两个获得性的过程:一是在穿越附睾过程中精 子质膜和内部结构中的蛋白和脂类的改造;二是在穿越雌性生殖道过程中精子表面和内部 的一些修饰，称作获能。获能精子接触卵周的卵膜或透明带时，从而激发精子发生顶体反应 并有助于精子进一步穿越卵膜。受精发生在输卵管壶腹部，精子必须先穿透卵子外周的卵 丘细胞团，当与卵子相遇后，特异地与卵膜上的糖蛋白结合并且开始一系列复杂的受精活 动:精子结合到卵子表面的透明带(ZP)上;精子发生顶体反应;从顶体释放各种有利于精子 穿透透明带的水解酶;精子最后与卵子质膜融合完成受精。
[0003] 受精过程中有许多精子蛋白酶的参与，大部分属于丝氨酸蛋白酶家族，包括 Acrosin，TESP5/PRSS21及纤溶酶原激活剂等。Acrosin是一种顶体酶，其生理功能长期以来 都被认为是通过对ZP的蛋白水解作用使精子穿过透明带，然而Yamagata等的研究表明它的 缺失会导致体外实验中受精早期精子穿过透明带的延迟，精子仍能穿越透明带。TESP5/ PRSS21是另外一种精子丝氨酸蛋白酶，定位在精子膜上作为一种GPI锚定蛋白。缺失Prss21 小鼠(Prss21-/-)的附睾精子在体外实验中的受精能力严重缺陷。
[0004] 世界卫生组织已明确指出，正常育龄夫妇同居12个月以上，未采取任何避孕措施 并且有规律性生活，而仍未受孕即可诊为不育。已婚夫妇不育症发生率约15%，其中男性因 素引起的不育症占50%，称为男性不育。男性不育的首要原因是精子异常(包括弱精症、少 精症、畸精症、无精症），其次是免疫学因素、男性副性腺感染、性交及射精障碍和原因不明 的不孕等。原因不明性不孕症是指夫妇有正常性生活，女方有排卵且卵子正常，经妇科检查 及全面检查未发现异常，男方精液及其它检查均属于正常范围，但两年以上未怀孕者。也就 是说双方均未查出与不孕有关的原因。据报道，原因不明性不孕的发生率约占不孕症的25-30%且出现上升趋势(Cahill and Wardle，2002)，目前尚未有精卵正常条件下生殖障碍的 检测的分子指标。自从1978年世界上第一例试管婴儿Louis Brown在英国诞生以来(Edward et al .，1980)，辅助生殖技术已经成为目前世界上解决不孕症的主要方法和手段。临床上 辅助生殖技术中，体外受精试管婴儿技术(IVF)主要适用于由于女性因素引起的不孕症，而 单精子胞浆注射技术(ICSI)主要用于男性因素引起的不育症，通常在IVF失败条件下使用。 目前在精液常规正常情况下使用IVF还是直接使用ICSI仍无选择标准，此外，在治疗男性不 育症的药物开发上还没有明确的筛选靶向分子。 (三)
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种人精子表面调控受精的新型蛋白酶(前列腺特异性抗原异 构体PSA_h)及其编码基因，本发明通过RP-HPLC从健康人的精子中分离纯化到一种具有明 胶酶活性的蛋白，并鉴定了其氨基酸序列和DNA序列，该蛋白在体外表现明显的明胶酶的活 性功能。研究明确了该蛋白在男性的前列腺中表达，存在于前列腺、睾丸及精子表面。研究 明确了该蛋白在精卵受精过程中起到重要的调控作用，同时证实其表达量的下降或缺失导 致人受精失败，也是临床上导致男性不育的重要因素。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种前列腺特异性抗原异构体(PSA_h)，所述前列腺特异性抗原异构 体的氨基酸序列为SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本发明还提供一种所述前列腺特异性抗原异构体编码基因，所述编码基因核苷酸 序列为SEQ ID No.2所示。
[0009] 本发明涉及一种所述前列腺特异性抗原异构体在制备检测精子受精障碍试剂中 的应用，所述检测试剂是指检测待测样品前列腺特异性抗原异构体(PSA_h)表达量与标准 样品表达量（即正常人前列腺特异性抗原异构体(PSA_h)表达量）的差异，显著低于标准样 品表达量则判断为精子受精障碍。
