本发明涉及生物
技术领域：
，具体地，涉及用于检验临床样本中活菌体的荧光PCR引物探针组及试剂盒。
背景技术：
：作为一种临床常见的疾病，细菌感染的危害性极大，严重威胁人类健康，甚至产生致命危害。其中无菌体液(血液、脑脊液、胸腹水、关节液)的感染病引起的后果更加严重，往往导致急危重症和多器官功能衰竭，如果不能快速诊断，并给予正确治疗，病死率极高。目前临床上多应用培养技术来诊断细菌感染，此方法虽然特异性高，但存在如下不足：(1)苛养菌或培养条件特别的细菌临床分离率低；(2)细胞内寄生的微生物或无法人工培养的微生物多培养阴性；(3)临床标本送检之前使用广谱抗菌药物也容易导致培养阴性；(4)大部分细菌培养需要2-3天才有结果，而一些类似真菌等缓慢生长的细菌则培养时间更长。随着分子生物学技术的发展，应用PCR(PolymeraseChainReaction)特异性扩增病原体核酸的方法已经越来越被人们所重视，然而，目前的PCR检测方法容易出现假阳性结果，出现这种结果有两方面的原因：一方面是由于DNA分子本身具有稳定性，当细菌死亡裂解后DNA仍然可以长期滞留在体内，各种核酸扩增技术在检测标本时均难以将活菌跟死菌区分开，只有活的微生物所反映出来的信息才有意义，因此当利用分子生物技术进行检测和分析时，检测和分析的主体是这些活的微生物；另一方面是检测试剂，TaqDNAPolymerase是从克隆有ThermuaquaticusDNAPolymerase基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化的，由此造成的DNA污染始终都无法避免。另外，没有内部质控易造成假阴性，这些都不利于临床诊断。相关报道使用PCR方法检测临床标本中的细菌感染，比如中国专利申请号为201310068046.2的发明专利提供了一种从临床标本中检测结核菌感染的荧光定量PCR方法，该方法对每种细菌都设计一种特异性引物，而临床病原体来源复杂，针对不同病原菌需要设计不同特异引物，限制了其临床应用价值。如文献“建立16srRNA的PCR-SBT法细菌鉴定及在败血症中的应用”(中华医院感染学杂志2015年第25卷第10期)公开了一种利用16srRNA快速鉴定败血症患者体内的细菌的PCR方法，该方法采用的是普通PCR方法，敏感度比荧光定量低，且无内部质控，无法有效判定阴性结果是否为假阴性。技术实现要素：本发明的目的是解决现有的细菌感染检测方法中存在的缺陷，提供一种快速检验临床无菌体液中活菌的实时荧光PCR试剂盒。为达到以上目的，本发明提供了用于检验样本中活菌体的荧光PCR引物探针组，其中，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探针。优选的，所述荧光PCR引物探针组还包括具有SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及含有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的探针。本发明还提供了一种样本中活菌体的荧光PCR检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：(1)用PMA孵育待测样本和荧光PCR试剂，提取待测样本的总DNA，；(2)以总DNA为模板，并使用本发明所述的引物探针组和PMA孵育后的荧光PCR试剂进行荧光PCR反应；(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；在空白对照、阳性对照和阳性内对照成立的情况下，在荧光检测通道中：a)若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；b)若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检的样本仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样本为阳性，否则为阴性；c)若样本无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增。本发明还提供了一种荧光PCR检测样本中活菌体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括本发明所述的引物探针组。另一方面，本发明还提供了如上所述的荧光PCR引物探针组在制备荧光PCR检测样本中活菌体的试剂盒中的用途。在本发明中，试剂盒利用PMA降解荧光PCR试剂和样本中死菌残留的DNA，避免了由试剂原因造成的假阳性结果的出现。该试剂盒采用特异性的引物和探针，能有效提高敏感度，在诊断使用过抗菌药物的患者标本和苛养菌感染时仍能检出细菌感染，有效避免假阴性。