专利名称：人klf8基因在肿瘤治疗中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体设计人KLF8基因在肿瘤治疗中的新用途。
背景技术：
核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)作为一种基因沉默技术，可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失。目前，该技术在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研发等方面已经显示出广阔前景。siRNA被认为是RNA干扰的主要效应物，但是由于转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成的siRNA对基因表达的抑制作用一般是短暂的。临床研究中，一般采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略。目前常用的载体有逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表达系统相比于其他表达系统，具有免疫原性低、 感染效率高、感染时间长、感染效果稳定、且能感染分裂相细胞和非分裂相细胞等优点。慢病毒载体技术在国外已经发展到了临床研究阶段，是生物医药研究领域在临床肿瘤的应用技术研究的强力手段。核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)作为一种基因沉默技术，可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失。研究发现，长度为21-23个核苷酸组成的短的双链核糖核酸(dsRNA)能够在转录和转录后水平特异性的引起基因沉默(Zamore PD, Tuschl T，Sharp PA, Bartel DP. RNAi double-stranded RNA directs the ATP—dependent cleavage of mRNA at 21to 23nucleotide intervals. Cell. 2000 ；101 (1) :25-33.)。目前，该技术在基因功能研究、 肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等方面已显示出广阔前景。最新的研究发现，一种特定的由21个碱基组成的小干扰核糖核酸(siRNA)在一种直径仅为70nm的微小载体运送下经血液循环到达皮肤癌患者的癌变部位，干扰了癌细胞RRM2基因并起到治疗作用，且不引起免疫系统的排异反应(Davis ME, Zuckerman JE, Choi CH, Seligson D, Tolcher A, Alabi CA,Yen Y, Heidel JD,Ribas A.Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature.2010Apr 15 ；464 (7291) 1067-70.)。Kruppel样转录因子(Kruppel-like factors, KLF)是一类具有锌指结构的基础转录因子，以细胞和启动子特异性方式通过调控富含GC启动子的基因表达，广泛参与细胞增殖、凋亡、分化及胚胎发育、癌症发生和血管形成等生理病理过程。目前在哺乳动物中共有17个KLF成员被确认(按照发现顺序命名为KLFl到KLF17)。这些KLF因子广泛表达于各种细胞系中，在不同的细胞中发挥着重要的作用，包括心血管重建(Shindo T， Manabe I， Fukushima Y， Tobe K， Aizawa K， Miyamoto S， Kawai-Kowase K， Moriyama N， Imai Y,Kawakami H,Nishimatsu H，Ishikawa Τ,Suzuki Τ,Morita HiMaemura K,Sata Μ， Hirata Y，Komukai Μ，Kagechika H，Kadowaki Τ，Kurabayashi Μ，Nagai R. Kriippel-Iike zinc-finger transcription factor KLF5/BTEB2is a target for angiotensin IIsighaling and an essential regulator of cardiovascular remodeling. Nat Med. 2002 ； 8(8) :856-63.) > it . f= ^ (Bhattacharya R, Senbanerjee S, Lin Ζ, Mir S, Hamik A, Wang P, Mukherjee P, Mukhopadhyay D, Jain MK. Inhibition of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis by the Kruppel-Iike factor KLF2. J Biol Chem. 2005 ；280(32) :28848-51.),月中瘤发生(Rowland BD, Bernards R, Peeper DS. The KLF4 tumour suppressor is a transcriptional repressor of p53that acts as a context-dependent oncogene. Nat Cell Biol. 2005 ；7(11) :1074-82.)、内皮基因表达(Parmar KM, Larman HB, Dai G, Zhang Y, Wang ET, Moorthy SN, Kratz JR, Lin Z, Jain MK, Gimbrone MA Jr, Garcia- Cardena G. Integration of flow-dependent endothelial phenotypes by Kruppel-Iike factor 2. J Clin Invest. 2006 ；116(1) :49-58.)、糖异生(Gray S,Wang B, Orihuela Y, Hong EG, Fisch S, Haldar S, Cline Gff, Kim JK, Peroni 0D, Kahn BB, Jain MK. Regulation of gluconeogenesis by Kriippel-Iike factor 15. Cell Metab. 2007 ； 5(4) :305-12.)、单核细胞活化(Feinberg MW，Cao Z，Wara AK, Lebedeva MA, Senbanerjee S, Jain MK. Kruppel-Iike factor 4is a mediator of proinflammatory signaling in macrophages. J Biol Chem. 2005 ；280 (46) :38247-58.)和多元肝细胞分化方向(Takahashi K,Yamahaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006 ； 126 (4) :663-76.)的决定等。