[0010] 本发明还涉及一种所述前列腺特异性抗原异构体在制备选择体外受精或单精子 胞浆注射方法的指标分子试剂中的应用，所述指标分子试剂是指检测待测样品前列腺特异 性抗原异构体(PSA_h)表达量与标准样品表达量(即正常人前列腺特异性抗原异构体(PSA_ h)表达量）的差异，显著低于标准样品表达量则判断为可直接选择单精子胞浆注射的方法 受精。
[0011] 此外，本发明还涉及一种所述前列腺特异性抗原异构体在制备男性生殖障碍治疗 药物中的应用。
[0012] 本发明提供的一种所述前列腺特异性抗原异构体只是在蛋白水平上判断是否存 在受精障碍的一个指标，但不是最终判断是否发病的唯一指标，还需要结合临床等多因素 综合确定。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了一种调控人类受 精的新型精子蛋白酶及其编码基因，临床上该蛋白的缺乏和减少是导致男性不育的重要因 素，因此该蛋白可作为男性不育症的一个新的指标；同时缺之该蛋白的精子不能完成受精， 因此该蛋白也可作为人工辅助生殖IVF和ICSI技术选择的指标;此外该蛋白也是男性不育 症的重要的药物筛选靶分子。 (四）【附图说明】
[0014] 图1为精子洗涤前和洗涤后明胶酶活性的比较;a.精子在洗涤前后的明胶薄层分 析，箭头表示由精子蛋白酶消化产生的晕轮，标尺为2〇Mi;b.精子在洗涤前后超声破碎产物 的明胶酶谱，箭头所示为洗涤后~30kD大小处出现的酶活条带;c.精子抽提物与精浆体外 孵育后~30kD大小酶活条带消失，SE = Sperm extract(精子抽提物）；SP = seminal plasma (精浆）；
[0015] 图2为正常男性和不育男性精子抽提物明胶SDS-PAGE;箭头所示为~30kD大小处 出现的酶活条带;normal为正常男性，inf ertile为不育男性；
[0016] 图3为具有明胶酶活性的30kD蛋白的分离纯化;a.人类精子抽提物RP-HPLC色谱 图；b.VIII、IX部分的明胶活性检测;c.RP-HPLC色谱图中VIII、IX部分放大图；d.明胶-SDS-PAGE对c中各个峰洗脱后样品的活性检测；
[0017]图4为RP-HPLC多次收集的蛋白酶及其质谱测序；a.明胶-SDS-PAGE活性检测； b. SDS-PAGE，箭头所指富集的目标蛋白所在位置;c.目标蛋白的质谱测序结果，下划线表示 测得的肽段序列；
[0018] 图5为PSA与PSA_h蛋白的比较;a.氨基酸序列比较，下划线代表信号肽，星号代表 激活肽，▲代表PSA及PSA_h形成二硫键的半胱氨酸所在位置，Λ代表PSA_h不具有的半胱氨 酸，数字代表成熟肽的序号;b.PSA和PSA_h的预测三维结构比较，深色代表β折叠，浅色代表 α螺旋；
[0019] 图6为PSA_h在精子（sperm)、精衆（seminal plasma)、前列腺(prostate)、睾丸曲 精小管（testis)的定位;a.Virtual Northern blot显示PSA_h mRNA在各样品中的表达， Negative表示阴性对照，指PCR过程中只加水不加模板的对照;b.Western blot显示PSA_h 蛋白在各样品中的分布;c.PSA_h在精子上的定位，箭头所示为荧光信号在赤道板和中段， 标尺为20mi; d. PSA_h在前列腺和睾丸曲精小管的定位；
[0020] 图7为PSA_h及其C末端序列缺失突变体的真核表达和活性分析;a.两种重组蛋白 的构建简图，其中突变体为PSA_h成熟肽的N端186个氨基酸;b.两种重组蛋白在HEK293T中 的表达，信号代表CFP荧光信号，标尺为100μπι; c.细胞破碎产物的Western检测，左侧表示所 使用的一抗，右侧数字表示分子量大小；d.两种经过纯化、复性的重组蛋白明胶酶活性检 测;左侧数字表不分子量大小。
