一种大银鱼与太湖新银鱼的分子鉴别方法与流程

本发明属于遗传学领域，涉及一种大银鱼与太湖新银鱼的分子鉴别方法。

背景技术：

中国是世界银鱼的起源地和主要分布区，在中国东部各大水系及湖泊中广泛分布。银鱼营养价值和经济价值均很高，是重要的经济鱼类，呈创造了巨大的经济效益。银鱼生活周期短、世代离散、生殖力和定居能力强。作为典型的r-对策者,银鱼对环境变化敏感且反应迅速,种群消长快。然而我国的银鱼天然资源却因围湖造田、过度捕捞、环境污染和生境破碎化等多种因素的影响而持续衰退,各种银鱼的天然资源都不同程度地下降,物种分布范围显著缩小,个别物种渐危，开展银鱼资源调查和保护工作迫在眉睫。大银鱼和太湖新银鱼是两种常见的银鱼种类，两者体色及形态相似，很难区分和鉴别。

技术实现要素：

本发明的目的是针对形态区分的困难，提供一种大银鱼与太湖新银鱼的分子遗传鉴别方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种大银鱼与太湖新银鱼的分子遗传鉴别方法，包含以下步骤：

(1)分别提取待鉴定的大银鱼与太湖新银鱼基因组DNA；

(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增大银鱼与太湖新银鱼的细胞色素b基因(Ctyb)；

(3)扩增产物纯化后，直接测序，Cytb基因第45位点碱基是T的为大银鱼，若该位点是C的为太湖新银鱼。

所述的用于PCR扩增大银鱼与太湖新银鱼的细胞色素b基因的上游引物为L14321：SEQ ID NO.1，下游引物为H15634：SEQ ID NO.2。

所述的PCR反应体系为50μL：100ng/μL的模板DNA 1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2.5IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％(g/100ml)明胶组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，经35个循环后再72℃延伸10min。

一种用于大银鱼与太湖新银鱼的分子遗传鉴别的引物对，上游引物为L14321：SEQ ID NO.1，下游引物为H15634：SEQ ID NO.2。

本发明所述的引物对在分子遗传鉴别大银鱼与太湖新银鱼中的应用。

本发明所述的引物对在制备大银鱼与太湖新银鱼分子遗传鉴别试剂中的应用。

一种大银鱼与太湖新银鱼分子遗传鉴别试剂，包含本发明所述的引物对。

所述的大银鱼与太湖新银鱼分子遗传鉴别试剂，还优选包括PCR缓冲液和dNTP混合液，所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％明胶组成。

有益效果：

本发明针对大银鱼与太湖新银鱼细胞色素b(Cytochrome b，Cytb)基因序列差异，首次以大银鱼与太湖新银鱼的细胞色素b基因全长序列作为依据，从而定性鉴别大银鱼和太湖新银鱼。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别大银鱼与太湖新银鱼，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别大银鱼与太湖新银鱼的空白，也有利于银鱼资源保护。

附图说明

图1为本发明中Cytb基因测序序列比对结果，星号标明的是从第45位点(Cytb-45)开始的碱基序列差异。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步阐明本发明，但并不是对本发明做任何形式的限定，仅仅作示例说明。

实施例1

1、引物设计

设计一对特异性PCR扩增引物，引物序列为：L14321：5'-CCAGTGA-CTTGAAAAACCACCG-3'(SEQ ID NO.1)，下游引物为H15634：5'-CTTAGCTTTGGGAGT-TAAGGGT-3'(SEQ ID NO.2)。

2、样本采集

取待鉴定的大银鱼和太湖新银鱼个体各30尾。

3、基因组DNA提取

取每尾鱼的尾鳍组织约30mg，用滤纸吸干表面水分，装入1.5ml离心管，加入420μL STE缓冲液(30mmol/L Tris-HCl，pH8.0，200mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl)。混匀后再加入浓度为10％的SDS 80μL和20mg/mL的蛋白酶K 10μL，56℃消化8-10h；加入等体积酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)抽提两次，12000r离心10min，取上清液；加入等体积氯仿：异戊醇(体积比24:1)抽提一次，12000r离心10min，取上清液；加入等体积预冷无水乙醇，12000r离心10min，弃清液；加入600mL 70％的乙醇洗涤沉淀，8000r离心10min，倒掉乙醇，干燥；加入200μL双蒸水溶解，紫外分光光度计测其OD值并稀释至100ng/μL，-20℃保存备用。

4、PCR扩增与检测

已提取的DNA为模板，用上述引物(L14321和H15634)进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL：1μL模板DNA(100ng/μL)；PCR缓冲液5μL(10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/LKCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％明胶)；dNTP混合液4μL(每种dNTP 0.1mmol/L)；上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2μL Taq酶(2.5IU)；双蒸水36μL。扩增反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，经35个循环后再72℃延伸10min。

PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120V电压下电泳30min之后，经凝胶成像分析系统确定PCR扩增产物的大小及纯度。

5、测序比对

检测后的PCR扩增产物直接送至生物公司纯化测序，获得1141bp序列，比对后可以发现Cytb基因从第45位点(Cytb-45)的碱基序列存在差异：30尾大银鱼第45位点(Cytb-45)碱基是T，30尾太湖新银鱼第45位点(Cytb-45)是C。

实施例2

按照实施例1方法，将样本扩大到大银鱼和太湖新银鱼个体各80尾，结果依然显示大银鱼细胞色素b基因第45位点(Cytb-45)碱基是T，太湖新银鱼第45位点(Cytb-45)碱基是C。