作为该家族成员之一的KLF8最初是作为Kruppel样CyS2/Hi s2锌指转录因子蛋白家族的一个转录抑制蛋白而被识别的，通过与辅助抑制因子羧基端结合蛋白 (C-terminal binding protein，CtBP)相互作用抑制基因表达(van Vliet J, Turner J, Crossley Μ. Human Kriippel-Iike factor 8 :a CACCC—box binding protein that associates with CtBP and represses transcription. Nucleic Acids Res. 2000 ；28 (9) 1955-62.)。最近的研究发现，KLF8在多种肿瘤细胞系和肾细胞癌、肝细胞癌、乳腺癌、 卵巢癌等肿瘤中均过表达，在肿瘤增殖、侵袭、转移、致癌转化中发挥重要作用(Wang X， Zhao J. KLF8 transcription factor participates in oncogenic transformation. Oncogene. 2007 ；26 (3) :456-61. Wang XiZheng MiLiu GiXia WiMcKeown-Longo PJiHung MC, Zhao J. Kriippel-Iike factor 8 induces epithelial to mesenchymal transition and epithelial eell invasion.Cancer Res. 2007 ；67 (15) :7184-93. Wang X，Lu H， UrvalekAM, Li T，Yu L，Lamar J，Dipersio CM，Feustel PJ, Zhao J. KLF8 promotes human breast cancer cell invasion and metastasis by transcriptional activation of MMP9. Oncogene. 2010. Wang X, Urvalek AM, Liu J, Zhao J. Activation of KLF8 transcription by focal adhesion kinase in human ovarian epithelial and cancer cells. J Biol Chem. 200816 ；283 (20) :13934-42.) 0 其中，在肾细胞癌组织中，KLF8 的表达显著高于癌旁非肿瘤组织。KLFSsiRNA抑制人肾癌细胞系786-0的生长和侵袭，诱导GO/ Gl 期的细胞增多，促进细胞的凋亡(Fu WJ，Li JC，Wu XY，Yang ZB，Mo ZN，Huang JW，Xia GW, Ding Q，Liu KD, Zhu HG. Small interference RNA targeting Kriippel-Iike factor 8inhibits the renal carcinoma 786—Ocells growth in vitro and in vivo.J Cancer Res Clin Oncol. 2010 ; 136 (8) : 1255-65.)。在高转移性肝癌细胞及复发肝癌病人肿瘤组织中，KLF8过表达。KLF8表达上调能够促进肝癌细胞的增殖和侵袭，抑制肝癌细胞凋亡 (Li JC, Yang XR, Sun HX, Xu Y, Zhou J, Qiu SJ, Ke AW, Cui YH, Wang ZJ, Wang WM, Liu KD, Fan J. Up—regulation of Kriippel-Iike factor 8 promotes tumor invasion and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 2010 ； 139 (6) :2146-2157. el2.)。此外，发现整合蛋白FAK能够诱导KLF8表达，活化的KLF8作用于cyclinDl启动子GC盒中的A，激活cyclinDl，进而发挥其调控细胞周期的作用(Zhao J， Bian ZC, Yee K, Chen BP, Chien S, Guan JL. Identification of transcription factor KLF8as a downstream target of focal adhesion kinase in its regulation ofcyclin Dland cell cycle progression. Mol Cell. 2003 ；11 (6) :1503-15. )。KLF8 的转录后翻译受到类泛素化作用的调节，类泛素化可负调节KLF8的转录活性和细胞周期调节功能(Wei H, Wang X, Gan B, Urvalek AM, Melkoumian ZK, Guan JL, Zhao J. Sumoylation delimits KLF8 transcriptional activity associated with the cell cycle regulation. J Biol Chem. 2006 ；281 (24) :16664-71. Epub 2006Apr 13.)。上述研究阐释了 KLF8 的在恶性肿瘤的发生和发展中发挥重要的功能。然而，目前尚未有KLF8调节胰腺癌、胃癌和胶质瘤恶性增殖的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于公开与人KLF8基因相关的治疗方法及药物。本发明第一方面，公开了将人KLF8基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者将人 KLF8基因用于制备肿瘤诊断药物。人KLF8基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容其一，将人KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将人 KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。所述将人KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指将人 KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞人 KLF8基因的表达水平。