[0021 ] 图8为PSA_h抗体降低了精子对卵子的结合效率图；a.Mitotracker orange标记的 精子与HTF孵育后(-)再与卵子作用光镜图；b.Mitotracker orange标记的精子与HTF孵育 后(-)再与卵子作用焚光显微镜下精子信号；c.Mitotracker orange标记的相同浓度的精 子与PSA_h抗体孵育后(+ )再与卵子作用光镜图，d.Mi to tracker orange标记的相同浓度的 精子与PSA_h抗体孵育后(+)再与卵子作用焚光显微镜下精子信号，标尺为20μηι;
[0022] 图9为PSA_h抗体阻止了精子穿越透明带的作用图；a.用Mitotracker Green标记 经抗体处理过的精子(+，白色箭头所示），用Mitotracker Orange标记未经抗体处理的精子 (-，圆圈所示）；b.与a为同一颗卵子的不同焦距照片；c.用Mi to tracker Orange标记经抗体 处理过的精子(+，白色箭头所示），用Mi totracker Green标记未经抗体处理的精子(-，白色 圆圈所示）；d.与c为同一颗卵子的不同焦距照片；图中白色箭头均表示在透明带表面粘附 的经过抗体处理的精子，白色圆圈均表示未经抗体处理的精子在透明带内部，标尺为20μπι; [00 23]图10为PSA_h抗体对精子顶体反应率的影响；阴性对照(Negative control)为自 发顶体反应组，对照（〇〇]11：1'〇1)为用兔阴性]^6处理组，24以8/1111和192以8/1111413为用不同剂 量PSA_h抗体处理组;纵坐标表示已发生顶体反应的精子百分数，表示反应体系中未加 孕酮，"+"表示反应体系中加入了孕酮。
[0024]图11为HPLC分离的天然PSA_h对人卵透明带的作用;a. HPLC分离得到的PSA_h的明 胶活性验证，箭头所示PSA_h降解明胶的位置;b. PSA_h与5yg或0.25yg透明带蛋白作用1小 时后的带型，ZP表示透明带蛋白；c.PSA_h与5yg或0.25yg透明带蛋白作用24小时后的带型；
[0025] 图12为用Western blot比较PSA_h在体外受精正常（Fertile，8例）和体外受精失 败（Infertile，12例)精子中的表达量(a)，左侧箭头指示PSA_h或Tubulin的蛋白分子大小； IVF失败的精子仍可通过ICSI使卵子受精后的胚胎发育图；4cell:四细胞期;8cell:八细胞 期;Morula:桑椹胚(b)。 (五)【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0027] 实施例1:人类精子上新型蛋白酶的获得
[0028] 1.精液的采集及精子的获取
[0029] 所有研究对象禁欲3~7天，手淫法取精，取样容器一律选用一次性无菌取精杯，取 出精液后将其放置于37°C恒温水浴中，充分液化后（即为洗涤前精子)进行计算机辅助精液 分析仪(CASA)分析。按《WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》(第四版） 的标准洗涤充分液化后的精液，收集精子沉淀团（即洗涤后精子）。
[0030] 2.精子抽提物的制备
[0031] 对照组(Before wash)为0.5ml液化后精液直接超声，实验组(After wash)为加入 0.5ml Earle ' s培养液重悬步骤1中lml精液液化后所得精子沉淀团再进行超声，超声破碎 条件：60%功率，超声3s，间歇3s的方式在冰浴中作用lOmin，随后在12,000 Xg，4°C，离心 1 Omin。取上清液(即为精子抽提物)存于-20°C备用。
[0032] 3.精浆的制备
[0033] 待精液充分液化后，12，000 X g，25°C，离心15min。取上清液（即精浆)存于-20°C备 用。
[0034] 4.明胶薄层分析(Gelatin substrate film assay)
