转基因大豆的检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及检测转基因大豆的一种引物组、一种 试剂盒和一种检测方法。
【背景技术】
[0002] 国际农业生物技术应用服务组织发表的《2014年全球生物技术/转基因作物商业 化发展态势》报告显示，全球转基因作物种植面积达到1. 815亿公顷，比2013年增加了 600 万公顷，转基因作物经过19年的发展，种植面积增加了 100倍以上，已成为现代农业史上采 用最为迅速的作物技术。
[0003]转基因大豆作为最重要的转基因作物之一，目前已有27个事件在26个国家中被 批准用于食物、饲料、环境释放或者种植。其中美国国内94%的大豆都是转基因大豆，巴西 的种植面积达到了 91%。虽然我国还没有批准任何转基因大豆品系进行商业化种植，但我 国已经成为转基因大豆的使用与消费大国，产品越来越多地进入了我国的食品生产与消费 链，2013年转基因大豆的进口总量已达到6000万吨。
[0004] 为了加强对农业转基因生物的安全管理，保障人体健康，规范转基因产品的销售 行为，引导和保护消费者的知情权，2002年中国农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办 法》，2006年通过了《中华人民共和国农产品质量安全法》，明确规定在中国境内销售列入标 识的转基因生物及其产品，必须进行是否含有转基因成分的标识。因此，为保护我国消费者 利益，解决贸易纠纷，必须建立一套快速、有效、准确的检测方法。
[0005]近年来，孟山都公司的抗虫转基因大豆M0N87701已陆续在美国、加拿大、日本、欧 盟、墨西哥等国家批准用于商业化种植或食用。2013年，农业部批准发放了孟山都远东有限 公司申请的抗虫大豆M0N87701可进口用作加工原料的农业转基因生物安全证书。
[0006] 目前，国内外针对抗虫转基因大豆M0N87701的检测方法主要集中在普通的定性 及定量PCR方法，这些方法都需要高端的仪器设备和专业的操作人员。本领域目前还没有 检测效果良好且操作简单、设备要求低的特异性检测转基因大豆M0N87701的方法。
[0007]LAMP技术是2000年日本荣研化学株式会社发明的一种体外恒温核酸扩增方法， 即所谓的环介导等温核酸扩增（Loop-MediatedIsothermalAmplification，简称LAMP) 技术。因其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠等优点，可以大量扩增所需的靶序 列。该方法只需要极少的试剂费用和一个水浴锅即可完成绝大多数PCR检测的过程，无论 是实验室检验还是现场检验都可以准确快速灵敏的完成，是真正普及型的核酸检测方法。
[0008]但是，目前用于LAMP检测转基因大豆M0N87701的引物的敏感性和特异性仍然不 高，无法满足实际检测的需要。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种用在环介导等温核酸扩增的引物组，该引物组具有较高 的敏感性和特异性，能够满足实际检测的需要。
[0010] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种引物组，该引物组包括外引物对、 内引物对和环引物对；其中，所述外引物对包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物； 所述外引物对包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物；所述外引物对包括SEQID NO:3和SEQIDNO:4所示的引物；所述外引物对包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示 的引物。
[0011] 另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒至少包括如上所示的引物组和 环介导等温核酸扩增试剂。
[0012] 再一方面，本发明还提供了一种检测转基因大豆M0N87701的方法，该方法至少包 括如下步骤：（1)提取待测大豆的基因组DNA作为待扩增样本；（2)使用如上所述的引物 组，以所述待扩增样本为模版，进行环介导等温核酸扩增的操作；（3)在环介导等温核酸扩 增的进行过程中通过实时荧光法检测是否具有S型扩增曲线；和/或，在环介导等温核酸扩 增结束后，通过染色和/或电泳检测扩增后的物料中是否含有特异性扩增产物；如果在环 介导等温核酸扩增的进行过程中具有S型扩增曲线，或，扩增后的物料中含有特异性扩增 产物，则指示待测大豆为转基因大豆M0N87701。
[0013] 通过上述技术方案，本发明能够通过环介导等温核酸扩增方法对转基因大豆 M0N87701实现快速、简便、灵敏且准确地检测。
[0014] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0015] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0016] 图1是实施例1中的4种引物组的扩增相同样本的扩增曲线。
[0017] 图2是实施例2中引物组1扩增不同大豆样本的实时扩增图。
[0018] 图3是实施例3中引物组1对不同转基因生物材料的实时扩增图。
[0019] 图4是实施例4中引物组1扩增不同大豆样本的染色结果图。
[0020] 图5是实施例5中引物组1扩增不同转基因生物材料的染色结果图。
[0021] 图6是实施例6中引物组1扩增不同大豆样本的电泳结果图。