所述将人KLF8基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指将人KLF8基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人KLF8基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如之后所述的人KLF8基因小分子干扰RNA即是以人KLF8基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将KLF8基因作为作用对象。所述将人KLF8基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将人KLF8基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人KLF8基因的表达相关的任一种肿瘤， 更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自人胰腺癌、胃癌和胶质瘤。所述肿瘤治疗药物可以为小分子化学药，抗体药，也可以为核酸类药物。进一步的，所述肿瘤治疗药物能降低人KLF8基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖。采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人KLF8基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗目的的。具体的，治疗时，将能有效降低人KLF8基因表达水平的物质给药于患者。进一步的，所述的能有效降低人KLF8基因表达水平的物质，包括能够特异性沉默人KLF8基因表达的小分子干扰RNA (siRNA)。该小分子干扰RNA (siRNA)可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源KLF8基因的表达的作用。进一步的，所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO :1_19之任一的序列作为特异性沉默人KLF8基因表达的靶点序列。所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO 1_19之任一的序列作为特异性沉默人 KLF8基因表达的靶点序列是指该小分子干扰RNA能与SEQ ID NO :1_19中的任一种序列所编码的mRNA片段特异性结合，并特异性沉默人KLF8基因的表达。进一步的，所述能够特异性沉默人KLF8基因表达的小分子干扰RNA(SiRNA)经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括将编码所述人KLF8基因小分子干扰RNA的DNA 片段克隆入慢病毒载体获得人KLF8基因干扰慢病毒载体，进而利用该人KLF8基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞并最终表达所述siRNA。
人KLF8基因干扰慢病毒载体为将编码所述人KLF8基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人KLF8基因小分子干扰RNA。进一步的，所述的慢病毒载体可选自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一种慢病毒载体，本发明实施例具体列举了以PGCSIL-GFP为载体。慢病毒载体可在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒。本发明第二方面，公开了一种分离的人KLF8基因小分子干扰RNA(SiRNA)靶标片段，其序列为SEQ ID NO 1-19中任意一条序列。所述分离的人KLF8基因小分子干扰RNA(SiRNA)靶标片段可应用于人KLF8基因小分子干扰RNA的筛选与制备。本发明第三方面，公开了一种人KLF8基因小分子干扰RNA(SiRNA)，能够特异性沉默人KLF8基因的表达。所述人KLF8基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO 1_19之任一的序列作为特异性沉默人KLF8基因表达的靶点序列。进一步的，所述人KLF8基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段， 所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO :1_19中之任一序列编码的RNA。所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条 RNA链上。
所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15_27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。进一步的，所述人KLF8基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，包括正义RNA片段、茎环片段和反义RNA片段，正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；其中，正义RNA片段和反义RNA片段互补，正义RNA片段的序列选自SEQ ID NO :1_19之任一。所述茎环片段结构包括6个或9个碱基。进一步的所述茎环片段的序列选自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU、CCACACC。本发明具体列举了以 UUCAAGAGA 为茎环。如实施例列举的，所述人KLF8基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO 20 =CAGC ACUGUUUAAUGACAUUUCAAGAGAAU⑶CAUUAAACA⑶GCUG。本发明第四方面，公开了一种人KLF8基因干扰核酸构建体，包含编码前述人KLF8 基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达前述人KLF8基因小分子干扰RNA。所述的人KLF8基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人KLF8基因小分子干扰 RNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述人KLF8基因干扰核酸构建体为人KLF8基因干扰慢病毒载体，为将编码所述人KLF8基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人KLF8 基因小分子干扰RNA。所述慢病毒载体可以选自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人KLF8基因干扰核酸构建体,命名为 P-KLF8-siRNA-N。