[0035] 精子对明胶的水解作用通过明胶薄层法进行分析，由于精子头部所含的蛋白酶对 它周围的明胶有水解作用，水解的结果使精子头部周围形成一圈较透亮的晕轮区，借助相 差显微镜可以对晕轮区大小进行观察，具体过程如下：
[0036] (1)明胶薄层的制备：
[0037] a.0.4g明胶溶解在10ml的去离子水中（4%)。
[0038] b.取40μ1均匀地涂布在载玻片上，在4 °C湿盒中水平放置24h，使明胶充分凝固。
[0039] c ·玻片在含0 · 05 %戊二醛的PBS中固定2min。
[0040] d.分别用PBS和去离子水清洗两次后，4°C存放。
[0041] (2)取40μ1的对照组和实验组的精子悬液均匀地涂布在明胶薄层上，室温下水平 放置10min。然后将此明胶板放于湿盒内，37°C反应过夜。明胶板在倒置显微镜下观察。其中 对照组为液化后精液按体积比1:4与Earle's培养液混合均匀的精子悬液，实验组为步骤1 中获得的精子沉淀团按体积比1:4与Earle's培养液混合均匀的精子悬液，两组精子密度调 成IX 106 个/ml。
[0042] 5.明胶SDS-PAGE(Gelatin-SDS-PAGE)
[0043] 在下层分离胶中加入0.1 %明胶的12.5% SDS-PAGE。15yg的精子抽提物上样，在 20mA，4 °C和非变性条件下进行电泳。电泳结束后，整块凝胶在含有2.5 % Tri ton X-100的 0.1M Tris-HCl，pH 8.0缓冲液中，在室温下平衡1.5h。凝胶用0.1M Tris-HCl，pH 8.0缓冲 液充分洗涤几次后，在含有5mM CaCl2和0.2M NaCl的Tris-HCl缓冲液中于37 °C反应过夜。 按照常规方法，凝胶用考马斯亮蓝染色，脱色。
[0044] 6.采用步骤4中明胶薄层分析的方法，将对照组和实验组精子悬液分别铺在明胶 板上，反应后观察精子对明胶的水解作用，结果表明精子经过洗涤之后具有更强的明胶降 解圈（图1中a)。同样的，将步骤2精子抽提物通过步骤5中明胶电泳的方法比较他们具有酶 活条带的差异，结果发现实验组精子抽提物在约30kD大小处出现了明显的降解条带（图1中 b)。通过将步骤3的精浆与步骤2实验组精子抽提物体外孵育30min (37 °C )后明胶SDS-PAGE 检测，我们发现精浆可以使精子30kD大小的活性条带受到显著抑制（图1中c)。
[0045] 7.采用步骤1、2、5的方法比较不育男性和正常男性的精子抽提物的活性，结果表 明，前者在30kD大小蛋白的酶活要显著高于后者（图2)。
[0046] 结论:这种30kD大小的蛋白酶在精浆中处于非活化状态，脱离精浆后才表现出活 性，并且它的活性可能对精子的正常受精起到关键作用。
[0047] 实施例2:人类精子上新型蛋白酶的分离及鉴定
[0048] 1.应用RP-HPLC，从正常人精子抽提物（实施例1方法获取）中分离纯化30kD蛋白 酶，选用的色谱柱为：Shim-pack CLC-0DS(4.6_ X 250mm);溶剂为含有0.05 %TFA的乙腈； 洗脱条件为溶剂浓度从0-65 %，60min梯度洗脱;流速为lml/min，柱温箱温度控制在28°C ; 根据出峰时间收集洗脱液于1.5ml Eppendorf管，然后置于预冷至4°C的真空浓缩仪后开始 浓缩，去除挥发性液体乙腈并不使洗脱液浓缩干;浓缩后透析于Earle ' s培养液，明胶SDS-PAGE检测截留液的活性，结果见图3。
[0049] 2.通过多次收集、浓缩、透析并检测活性，最后将样品上样于SDS-PAGE(图4中a、 b)，小心地从胶上切下目标条带后送上海中科新生命生物科技有限公司进行MALDI T0F/ TOF MS测序，序列结果见图4中c。
[0050] 结论：由图3可见，2号峰的蛋白是我们想要分离的30kD蛋白酶，具有明显的水解明 胶的活性，测序结果表明，此蛋白酶是前列腺特异性抗原(PSA)的一种异构体PSA_CRA h(以 下简写为PSA_h)，氨基酸序列如SEQIDN0.1所示，核苷酸序列为SEQIDN0.2所示。
