专利名称：一种食管癌相关基因-4的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食管癌相关基因，更具体的说涉及一种食管癌相关基因-4的用途，属于生物基因工程技术领域。
背景技术：
食管癌相关基因-4 (ECRG4)最初是Bi等人识别并克隆，他们发现与正常成人食管上皮相比，食管鳞状细胞癌组织和细胞系中ECRG4的表达明显降低。因此，认为ECRG4可能是一种新的候选肿瘤抑制基因。近年来对于食管癌相关基因_4 (ECRG4)在食道癌、结肠癌、胶质瘤和前列腺癌中的研究也较多。如李林蔚等在中国医学科学院北京协和医学博士研究生学位论文中披露的一种食管癌相关基因4在食管鳞状细胞癌中的功能研究中提及的ECRG4是食管鳞状细胞癌(ESCC)的候选抑癌基因，认为启动子高甲基化可能是ECRG4在ESCC转录失活的主要机制，认为ECRG4可能是通过参与NF- κ B通路调控C0X-2的表达来发挥其抑癌功能，可以作为ESCC的潜在治疗药物。但是，现有技术中关于ECRG4的报道均是针对ECRG4在抑癌作用方面的研究，并没有报道ECRG4在预防或治疗肝炎(如丙肝)中应用的相关文献。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的问题，提供一种食管癌相关基因-4 (ECRG4)的新的用途，能够实现预防或治疗肝炎的技术效果。本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种食管癌相关基因_4的用途，所述的食管癌相关基因_4用于预防或治疗肝炎。本发明通过研究发现食管癌相关基因-4 (ECRG4)在肝炎病毒感染的患者外周血单个核细胞中低表达，进一步研究发现ECRG4基因启动子区甲基化是ECRG4在肝炎病毒感染细胞内低表达的原因。因此，本发明通过研究ECRG4对肝炎的预防或治疗作用，发现将ECRG4基因转入肝炎感染细胞，能够逆转肝炎病毒的免疫逃避，促进免疫细胞对肝炎病毒感染细胞的识别和杀伤作用，从而达到抗感染的目的，实现预防或治疗的作用。在上述的食管癌相关基因-4的用途中，作为优选，所述的食管癌相关基因_4(ECRG4)用于预防或治疗丙肝。在上述的食管癌相关基因_4的用途中，作为优选，所述食管癌相关基因_4通过克隆入真核表达质粒PCDNA3.1得到重组质粒pcDNA3.1-ECRG4后用于预防或治疗丙肝。重组质粒pcDNA3.1-ECRG4能够作为一个分子药，同样能够促使ECRG4过表达，促进免疫细胞对丙肝病毒(HCV)感染细胞的识别和杀伤作用，实现预防或治疗丙肝的效果。在上述的食管癌相关基因_4的用途中，作为优选，所述的食管癌相关基因_4(ECRG4)用于使免疫细胞识别和杀伤丙肝病毒感染细胞。综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点:
本发明的食管癌相关基因-4 (ECRG4)的新用途，与现有的将ECRG4用于抑癌的用途不同，本发明的ECRG4基因转入肝炎病毒(尤其是HCV)感染细胞后，能够逆转肝炎病毒(尤其是HCV)的免疫逃避，促进免疫细胞对肝炎病毒感染细胞(尤其是HCV感染细胞)的识别和杀伤作用，从而达到抗感染(尤其是HCV感染)的目的，实现预防或治疗肝炎的效果，优选情况下，本发明所述的ECRG4诱发免疫细胞识别和杀伤丙肝病毒(HCV)感染细胞，实现预防或治疗丙肝的效果。
图1是本发明实施例中的丙肝患者和正常人的外周血单个核细胞内的ECRG4表达的检测结果图。图2是现有的pcDNA3.1的结构示意图。图3是本发明的重组质粒pcDNA3.1-ECRG4的结构示意图。图4是本发明对照组的CTL杀伤实验检测结果图。图5是本发明实验组的CTL杀伤实验检测结果图。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