进一步的，编码所述人KLF8基因小分子干扰RNA的基因片段的序列含有SEQ IDNO 1-19中之任一序列及其互补序列。本发明的人KLF8基因小分子干扰RNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗或诊断肿瘤的药物或制剂。人KLF8基因干扰核酸构建体则可用于制备所述人 KLF8基因小分子干扰RNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的人KLF8基因小分子干扰RNA 施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明第五方面，公开了一种人KLF8基因干扰慢病毒，由前述人KLF8基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生人KLF8基因小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。本发明第六方面，还公开了一种药物组合物，含有治疗有效量的人KLF8基因小分子干扰RNA或人KLF8基因干扰慢病毒。
进一步的，所述药物组合物含有1 99wt%如前所述的人KLF8基因小分子干扰 RNA或人KLF8基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。综上所述，本发明设计了针对人KLF8基因的19个RNAi靶点序列，构建相应的 KLF8RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO 7的RNAi载体P_KLF8_siRNA-N能够显著下调 KLF8基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体P-KLF8-siRNA-N能够靶向地将针对KLF8基因的RNAi序列高效导入人胰腺癌Panc-I、胃癌SGC7901细胞和胶质瘤U251细胞，降低KLF8基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的KLF8基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。本发明提供的SiRNA或者包含该SiRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人KLF8基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中KLF8 基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
图1为pGCSIL-GFP质粒DNA图谱示意图。图2表示KLF8-siRNA_N慢病毒侵染人胰腺癌Panc-Ι细胞、胃癌SGC7901细胞和胶质瘤U251细胞5天后，KLF8mRNA的表达水平示意图。图3为高内涵筛选分析仪检测KLF8-siRNA_N慢病毒侵染人胰腺癌Panc-I细胞5 天内，细胞Panc-I的增殖能力结果示意图。图4为高内涵筛选分析仪检测KLF8-siRNA-N慢病毒侵染人胃癌SGC7901细胞5 天内，细胞SGC7901的增殖能力结果示意图。图5为高内涵筛选分析仪检测KLFS-siRNA-N慢病毒侵染人胶质瘤U251细胞5天内，细胞U251的增殖能力结果示意图。图6使用klf8抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果a为胃癌，b为胰腺癌，C、d为肺癌
具体实施例方式本发明基于锌指蛋白KLF8在肿瘤组织中显著高表达，可能与肿瘤细胞的增殖、耐药和血管形成等相关的研究，认为KLF8作为一个新发现的锌指蛋白还可能参与了人胰腺癌、喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和胶质瘤的发生和发展。本发明涉及了一组针对人KLF8基因的小分子干扰RNA(SiRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人KLFSmRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述 siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源KLF8基因的表达。
发明人发现，采用RNAi方法下调人KLF8基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，表明KLF8基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对KLF8基因的siRNA，筛选出了可有效抑制KLF8的表达进而抑制人胰腺癌Panc-I细胞、胃癌SGC7901细胞和胶质瘤U251细胞增殖的siRNA，在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一系列干扰人KLF8基因的小干扰RNA(SiRNA)序列，构建了可特异性沉默KLF8基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人KLF8基因设计的小干扰RNA及 RNAi慢病毒，稳定并特异地下调KLF8基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明KLF8基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过 RNAi方式沉默KLF8基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
本发明的设计思路为
本发明通过如下方法来筛选获得一种人KLF8基因RNAi慢病毒从Genbank中调取人KLF8基因序列；预测siRNA位点；合成针对KLF8基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo ；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达KLF8 基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞^3T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默 KLF8基因的慢病毒。
基于上述方法，本发明提供了 19个干扰KLF8基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO 1-19所示)，构建了特异干扰人KLF8基因的慢病毒。
同时本发明还公开一种人KLF8基因RNAi慢病毒(KLF8_RNAi)及其制备与应用。