[0051] 实施例3:蛋白三维结构预测
[0052] 将PSA(氨基酸序列如SEQ ID ^).3所示）和？3六_11的氨基酸序列进行比对（图5中 a)，和PSA-样，PSA_h具有完全相同的17个氨基酸的信号肽，7个氨基酸的激活肽和N端186 个氨基酸的成熟肽，然而C末端的序列相差甚远。在PSA的C末端序列中有两个用于形成二硫 键的半胱氨酸，而PSA_h则缺失了这两个半胱氨酸（图5中a，A表示），我们推测它可能会形 成与PSA截然不同的三维结构。目前PSA的三维结构已经解析，PSA具有两个明显的β折叠桶 结构域(Α1及Α2)。第一个结构域Α1由7个β折叠组成，第二个结构域Α2由6个β折叠和11个氨 基酸残基形成的长α螺旋组成。我们利用三维结构在线预测软件Protein Homology/ analogY Recognition Engine V 2·0(http://www.sbg.bio·ic.ac.uk/phyre2)对PSA_h进 行了预测，结果见图5中b。
[0053] 结论：由图5中b可见，PSA_h不具有结构域A2中的β折叠桶和长α螺旋结构。结果表 明PSA_h有着不同于PSA的结构，预示可能具有不同的功能。
[0054] 实施例4: PSA_h的表达特征和蛋白分布研究
[0055] 1.利用Virtual Northern blot技术检测PSA_h基因的表达情况，结果见图6中a。
[0056] 抽提精浆(实施例1步骤3制备的精浆）、精子(实施例1步骤1制备的精子沉淀团）、 前列腺组织和睾丸曲精小管的RNA，Superscript?/First-strand cDNA synthesis kit将 其逆转录后制备得到的c D N A作为扩增模板，利用引物P S A _ h _ P F : 5 ' -TCTTGACCCCAAAGAAACTT-3 ' 和 PSA_h_PR: 5 ' -CGAGCAGGTGCTTTTGCC-3 ' PCR 扩增后的产物制备 探针，而后用DIG标记。
[0057] PCR反应体系为：
[0059] 反应条件为：94°C预变性5min;94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸lmin，进 行30个循环;最后72°C延伸lOmiruPCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0060] 2.抗体的制备:在华安生物科技有限公司合成了多肽(VSHPYSQDLEGKGEWGPC，此段 序列位于PSA_h的187-203位，可区别于PSA异构体及其他基因）免疫兔子制备了多克隆抗 体。经Wes tern b lot检测，该抗体具有很高的特异性。
[0061] 3.将睾丸曲精小管和前列腺组织分别冻于液氮中，于液氮中研磨成粉末后，使用2 XProtein loading buffer溶液提取总蛋白。按照实施例1中步骤1获得的正常人洗涤后精 子沉淀团同样用2XProtein loading buffer溶液提取总蛋白，将上述三种样品充分振荡， 混匀，12，000 X g，离心1 Omin，上清即为总蛋白。精浆的样品是通过实施例1中步骤3获得的 精衆与2 XProtein loading buffer混合后制备的，用分光光度计测定蛋白浓度。通过 Western b 1 〇t的方法，确定PSA_h在精浆、精子、前列腺和睾丸曲精小管的表达，结果见图6 中b〇
[0062] 4.利用免疫荧光的方法确定PSA_h在精子上的定位，利用免疫组化的方法确定该 蛋白在前列腺和曲精小管的定位，结果分别见图6中c和6中d。
[0063] 结论：由图6可见，PSA_h在前列腺的表达量最高，在睾丸中表达量较低。在精浆或 精子上无表达;PSA_h蛋白在精子、前列腺和睾丸中均有分布，而在精浆中没有分布;PSA_h 定位于精子的赤道板和中段;PSA_h定位于前列腺的上皮细胞和睾丸曲精小管中的各种生 精细胞。表明PSA_h在生殖系统中可能发挥着某种功能。