另外，试剂中添加了内部质控，可有效避免试剂失效或操作等造成的假阴性结果。本发明的有益效果在于：1、本发明的试剂盒可以用于临床无菌体液活菌的通用检测，在早期检验中有较高的应用价值，并且在诊断使用过抗菌药物的患者标本和苛养菌感染时，具有更好的优越性。2、本发明的细菌快速检验试剂盒灵敏度高，对细菌检测的灵敏度为5.0×10cfu/mL。3、本发明采用的试剂经过PMA处理，完全排除了受试剂影响造成的假阳性。4、体系中加入阳性内质控，在一个反应体系中完成内部质量控制。5、完全简化了反应体系的配制，也减少了PCR操作过程中可能导致的污染，节省了实验时间，达到快速检测的目的。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明提供了用于检验样本中活菌体的荧光PCR引物探针组，其中，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探针。其中，探针的5’有FAM；3’端有BHQ-1。其中，优选地，还包括具有SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的探针。其中，探针的5’有VIC；3’端有BHQ-1。SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列为以pET28a质粒为模板设计的一对引物及探针，作为检测的阳性内对照(IAC)。本发明还提供了一种样本中活菌体的荧光PCR检测方法，该方法包括如下步骤：(1)用PMA孵育待测样本和荧光PCR试剂，提取待测样本的总DNA；(2)以总DNA为模板，并使用本发明所述的引物探针组和PMA孵育后的荧光PCR试剂进行荧光PCR反应；(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；在空白对照、阳性对照和阳性内对照成立的情况下，在荧光检测通道中：a)若样本有S型扩增，且CT值小于35，则判定样本为阳性；b)若样本有S型扩增，且CT值小于40并大于等于35，则判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行复检；若复检的样本仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样本为阳性，否则为阴性；c)若样本无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，则判定为非特异性扩增。其中，每条引物的最终使用浓度各自为0.2-0.6μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.1-0.3μM。叠氮溴化丙锭(PMA)是一类对DNA具有高度亲和力光敏DNA染料，经PMA前处理后样本暴露于强光下时，PMA与DNA分子共价结合，阻断DNA分子PCR扩增。利用PMA特性，能够选择性去除试剂中死菌DNA扩增，有效避免假阳性。PMA的质量浓度是影响试验结果的一个重要因素。质量浓度过低不能全部去除试剂中死菌DNA的干扰，出现“假阳性”结果。在本发明的一种优选的实施方式中，可以通过以下方法进行PMA孵育：将PMA溶解于DMSO溶液中，制备成储备液，低温避光保存。使用时，将PMA储备液稀释为PMA工作液。在本发明的一种实施方式中，所述DMSO溶液中DMSO的浓度可以为20％。样本孵育用PMA储备液中PMA浓度为500-1000μg/ml，试剂孵育用PMA储备液中PMA浓度为5-20μg/ml。将待测样本与样本孵育用PMA溶液接触混合，其中所述样本孵育用PMA溶液包括：PMA，水，DMSO，孵育的条件包括LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照5-10min。孵育结束后，提取样本的总DNA作为荧光PCR模板。进行样本孵育的体系中PMA的工作浓度为10-20μg/ml。将荧光PCR试剂与试剂孵育用PMA溶液接触混合，其中，试剂孵育用PMA溶液包括：PMA，水，DMSO，孵育的条件包括LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照1-3min。进行试剂孵育的体系中PMA的工作浓度为0.5-10μg/ml。孵育结束后，加入10x引物探针混合液2.5μl；DNA模板5μl进行荧光PCR反应。其中，优选地，荧光PCR反应的条件包括如下步骤：a：95℃4-6min；b：95℃15-30s，c：50-60℃15-60s，b-c循环40个反应。在本发明所提供的方法中，阈值设定原则为以刚好超过正常阴性对照的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整。