本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低KLF8基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，KLF8基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，KLF8基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的KLF8基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1 人KLF8基因高效干扰慢病毒的筛选与制备。
1.对人KLF8基因的有效的siRNA靶点的筛选
从Genbank调取KLF8 (NM_007250)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对KLF8基因的有效的siRNA靶点。在KLF8基因的编码序列(CDQ区域内，每隔一个碱基起始获得19或21个碱基的序列，表1列出了其中19条针对KLF8基因的有效siRNA靶点序列。
表1靶向于人KLF8基因的siRNA靶点序列CN 102533982 A
权利要求
1.人KLF8基因在制备或筛选人胰腺癌、胃癌和胶质瘤的肿瘤治疗药物，或者在制备人胰腺癌、胃癌和胶质瘤的肿瘤诊断药物中的用途。
2.一种分离的人KLF8基因小分子干扰RNA靶标片段，其序列为SEQ ID NO 1_19中任意一条序列。
3.一种人KLF8基因小分子干扰RNA，能够特异性沉默人KLF8基因的表达，所述人KLF8 基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO 1_19之任一的序列作为特异性沉默人KLF8基因表达的靶点序列。
4.如权利要求3所述人KLF8基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人KLF8基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO :1_19中之任一序列编码的RNA。
5.如权利要求4所述人KLF8基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15-27个核苷酸。
6.如权利要求5所述人KLF8基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人KLF8基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段中间由茎环片段分隔。
7.如权利要求6所述人KLF8基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述茎环片段的序列选自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
8.如权利要求3所述人KLF8基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人KLF8基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO :20。
9.一种人KLF8基因干扰核酸构建体，包含编码权利要求3-8任一权利要求所述人 KLF8基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达人KLF8基因小分子干扰RNA。
10.如权利要求9所述人KLF8基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述人KLF8基因干扰核酸构建体为人KLF8基因干扰慢病毒载体。
11.如权利要求10所述人KLF8基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述慢病毒载体选自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-tGFP、pLKO. I-CMV-Neo, pLKO. l-Neo、pLK0. l-Neo-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP, pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC-TagFP635> pLK0-puro_IPTG-lxLac0、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、 pLP2, pLP/VSV-G, pENTR/U6, pLenti6/BL0CK-iT-DEST, pLenti6-Gff/U6-laminshrna, pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6. 2/N-Lumio/ V5-Gff/lacZ 中的任一。
12.—种人KLF8基因干扰慢病毒，由权利要求9-11任一权利要求所述人KLF8基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
13.一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求3-8任一权利要求所述人KLF8基因小分子干扰RNA或权利要求12所述人KLF8基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.如权利要求13所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗人胰腺癌、 胃癌和胶质瘤之任一肿瘤。
全文摘要
本发明公开了人KLF8基因的用途及其相关药物。本发明公开了人KLF8基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的新用途。本发明还进一步构建了人KLF8基因小分子干扰RNA、人KLF8基因干扰核酸构建体、人KLF8基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人KLF8基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中KLF8基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
文档编号A61K48/00GK102533982SQ20111042598
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者孙琴, 曹跃琼, 朱向莹, 杨敏, 瞿红花, 谭畅, 金杨晟 申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司