[0064] 实施例5:PSA_h及PSA_h C末端缺失突变体(只具有1-186个氨基酸的成熟肽序列） 的真核表达
[0065] 1.真核表达质粒的构建
[0066]为了验证PSA_h蛋白是否具有明胶酶活性以及C末端的缺失是否会对整个PSA_h的 功能造成损害，我们利用真核细胞系Η E K 2 9 3 T进行重组表达。抽提前列腺组织的R N A， Superscrip?/First-strand cDNA synthesis kit将其逆转录后制备得到的cDNA作为扩增 模板，PSA_h质粒构建的正向引物wild type F:CCGCTCGAGATGCACCACCACCACCACCACATTGTGG GAGGCTGGGAGTGCGAG(5'端带有Xho頂每切位点，加粗代表引入的6 X His标签，下划线代表 PSA_h成熟肽开始序列），反向引物wild type R:CGCGGATCCcgAGGTCCCCACTCACCTTTCCC； PSA_h C末端缺失突变体的正向引物也是wild type F，反向引物mutant type R: CGCGGATCCcgCGAGCAGGTGCTTTTGCCCCCTGT(5 '端带有BamH I酶切位点），扩增产物经过双酶 切连接入含有CFP标签的真核表达载体pECFP-Nl中。质粒抽提，双酶切，DNA连接，E. co 1 i细 胞转化，测序。我们采用QIAGEN plasmid midi试剂盒提供的方法从大肠杆菌培养物中提取 适合转染细胞用的无内毒素质粒。
[0067] PCR反应体系为：
[0069] 反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸lmin，进 行30个循环;最后72°C延伸lOmiruPCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0070] 2.细胞的转染
[0071]当人胚肾上皮细胞系HEK293T汇合度达90%左右时，使用&?抑(^6116转染试剂进 行细胞转染，对于每孔(6孔板)细胞，分别取1.2yg质粒DNA(步骤1构建），4.5μ1 attractene 转染试剂稀释于100μΙ无胎牛血清的DMEM(高糖)培养基中，轻轻混匀；室温放置20min后加 入到含有10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基中。将细胞置于37°C，5%C0 2培养箱中培养18-48h后使用荧光显微镜进行观察并收集细胞。
[0072] 3.表达产物的分离纯化
[0073]由于PSA_h及PSA_h C末端缺失突变体的表达产物带His标签，我们采用Ni-NTA纯 化系统，在非变性条件下进行分离纯化。具体过程如下：步骤2中收集的HEK293T细胞用 Lysis Buffer悬浮，超声破碎仪破碎后，收集可溶性上清。将可溶性上清加到Ni-NTA中，再 置于冰箱中旋转混合器上轻微混合lh，使重组蛋白充分地与Ni-NTA相作用。500 X g，离心 20sec后，Ni-NTA用Wash Buffer充分洗涤两次，弃上清。再次500 Xg，离心20sec后，弃去微 量残留上清，Ni-NTA用Elution Buffer洗涤三次，每次500Xg，离心20sec后保留上清，上清 为含有重组蛋白的洗脱液。SDS-PAGE分析表达蛋白的分离纯化情况。
[0074] 4.pECFP-Nl_PSA_h wild及mutant的复性
[0075] 由于上述步骤3中两种重组蛋白分离纯化过程中引入了咪唑，为了排除此物质对 蛋白活性的影响，我们采用一套复性缓冲液对这些重组蛋白进行复性和天然构象的恢复。 具体过程如下：
[0076] (1)透析袋的处理：