[0022] 图7是实施例6中引物组1扩增不同转基因生物材料的电泳结果图。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0024] 一方面，本发明提供了一种引物组，该引物组包括外引物对、内引物对和环引物 对；其中，所述外引物对包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物；所述外引物对包括 SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物；所述外引物对包括SEQIDNO:3和SEQIDNO: 4所示的引物；所述外引物对包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物。
[0025] 具体地，本发明的引物组如表1所示：
[0026]表1
[0027]
[0028] 本发明中，如上所述的引物可以通过常规的DNA合成方法进行合成，可以通过商 业订制的方式获得上述引物。
[0029] 另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒至少包括如上所示的引物组和 环介导等温核酸扩增试剂。
[0030] 其中，如上所述的试剂盒中，所述外引物对可以以8-12ymol/L的溶液的形 式存在，所述内引物对可以以35-45ymol/L的溶液的形式存在，所述环引物对可以以 18-22ymol/L的溶液形式存在。
[0031] 其中，所述环介导等温核酸扩增试剂可以为常规的进行环介导等温核酸扩增所需 的试剂，所述环介导等温核酸扩增试剂可以包括扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。其中，所 述dNTP是指dATP、dTTP、dCTP和dGTP的等量（摩尔）混合物。其中，所述DNA聚合酶可以 为常规的能够进行环介导等温核酸扩增的DNA聚合酶，例如BstDNA大片段聚合酶等。
[0032] 其中，所述扩增缓冲液可以含有8-12mM的KCl、8-12mM的（NH4) 2S04、l-3mM的MgSO4 和0. 05-0. 2体积％的TritonX-IOO;且所述扩增缓冲液的pH值可以为8. 6-9. 0,最优选为 8. 8 〇
[0033] 其中，优选地，所述环介导等温核酸扩增试剂还包括6-10mM的MgSOjP4-8mM的 甜菜碱。
[0034] 其中，为了方便以显色的方式展示在环介导等温核酸扩增结束后的物料中是否含 有特异性扩增产物，该试剂盒还含有显色试剂，所述显色试剂可以为荧光染料SYBRGreen Io
[0035] 再一方面，本发明还提供了一种检测转基因大豆M0N87701的方法，该方法至少包 括如下步骤：（1)提取待测大豆的基因组DNA作为待扩增样本；（2)使用如上所述的引物 组，以所述待扩增样本为模版，进行环介导等温核酸扩增的操作；（3)在环介导等温核酸扩 增的进行过程中通过实时荧光法检测是否具有S型扩增曲线；和/或，在环介导等温核酸扩 增结束后，通过染色和/或电泳检测扩增后的物料中是否含有特异性扩增产物；如果在环 介导等温核酸扩增的进行过程中具有S型扩增曲线，或，扩增后的物料中含有特异性扩增 产物，则指示待测大豆为转基因大豆M0N87701。
[0036] 其中，相对于25yL的环介导等温核酸扩增反应体系，以基因组DNA的量计，待扩 增样本的用量可以为25-50ng。
[0037] 其中，特别优选地，本发明的环介导等温核酸扩增可以以如下反应体系进行：恒 温基因扩增反应体系为25yL，其中包括：F3/B3各0. 4yM、FIP/BIP各1.6yM、LF/BF各 0? 8yM、8mMMgSO4UXThermoPol缓冲液（包含：20mMTriS-HCUpH8. 8,25°C)，IOmM KCl,IOmM(NH4)2SO4, 2mMMgSO4, 0?I体积 ％TritonX-100)、6mM甜菜碱、I. 2mMdNTP、8U BstDNA大片段聚合酶，模版DNA溶液2yL。实时荧光检测需加入终浓度为IX的SYBRGreen I;显色检测需在PCR管盖内壁加1000X的SYBRGreenI溶液2yL，最后用双蒸水补足至 25uL0
[0038] 其中，特别优选地，本发明的检测方法可以按照如下方式中的至少一种进行结果 判定：（1)实时焚光法：将反应管放置在ESE-Quanttubescanner中，设置反应条件为： 63°C恒温反应60min，并在80°C反应3min。反应结束后观察ESE-Quanttubescanner软 件判断扩增结果，如果出现"S"型曲线则为阳性，无"S"型曲线则为阴性；（2)显色法：将扩 增反应后的物料与PCR管盖上的荧光染料SYBRGreenI摇动混匀，肉眼观察反应结果，若 颜色变为绿色则说明反应结果为阳性，若颜色仍为红色说明反应为结果阴性；（3)电泳法： 将LAMP扩增产物经2 %琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图为典型的LAMP阶梯条状说明反应结 果为阳性，如果无特异性条带为阴性。其中，如上所说的阳性表示待测大豆为转基因大豆 M0N87701，如上所说的阴性表示待测大豆不是转基因大豆M0N87701。
[0039] 以下，通过实施例进一步详细说明本发明：
[0040] 制备实施例1
[0041] 按照文献（赵丽娟等，环介导等温扩增技术及其应用《实验动物与比较医学》， 2014年，第2期）中的引物设计策略，设计如表2所示的引物，并通过宝生物公司进行定制 合成。
[0042]表 2
[0045] 实施例I
[0046] 将非转基因大豆（品系为黑农60,购自黑龙江省农业科学院农药种子销售中心， 以下相同）分别磨成干粉与转基因大豆M0N87701(购自AOCS公司，以下相同）的种子，然 后按照9:1的重量比混合，并且使用DNA提取试剂盒（购自康为世纪公司，以下相同）按其 说明书操作，进行DNA的提取，获得DNA浓度为15ng/ y L的模板样品。
[0047] 按照如下反应体系，进行环介导等温核酸