其中，所述待测样本可以包括但不限于血液、脑脊液、胸腹水和关节液中的至少一种。本发明的样本中活菌体的荧光PCR检测方法不用于诊断。或者说，检测结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，不属于诊断结果，但是检测结果能够作为中间信息，供临床医生参考。本发明还提供了一种荧光PCR检测样本中活菌体的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明所述的引物探针组。其中，优选地，所述试剂盒还包括5×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物探针混合物、PMA、阳性对照和超纯水。在所述试剂盒中，可以将PMA溶解于DMSO溶液中，制成储备液，所述DMSO溶液中DMSO的浓度可以为20％。样本孵育用PMA储备液中PMA浓度为500-1000μg/ml，试剂孵育用PMA储备液中PMA浓度为5-20μg/ml。另一方面，本发明还提供了如上所述的荧光PCR引物探针组在制备荧光PCR检测样本中活菌体的试剂盒中的用途。以下，通过实施例进一步详细说明本发明。实施例11、引物和探针合成：按照表1所示的序列，进行SEQIDNO.1-6的引物和探针合成。表1引物和探针序列表2、待测活菌和死菌悬液制备挑取E.coli单菌落接种于10ml的LB培养基中37℃，培养16h，高速离心(5000g，4℃，5min)收集菌体沉淀，经0.85％灭菌生理盐水洗涤2次后，重悬于生理盐水中。稀释使菌体细胞数为107cfu/ml后测定活菌数，再取部分活菌悬液95℃水浴10min，制成死菌悬液。另外，将死菌悬液在LB平板上划线，于37℃培养48h，以验证灭活效果。3、快速检验临床无菌体液细菌感染的荧光定量PCR试剂盒的组建该试剂盒由2×PCRMasterMix、DNA聚合酶、PMA工作液A(将PMA溶于20％的DMSO溶液中获得样本孵育用PMA储备液，其中PMA浓度为500μg/ml的溶液)、PMA工作液B(将PMA溶于20％的DMSO溶液中获得试剂孵育用PMA储备液，其中PMA浓度为6.75μg/ml的溶液)、10×引物探针混合液(引物及探针终浓度各自为400nM)、去离子水构成。其中，2×PCRMasterMix(TaqDNAPolymerase2U；Tris-HCl40mM(pH8.3)；KCl40mM；Tween-200.04％；(NH4)2SO410mM；MgCl28mM；dNTPs0.6mM)。4、试剂盒的操作和结果判断(1)取样本490μL，向待检样本中加入PMA工作液A10μL(使孵育体系中PMA的工作浓度为10μg/ml)，充分混匀后置于LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照5min；(2)核酸提取。分别对PMA孵育后的活菌悬液和死菌悬液进行总DNA的提取，每种样本提取得到的总DNA溶解于TE缓冲液中，浓度为1ng/μL。(3)PMA处理试剂。取12.5μl2×PCRMaster于1.5mL离心管中，加入PMA工作液B1μl(使孵育体系中PMA的工作浓度为0.5μg/ml)，充分混匀后置于LED光源(λ＝464–476nm，60W，PhASTBlue)光照3min。(4)反应体系配制。PMA处理过的2×PCRMasterMix试剂13.5μl；10x引物探针混合液：2.5μl；DNA模板：2-5μl；超纯水补至25μl。(5)PCR反应。a：95℃5minb：95℃15sc：55-60℃30sb-c循环40个反应。(6)结果分析与判定。调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过正常阴性对照的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整。质量控制：空白对照成立，且阳性内对照有扩增(VIC)，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果，否则视实验无效。结果判断：a)若样本有S型扩增(FAM)，且CT值<35，则判定样本为阳性；b)若有S型扩增(FAM)，且35≤CT值<40，判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行检测；若复检的样本仍有S型扩增，仍可以判定样本阳性。(7)试剂盒通用性试验及特异性实验选取临床常见的感染细菌(均来自CMCC)进行检测。