一种优化的水稻籼粳性检测体系和方法与流程

本发明涉及一种检测体系，尤其涉及一种优化的水稻籼粳性检测体系和方法。

背景技术：

亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)分为籼稻和粳稻两个亚种。对水稻籼粳分化研究，可以从形态学标记、生化标记和分子标记等方面进行。由程侃声创立的亚洲稻籼粳亚种程式指数鉴别法(程侃声等，1984)简单易行，但受生长环境和水稻生长周期等因素限制。相比于形态学和生化方法，由于分子标记直接反映核苷酸序列上的可遗传变异，可以更加准确高效地鉴定籼粳亚种，准确揭示遗传差异。随着籼稻93-11和粳稻日本晴基因组序列测定的完成，Shen等(2004)利用生物信息学方法比对了二者的全基因组序列，构建了93-11和日本晴序列差异的数据库，其中包含了479，406个插入缺失(InDel)。通过典型的籼稻和粳稻(93-11和日本晴)DNA序列比对，根据插入缺失差异片段进行引物设计，这些标记就很可能与籼粳分化有关。已有研究利用InDel标记揭示稻属植物籼粳分化；SSR标记具有基因组分布广泛、检测技术简单和费用低等特点，也有不少研究利用该类型标记分析水稻籼粳分化。

在利用已经公布的籼粳性专一标记进行水稻籼粳属性的判别过程中，发现存在以下问题：(1)有的籼粳性标记在检测群体中容易出现偏态分布，如在粳稻群体中也出现大量的籼型条带(图1)；有些籼粳性标记的籼粳性区分性不高，如在籼稻群体中，籼型带和粳型带出现的频率几乎一样(图1)；有些籼粳性标记的多态性很高，在群体中出现多种带型，不具备籼型和粳型特异性(图1)；(2)有些标记扩增效果并不好，带型模糊；(3)虽然这些籼粳性标记的扩增产物以及产物大小差异并不一致，电泳分型所用的时间不同，但是并没有具体的电泳参考时间；(4)传统的PAGE胶电泳后，都是采用银染的方法来进行判别带型，操作过程比较繁琐耗时；(5)籼粳属性的判别只是基于与对照品种9311和日本晴的比较，存在误判的风险。因此，为了高效准确地利用分子标记来检测籼粳性，有必要参照水稻基因组中籼粳特异的序列开发一系列标记，并针对这些标记，建立一套高效准确的检测体系，涉及到扩增、电泳检测以及籼粳属性判别方法等环节。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种优化的水稻籼粳性检测体系和方法。

一种优化的水稻籼粳性检测体系，包括分子标记系统、扩增系统、电泳系统及凝胶成像系统；

所述分子标记系统用于一组籼粳专一性高的分子标记；

所述扩增系统用于进行PCR扩增；

所述电泳系统用于进行PAGE胶电泳；

所述成像系统用于成像检测带型。

一种优化的水稻籼粳性检测方法，包括以下步骤：

步骤1、设计一组籼粳专一性分子标记；

步骤2、给每对分子标记提出最适合的引物浓度，退火温度以及参考的电泳时间，用这些籼粳专一标记以15ul的扩增体系进行PCR扩增；

步骤3、PCR扩增结束后，在电压为105V的情况下，用电泳系统进行8.0％的PAGE胶电泳，电泳时间1h30min～2h40min；

步骤4、待PCR扩增以及PAGE胶电泳结束后，将PAGE胶放入纯水溶解的10^-4GoldView溶液中染色10～15min，然后用凝胶成像系统检测带型；

步骤5、根据检测带型来进行籼粳性的判别。

优选的，所述扩增系统包括：

优选的，所述扩增系统的扩增程序为：

94℃下预变性5min后；

94℃下变性30s；

51～60℃下退火30s；

72℃下延伸45s，35个循环；

最后72℃下延伸8min。

优选的，所述水稻籼粳性判别方法，包括以下步骤：首先通过聚类分析，确定籼粳属性，然后通过与籼稻和粳稻测验种的相似系数来确定籼性度，具体过程如下：将检测品系的扩增带型按照某一等位基因的有无分别赋值0和1，对所有品系的每个检测标记都统计籼性和粳性2种特征带的有无，然后用NTsys-2.1软件进行籼粳性的聚类分析，聚类分析时，先选用DICE方法计算所有品系的相似系数矩阵，再选用SHAN模块进行聚类，聚类方法为UPGMA，然后用Graphics程序作图，得到籼粳性聚类结果。

优选的，所述判别方法包含籼性度指标，具体计算公式为：Di＝Si/Si+Sj；

S_i＝∑S_Ki/N_i；S_j＝∑S_Kj/N_j；式中Di为籼性度，Si/Sj为某待测系与籼型/粳型测验种群的平均相似系数，SKi/SKj为某被测系与各籼/粳型测验种的相似系数，其中Ki/Kj＝1……Ni/Nj，Ni/Nj为籼/粳型测验种的个数；S是指采用DICE方法计算出的2个品系的相似系数。计算出的籼性度对应籼粳属性，具体标准如下：Di≤0.25则为粳，0.25<Di≤0.5则为偏粳，0.5<Di≤0.75则为偏籼，0.75<Di则为籼。