[0077] 剪取合适长度的透析袋，分别置于溶液1(含质量浓度8%NaHC03的0.5M EDTA水溶 液，pH 8.0)和溶液2(0.5M EDTA水溶液，pH 8.0)中各煮沸lOmin，然后用去离子水彻底清 洗，备用。
[0078] (2)将步骤3中用Elution Buffer洗脱的重组蛋白洗脱液放入透析袋中，于50mM Tris-HCl，pH 8 · 0缓冲液，4°C透析过夜，以交换Buffer。
[0079] 结果见图7。
[0080] 结论:两种重组蛋白在HEK293T细胞中得到了成功地表达，重组PSA_h蛋白确实具 有明胶酶的活性，并且降解条带大小与融合蛋白大小吻合。此外，PSA_h的C末端序列缺失的 突变体蛋白也具有降解明胶的活性，表明C末端序列对维持PSA_h的明胶降解活性不是必需 的。
[0081 ]实施例6 :PSA_h的体外功能研究
[0082] 1 .PSA_h抗体对于精子结合卵子能力的影响
[0083] (1)按实施例1方法收集精液，于37 °C恒温培养箱放置30-60min以充分液化；
[0084] (2)上游法:取lml液化后的精液置于15ml的无菌锥形离心管中，在精液上方轻缓 加入1.2ml HTF培养液形成液层，倾斜45°后放入37 °C二氧化碳培养箱孵育lh使精子上游； 轻轻将试管竖直，吸取最上层0.5ml液体其中包含高活力的精子；用0.5ml HTF培养液稀释， 以500g离心5min，然后弃去上清液，获得精子团；
[0085] (3)用500μ1 HTF培养液重悬精子团，等体积分成两份，加入Mitotracker Orange 染料，37°C避光处理15min;
[0086] (4)500g离心5min，沉淀各用100μΙ HTF培养液悬浮；
[0087] (5)Mitotracker Orange标记的精子等分成两份，一份用实施例4步骤2中制备的 132μg/ml PSA_h抗体处理，另一份加入等体积的HTF培养液，轻微混合后在37°C二氧化碳培 养箱孵育lh;
[0088] (6)在孵育结束前将卵母细胞转移至20μ1预热的HTF培养液中，然后将步骤5中10μ 1 Mitotracker Orange标记并用PSA_h抗体或HTF处理的精子等体积混合到卵母细胞培养 液滴中，轻轻混合均匀；
[0089] (7)在37°C二氧化碳培养箱孵育4h，将卵母细胞转移至新鲜的HTF培养液洗涤4次 以去除非特异性结合的精子，荧光显微镜观察结果。结果见图8。
[0090] 结论:正常精子经过PSA_h抗体处理后与卵子的结合效率显著降低。
[0091 ] 2. PSA_h抗体对于精子穿透透明带的作用 [0092] (1)按照步骤1中上游法获取精子；
[0093] (2)用0.5ml HTF培养液稀释，以500g离心5min，然后弃去上清液，获得精子团；
[0094] (3)用500μ1 HTF培养液重悬精子团，等体积分成两份，分别加入Mitotracker Orange 或 Green染料，37 °C 避光处理 15min;
[0095] (4)500g离心5min，沉淀各用100μΙ HTF培养液悬浮；
[0096] (5)Mitotracker Orange标记的精子等分成两份，一份用132μg/ml PSA_h抗体处 理，另一份加入等体积的Η T F培养液，轻微混合后在3 7 °C二氧化碳培养箱孵育1 h ; Mitotracker Green标记的精子也以相同方式操作；
[0097] (6)在孵育结束前将卵母细胞转移至20μ1预热的HTF培养液中，然后将步骤(5)中 10μ1 Mitotracker Green标记并用PSA_h抗体处理的精子和Mitotracker Orange标记并用 HTF处理的精子等体积混合到卵母细胞培养液滴中，轻轻混合均匀；另一组（图9中c和d)则 是步骤（5)中10μ1 Mitotracker Orange标记并用PSA_h抗体处理的精子和Mitotracker Green标记并用HTF处理的精子等体积混合到另一颗卵母细胞培养液滴中，同样轻轻混合均 匀；