选择蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、嗜水气单胞菌、溶血葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、奇异变形菌、液化沙雷菌、铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、黑色消化球菌作为通用性评估用菌株，选择人类基因组、念珠菌、隐球菌、腺病毒、乙型肝炎病毒作为特异性评估用菌株。应用本发明试剂盒检测这些待检细菌，阳性内对照均为阳性，证明检测系统成立；空白仅有IAC的扩增；以人类基因组、念珠菌、隐球菌、腺病毒、乙型肝炎病毒组成的混合模板无FAM通道扩增；各细菌均有FAM通道特异性扩增曲线。本实施例中以多种DNA为模板，进行了试剂盒的通用性及特异性试验，全部为有效扩增，对PCR产物克隆后测序，测序结果显示，各PCR检测到的序列与已知各细菌序列一致，表明该方法具有较好的通用性及特异性。(8)试剂盒的最低检出限试验评估用检测样本：选择大肠杆菌作为特定检测的菌株，模板梯度稀释成105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL，5.0×10CFU/mL，10CFU/mL的检测样本，进行操作和结果判断，试剂盒检测(不含IAC)的最低检出限试验结果(每个浓度做三个重复)如下表2所示：表2试剂盒最低检出限试验结果模板浓度105CFU/mL104CFU/mL103CFU/mL102CFU/mL5.0×10CFU/mL10CFU/mL实验结果+/+/++/+/++/+/++/+/++/+/+-/-/-本实施例中以大肠杆菌DNA做模板，进行了试剂盒的最低检出限试验，检测最高稀释度为5.0×10CFU/mL，表明该方法具有较高的敏感性。实施例2本实施例用于说明处理试剂时PMA的使用浓度。利用实施例1的方法进行检测，区别仅在于，在用PMA孵育荧光PCR试剂时，分别加入PMA工作液至PMA工作浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、1、5、10μg/ml。选择大肠埃希氏菌DNA(0.2ng/μl)作为对照组模板，结果显示，当PMA工作浓度≥0.5μg/ml时，空白对照无扩增且对照组有扩增，可以排除试剂中死菌DNA的干扰。实施例3本实施例用于说明处理试剂时的曝光时间。利用实施例1的方法进行检测，区别仅在于，PMA孵育荧光PCR试剂的光照时间分别为1、2、3、4、5、7.5、10min。空白对照模板为水，对照组模板为大肠埃希氏菌DNA(0.2ng/μl)。结果显示，曝光时间超过3min后，随着曝光时间的延长，Ct值变化不明显，说明光照3min，可使加入PMA分子全部分解，3min为最佳曝光时间。实施例4本实施例用于说明处理样本时PMA使用浓度。(1)抑制死菌PCR反应最小PMA浓度确定按照实施例1制备大肠埃希氏菌死菌菌悬液(105cfu/ml)取500μL，分别经PMA处理后，曝光10min，孵育体系中PMA工作浓度分别为0、1、2.5、5、10、15、20μg/ml。(2)不抑制活菌PCR反应最大PMA浓度确定按照实施例1制备大肠埃希氏菌活菌菌悬液(105cfu/ml)取500μL，分别经PMA处理后，曝光10min，孵育体系中PMA工作浓度分别为0、10、15、20、30、40、50μg/ml。利用实施例1的方法提取DNA，PCR扩增，分析结果。PMA工作浓度≤1μg/mlPMA对Ct值没有明显影响，当PMA工作浓度达到10μg/ml时，死菌细胞的PCR扩增完全被抑制。当PMA工作浓度≤20μg/ml时，对活细胞DNAPCR扩增的Ct值没有明显影响；当PMA工作浓度>20μg/ml时，扩增受到抑制。因此，当PMA工作浓度10μg/ml时，不仅有效抑制死菌扩增还远远小于可以抑制活细胞扩增的PMA工作浓度(20μg/ml)。实施例5本实施例用于说明处理样本时的曝光时间。光照时间对活菌检测准确率具有重要影响，光照时间不足，PMA不能完全分解，在后续提取过程中会与裂解活菌DNA分子结合，使PCR反应受到影响。按照实施例1制备大肠埃希死菌菌悬液(105cfu/ml)取500μL，分别经PMA(终浓度10μL/ml)处理后，分别曝光1、2、3、4、5、7.5、10min。结果显示，曝光时间超过5min后，随着曝光时间的延长，Ct值变化不明显，说明光照5min，可使加的入PMA分子全部分解，5min为最佳曝光时间。以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。、另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合、为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。当前第1页1 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