用于精准鉴定两代大豆产品转epsps基因的引物组和探针及其鉴定方法与流程

本发明涉及生物技术分析方法领域，具体涉及实时鉴定两代大豆产品转epsps基因的引物组和探针以及检测大豆产品是否含转epsps基因的方法。

背景技术：

第一代转epsps基因大豆(GTS40-3-2)于90年代研发成功并商业化种植，我国从2004年至今批准该大豆进口用作原材料加工；第二代转epsps基因大豆(MON89788)于2008年至今被我国批准进口用作原材料加工。第一、二代转基因大豆产品中epsps基因序列不完全相同，只有81％的同源性。采用以前的方法或标准只能鉴定第一代转epsps基因大豆而不能鉴定第二代转epsps基因大豆。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种实时鉴定两代大豆产品转epsps基因的引物组和探针以及检测大豆产品是否含转epsps基因的方法，主要解决现有技术不能实时鉴定大豆产品中第二代转epsps基因的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

实时鉴定大豆产品转epsps基因的引物组和探针，所述探针的序列为：5’-FAM-TCATCGAGCCGATCATGACGCG-TAMARA-3’；

所述引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分别如下：

上游引物：5'-ACACGCCCGGCATCAC-3'；

下游引物：5'-CTGCAGCATCTTTTCCGTATGA-3'。

在上述基础上，本发明还提供了利用鉴定大豆产品转epsps基因的引物组和探针检测大豆产品中是否含转epsps基因的方法，包括以下步骤：

(1)准备鉴定试剂：25.0μL PCR反应体系、含量为25ng/μL的被测大豆DNA稀释液2μl，所述25.0μL PCR反应体系包括：2×Taqman Master mix 12.5 μL、含量均为10.0μmol/L的上流引物和下流引物各1.0μl、含量为10.0μmol/L的探针0.5μL、10μL无菌蒸馏水；

(2)将2μl含量为25ng/μL的被测大豆DNA稀释液加入到25.0μL PCR反应体系的荧光定量PCR仪器上进行扩增反应。

进一步地，所述扩增反应包括以下步骤：

(a)在95℃条件下进行DNA预变性反应，时长为10min；

(b)在95℃条件下进行DNA变性反应，时长为15s；

(c)在60℃条件下退火60s；

(d)循环步骤(b)～(c)45次。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明流程简单，检测方式科学合理，操作简便。

(2)本发明所设计的引物组和探针在本发明设定的检测方法下能够准确实时地鉴定大豆制品中是否含有第一代或第二代转epsps基因，填补了现有技术只能低准确度地鉴定大豆产品中是否含有第一代转epsps基因，而不能实时鉴定大豆产品中是否含有第二代转epsps基因的空白，为消费者对转epsps基因大豆产品所享有的知情权和选择权提供了有力保障。

(3)本发明在荧光定量PCR仪器上进行扩增反应时，其结果显示，只有第一代或第二代转epsps基因大豆样品能检测到荧光信号，而空白对照和其他样品中均不能收集到荧光信号，显示本发明设计的引物组和探针序列的特异性非常高。

(4)本发明在进行灵敏度测定时，其结果显示，在100％的置信水平下，5个拷贝的epsps基因片段均能被检出，充分显示本发明在100％置信水平下具有极高的灵敏度。

附图说明

图1为本发明检测大豆产品中是否含转epsps基因方法的框图。

图2为采用本发明设计的引物组和探针检测转基因玉米、转基因水稻、第 一代和第二代转epsps基因大豆、转基因油菜以及非转基因玉米、水稻、油菜、大豆试验材料的结果示意图。

图3为采用本发明检测体系中5个拷贝的epsps基因DNA片段结果示意图。

图4为采用本发明在100％置信水平下重复40次进行灵敏度实验的结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

实施例

如图1所示，本发明主要针对大豆产品中第一代和第二代转epsps基因进行检测，具体方法如下：

首先，本发明设计了一组引物组和探针，以用于在荧光定量PCR仪器上对大豆产品中DNA进行扩增。所述的探针序列为：5’-FAM-TCATCGAGCCGATCATGACGCG-TAMARA-3’；

所述引物组包括上游引物和下游引物，二者的序列分别如下：

上游引物：5'-ACACGCCCGGCATCAC-3'；

下游引物：5'-CTGCAGCATCTTTTCCGTATGA-3'。

接着，在需要检测大豆产品中是否含转epsps基因时，主要分为两个步骤，具体如下：

(1)准备鉴定试剂：25.0μL PCR反应体系、含量为25ng/μL的被测大豆DNA稀释液2μl，所述25.0μL PCR反应体系包括：2×Taqman Master mix 12.5μL、含量均为10.0μmol/L的上游引物和下游引物各1.0μl、含量为10.0μmol/L的探针0.5μL、10μL无菌蒸馏水；

(2)将2μl含量为25ng/μL的被测大豆DNA稀释液加入到25.0μL PCR反应体系的荧光定量PCR仪器上进行扩增反应，所述的扩增反应包括以下步骤：

(a)在95℃条件下进行DNA预变性反应，时长为10min；

(b)在95℃条件下进行DNA变性反应，时长为15s；

(c)在60℃条件下退火60s；

(d)循环步骤(b)～(c)45次。

为了进一步理解本发明，现用以下实例做进一步阐述：

实例1

如图2所示，采用本发明所设计的引物组和探针对已知的转基因玉米、转基因水稻、第一代和第二代转epsps基因大豆、转基因油菜样品以及非转基因玉米、水稻、油菜、大豆样品进行检测，根据图2所示结果可知，本发明所设计的引物组和探针只能检测出大豆产品中第一代和第二代转epsps基因，特异性极高。

实例2

如图3和4所示，采用本发明对体系中含有的5个拷贝epsps基因DNA片段进行测试，测试数据如表1所示；在100％置信水平下重复40次采用本发明对反应体系中含有的5个拷贝epsps基因DNA片段进行测试，测试数据如表2所示。根据图3所示结果可知，对体系中含有5个拷贝的epsps基因DNA片段，运用本发明均能准确的鉴定出，根据图4所示结果可知，对40次重复试验共40次检测出epsps基因DNA片段。

表1本发明方法的灵敏度测试结果

表2 100％置信水平下本发明方法的灵敏度(检测下限5copies)测试数据

本发明还利用所设计的引物组和探针，并采用本发明对已知结果的100个 样品进行实时鉴定。鉴定数据及结果表3所示：

表3采用本发明实时鉴定已知结果的100个样品(表中阳性为样品中检测出第一代或第二代epsps基因)

本发明在荧光定量PCR仪器上进行扩增反应时，运用本发明设计的引物组和探针进行特异性检测，只有第一代和第二代转基因大豆样品的epsps基因能检测到荧光信号，而空白对照和其他样品中均不能收集到荧光信号，显示本发明的引物组和探针序列特异性非常高。采用本方法能够精准检测到第一代和第二代转基因大豆中epsps基因。本方法灵敏度测定结果表明，在100％的置信水平下，5个拷贝的epsps基因片段均能被检出，充分显示本发明在100％置信水平下具有极高的灵敏度。因此，本发明具备突出的实质性特点和显著进步。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护 范围之内。