[0098] (7)在37 °C二氧化碳培养箱孵育4h，将卵母细胞转移至新鲜的HTF培养液洗涤20次 以去除非特异性结合的精子，4%多聚甲醛避光固定过夜，次日早上共聚焦显微镜观察结 果。结果见图9。
[0099] 结论:正常精子经过PSA_h抗体处理后无法穿越卵子的透明带。
[0100] 3.PSA_h对精子顶体反应的影响
[01 01 ]利用步骤1中上游法获取可育男性的精子，在含有质量浓度3.5 % BSA的HTF培养基 中放置5小时获能，随后用不含BSA的HTF培养基洗涤精子。洗涤过的精子单独与兔源IgG(对 照组）和不同剂量的PSA_h抗体（24μg/ml和192μg/ml)孵育30min，随后用15μΜ的孕酮作用 15min(阴性对照除外，阴性对照为不加孕酮的自发顶体反应组）。顶体反应的状态由FITC标 记的豌豆凝集素区分。未发生顶体反应的精子在顶体区会有明亮的染色，而已发生顶体反 应的精子荧光仅限于赤道板或无荧光信号。每组样本计数200颗精子。结果见图10。
[0102]结论:正常精子经过PSA_h抗体处理后顶体反应率也大大降低。
[0103] 4.PSA_h对透明带的降解作用
[0104] (1)透明带蛋白的获取:GV期卵子在含有体积浓度0.5%Triton X-100的50mM PBS (pH 7.4)中轻轻摇动过夜(4°〇，1500(^离心1511^11，取上清液备用。
[0105] (2)利用实施例2步骤1中通过HLPC获得的PSA_h经蛋白透析后，与透明带蛋白在37 °C、50mM roS(pH 7.4)中孵育1小时或24小时。孵育结束后，不经过煮沸步骤在非还原条件 下进行SDS-PAGE，并用银染法对蛋白条带进行染色。结果见图11。
[0106] 结论:PSA_h作为酶本身并不能降解透明带蛋白。表明PSA_h是通过调控精子顶体 反应来调节精子穿越透明带的能力的。
[0107] 实施例7: PSA_h在临床样本中的Western检测
[0108] 我们选取8例体外受精成功的男性精子和12例体外受精失败的男性精子，利用 Western blot的方法检测PSA_h量的差异。精子的处理方法为:简单洗涤之后用2 X loading buffer充分研磨，沸水中处理10min，12，000g离心10min，取上清用分光光度计定量后行 Western blot检测。检测结果见图12，b说明这些体外受精失败的精子可以通过ICSI的方法 使卵母细胞正常受精，受精卵能正常发育。
[0109] 结论：由图12可见，体外受精失败（Infertile)这组相比于体外受精成功 (Fertile)的精子样本中，PSA_h的表达量明显下降。然而这些体外受精失败的精子通过单 精子胞浆注射(ICSI)仍能使卵子正常受精，受精率为61.8%，妊娠率为53.8% (临床数据）。 表明PSA_h在临床上可以作为男性不育症筛查的一个分子Marker，蛋白的缺失并不影响精 子自身的受精能力，可以采用ICSI的方法进行临床治疗。
【主权项】
1. 一种前列腺特异性抗原异构体，其特征在于所述前列腺特异性抗原异构体的氨基酸 序列为SEQ ID No. 1所示。2. -种权利要求1所述前列腺特异性抗原异构体编码基因，其特征在于所述编码基因 核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。3. -种权利要求1所述前列腺特异性抗原异构体在制备检测精子受精障碍试剂中的应 用。4. 一种权利要求1所述前列腺特异性抗原异构体在制备选择体外受精或单精子胞浆注 射方法的指标分子试剂中的应用。5. -种权利要求1所述前列腺特异性抗原异构体在制备男性生殖障碍治疗药物中的应 用。
【文档编号】C12N9/64GK105886490SQ201610317306
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】杨卫军, 钱叶青
【申请人】浙江大学