和附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。本发明的食管癌相关基因-4的用途，所述的食管癌相关基因_4 (ECRG4)用于预防或治疗肝炎。作为优选，所述的食管癌相关基因_4 (ECRG4)用于预防或治疗丙肝；更进一步的优选，通过将食管癌相关基因_4克隆入真核表达质粒pcDNA3.1得到重组质粒pcDNA3.1-ECRG4后再用 于预防或治疗丙肝。更具体的说，通过将本发明的ECRG4基因转入HCV感染细胞，逆转HCV感染细胞的免疫逃避，实现促进免疫细胞对HCV感染细胞的识别和细胞杀伤，从而达到抗HCV感染的目的，实现预防或治疗丙肝的效果。以下更进一步说明ECRG4基因能够实现预防或治疗丙肝的作用。一.丙肝患者外周血单个核细胞内ECRG4检测取20份丙肝病毒(HCV)阳性患者肝素抗凝的外周血(以健康体检的正常人外周血做对照)，将HCV患者肝素抗凝的外周血(以体检健康的正常人外周血做对照)和淋巴细胞分离液加入离心管中，采用常规的方法进行密度梯度离心分离外周血淋巴细胞，以 RIPA 缓冲液(25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM EDTA, l%Triton-X-100, 1% 脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate) , 0.1%SDS, pH7.4)裂解细胞，加入IX蛋白酶抑制剂(购买自Pierce公司，美国)，在3500r/min且控制温度在4°C的条件下进行离心IOmin,取上清。然后利用Bio-Rad分析试剂盒(购买自Bio-Rad公司，美国)来检测蛋白浓度。以ant1-ECRG4(l:400,购买自 Sigma 公司，美国)和 β-actin (1:10000，购买自 Sigma 公司，美国)为一抗，40 μ g的上样量来进行Western blot检测，检测其中ECRG4蛋白表达情况，具体分析结果如图1所示。二.HCV感染的胎肝细胞制备1.培养人胎肝细胞取冻存的人胎肝细胞，经37°C复苏后，加入含有10%胎牛血清的DMEM (购买自Gibco公司)5mL，在1000转/分钟的条件下离心5分钟，去除冻存液，加入含有10%胎牛血清的DMEM，在37°C，5%C02的条件下进行培养，得到人胎肝细胞。2.HCV感染胎肝细胞取上述培养的人胎肝细胞以I X IO5细胞/孔的浓度种入6孔培养板，以含有10%胎牛血清的DMEM为培养液，进行培养过夜,然后,加入丙肝病毒(HCV)阳性患者血清0.5ml,以正常人血清做对照，进行体外感染人胎肝细胞，并以含有10%胎牛血清DMEM补足培养液，感染4h后，弃去培养上清，采用PBS缓冲液清洗4次后，加入含有10%胎牛血清的DMEM再进行培养，分别于培养24h、48h和72h时取培养细胞采用常规的免疫组化及RT-PCR加以鉴定即可，得到感染有HCV的人胎肝细胞。三.ECRG4过表达人胎肝细胞制备1.ECRG4表达质粒构建根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)的参考序列NM_032411.2(C2orf40):以上游引物5’ -GCGGATCCCTGCCTCCCCCGCGCG-3’，和下游引物 5’ -CTAGCGGCCGCACAGCGTGTGGCAAGTCATGGT-3’为引物对，通过PCR扩增从人乳腺组织中扩增ECRG4基因片段，基因长度517bp，上述PCR扩增的条件为94°C变性5min后，进入循环程序，所述的循环程序为:94°C变性30秒，60°C退火30，72°C延伸I分钟，共循环25次，然后再在72°C延伸lOmin，得到PCR扩增产物，将PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后，再经BamHI和Notl酶切后，克隆入真核表达质粒p cDNA3.1的BamHI和Notl酶切位点，得到重组质粒pcDNA3.1-ECRG4，将该重组质粒经酶切加以鉴定,具体的重组质粒pcDNA3.1-ECRG4的结构如图2所示。2.ECRG4过表达的人胎肝细胞制备取上述感染有HCV的人胎肝细胞以I X IO5细胞/孔的浓度种入6孔培养板，以含有10%胎牛血清的DMEM为培养液，进行培养过夜，当细胞达到50%-80%融合时，在转染试剂FuGENE6(购买自Roche公司，美国)的辅助下，用质粒pcDNA3.1-ECRG4 (以空白质粒pcDNA3.1做对照)去转染。