本发明提出的一种优化的水稻籼粳性检测体系，针对引物的不同特性，提出了优化的PCR扩增以及检测体系，检测带型清晰明显，体系采用GoldView水溶液中染色，代替了传统的PAGE胶银染的方法，操作过程更加简便，扩增效率和检测效率都得到了提升，本发明还提出了一种水稻籼粳性判别方法，设计的籼粳性判别标记专一性强，只出现一条籼型或粳型的特异带型，而且特异条带在籼粳群中出现的频率都在70.0％以上，特异条带在籼稻和粳稻群体中出现频率都在90.0％以上的有13对引物，本发明基于测试材料与一组籼稻测验种和粳稻测验种的比较来确定其籼粳属性的思路，提出用籼性度来衡量籼粳性，比较的结果更加客观全面。

附图说明

图1为已公布的部分籼粳性特异标记在待测品系中的扩增带型，图中的a和b分别是籼稻9311和粳稻日本晴；

图2为本发明设计的部分籼粳性专一标记在待测品系中的扩增带型，图中的a和b分别是籼稻9311和粳稻日本晴；

图3为检测品系的籼粳性聚类。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

参照图1～3，本发明提出的一种优化的水稻籼粳性检测体系，包括分子标记系统、扩增系统、电泳系统及凝胶成像系统；

所述分子标记系统用于一组籼粳专一性高的分子标记；

所述扩增系统用于进行PCR扩增；

所述电泳系统用于进行PAGE胶电泳；

所述成像系统用于成像检测带型。

一种优化的水稻籼粳性检测方法，包括以下步骤：

步骤1、选取92份籼粳(其中籼稻47份，粳稻45份，表3)做专一性标记(表1)。

表1籼粳专一标记的序列以及染色体位置

注：a物理位置是参考日本晴的序列(IRGSP-1.0)锚定的。

步骤2、给每对分子标记提出最适合的引物浓度，退火温度以及参考的电泳时间，用这些籼粳专一标记以15ul的扩增体系进行PCR扩增；所述扩增体系包括：

产物扩增用PCR仪进行，扩增程序是：

94℃下预变性5min后；

94℃下变性30s；

51-60℃下退火30s(不同引物的退火温度有变动，表2)；

72℃下延伸45s，35个循环；

最后72℃下延伸8min。

步骤3、PCR扩增结束后，用电泳系统进行8.0％的PAGE胶电泳(电压105V)，电泳时间1h30min～2h40min。

表2籼粳专一标记的退火温度，用量以及电泳检测时间

注：a合适用量是指15ul的扩增体系中引物浓度为10umol/L引物的用量；b是电泳时间是指用8％PAGE胶，Bio-Rad垂直电泳系统中用105V进行电泳可以清晰分辨籼粳带型的时间。

步骤4、待PCR扩增以及PAGE胶电泳结束后，取下PAGE胶放入10^-4Goldview溶液中染色10～15min,然后用凝胶成像系统检测带型。

步骤5、根据专一带型的频率计算公式检测带型进行籼粳性的判别，在籼稻/粳稻群中专一条带出现频率70％以上的认为是籼型/粳型条带；所用的籼粳专一标记在籼稻群和粳稻群出现的频率如下(表4，图2)。

计算专一带型的频率公式为：

籼型专一带型频率＝[2×纯合籼型条带数+籼性条带数(杂合带型)]/2×籼稻数；粳型专一带型频率＝[2×纯合粳型条带数+粳型条带数(杂合带型)]/2×粳稻数

表3用于籼粳性检测的品系

表4籼粳专一标记在籼稻和粳稻群体中出现的频率

根据统计的籼粳专一标记的带型结果，对这92份品系进行籼粳性聚类分析，聚类结果与已知的籼粳性属性完全吻合(图3)。

根据聚类图，选取10份品系(5份籼稻，5份粳稻)，分别以籼稻测验种群(华粳籼74、IR64、三黄占-2、9311)和粳稻测验种群(南洋占、IR66897B、空育131、日本晴)，对这些品系的籼性度进行了计算(表5)。

表5检测品系的籼性度及籼粳属性

注：判别标准为：Di≤0.25则为粳，0.25<Di≤0.5则为偏粳，0.5<Di≤0.75则为偏籼，0.75<Di则为籼。

本发明提出的一种优化的水稻籼粳性检测体系，针对引物的不同特性，提出了优化的PCR扩增以及检测体系，检测带型清晰明显，体系采用GoldView水溶液中染色，代替了传统的PAGE胶银染的方法，操作过程更加简便，扩增效率和检测效率都得到了提升，本发明还提出了一种水稻籼粳性判别方法，设计的籼粳性判别标记专一性强，只出现一条籼型或粳型的特异带型，而且特异条带在籼粳群中出现的频率都在70.0％以上，特异条带在籼稻和粳稻群体中出现频率都在90.0％以上的有13对引物，本发明基于测试材料与一组籼稻测验种和粳稻测验种的比较来确定其籼粳属性的思路，提出用籼性度来衡量籼粳性，比较的结果更加客观全面。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。