转染8h后弃去培养上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM进行培养，培养24h后用600mg/L的G418 (购买自Sigma公司)来筛选稳定转染的细胞，即ECRG4过表达的人胎肝细胞。四.ECRG4抑制丙肝病毒(HCV)感染将淋巴细胞分离液和HCV感染患者的肝素抗凝的外周血加入离心管中，然后采用常规的方法进行密度梯度离心提取HCV感染患者的外周血单个核细胞，以此细胞作为效应细胞；另外，以上述pcDNA3.1-ECRG4稳定转染的感染有HCV的人胎肝细胞为靶细胞(以转染有空白质粒的细胞做对照)，以效靶比为5:1进行细胞杀伤实验，24h后，消化所有的细胞，经PI染色后，采用流式细胞仪检测细胞杀伤情况。具体的检测结果如图4和图5所示。五.丙肝外周血单个核细胞中ECRG4启动子区的甲基化情况分析取丙肝外周血单个核细胞样本及体检健康的正常人外周血淋巴细胞标本各15个样本，提取基因组DNA,取0.5 2 μ g的DNA经EZ DNA Methylation Kit (购买自ZYMO Research公司，美国)处理后，选取ECRG4启动子区特异性引物M-C2orf40-F:5’ -TGGGTTTTYGGAATTTAGTTTG-3’ 和 M_C2orf40-R: 5’ -RATCAAAACCAAAACAACAAACC-3’ 进行 PCR扩增，PCR扩增产物经QIAquick PCR Purification Kit (购买自QIAGEN公司，美国)纯化后连入T载体(购买自上海生工生物工程有限公司)，然后，将连接产物转化ToplO感受态(Invitrogen, San Francisco, CA, USA),从每个样本随机挑取10个克隆,采用质粒提取试剂盒提取质粒并进行测序，采用常规的方法测序即可，本实施例中的测序由上海生工生物工程有限公司完成。然后分析ECRG4启动子区CpG岛，与对照相比，高于均值二倍的被认为是甲基化。测序结果显示，丙肝外周血单个核细胞中ECRG4启动子区的甲基化比例非常高，15个样本全部有不同程度的甲基化，而正常对照组则无甲基化出现，差异十分显著，P< 0.05。因此，可以看出ECRG4启动子区的甲基化是ECRG4在HCV感染细胞中低表达的原因。以下是对实验结果的具体分析，从图1中可以看出，证实了 HCV患者外周血淋巴细胞内ECRG4的表达水平明显低于正常对照，差异显著，P < 0.05。图2是现有的pcDNA3.1的结构示意图，图3是重组质粒pcDNA3.1-ECRG4的结构示意图。从图5可以看出，HCV感染患者的外周血单个核细胞对ECRG4过表达组(实验组)的杀伤比例为43.63%，显著高于图4所示的对照组的杀伤比例10.87%，P < 0.05。结果显示，重组质粒pcDNA3.1-ECRG4介导ECRG4转基因入胎肝细胞，逆 转了 HCV的免疫逃避，诱发了免疫细胞对HCV感染细胞的识别和杀伤作用，从而也说明了所述的ECRG4能够预防或治疗丙肝的效果。以上实验结果采用常规的SPSS17.0软件进行统计学分析，组间差异进行t检验。本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
权利要求
1.一种食管癌相关基因-4的用途，其特征在于，所述的食管癌相关基因-4用于预防或治疗肝炎。
2.根据权利要求1所述的食管癌相关基因_4的用途，其特征在于，所述的食管癌相关基因-4用于预防或治疗丙肝。
3.根据权利要求2所述的食管癌相关基因_4用途，其特征在于，所述食管癌相关基因_4通过克隆入真核表达质粒pcDNA3.1得到重组质粒pcDNA3.1-ECRG4后用于预防或治疗丙肝。
4.根据权利要求2-3任意一项所述的食管癌相关基因_4用途，其特征在于，所述的食管癌 相关基因_4用于使免疫细胞识别和杀伤丙肝病毒感染细胞。
全文摘要
本发明涉及一种食管癌相关基因-4的用途，属于生物基因工程技术领域。提供一种食管癌相关基因-4(ECRG4)的新的用途，所述食管癌相关基因-4用于预防或治疗肝炎，尤其用于预防或治疗丙肝。与现有将ECRG4用于抑癌的用途不同，所述ECRG4基因转入肝炎病毒(尤其是HCV)感染细胞后，能够逆转肝炎病毒(尤其是HCV)的免疫逃避，促进免疫细胞对肝炎病毒感染细胞(尤其是HCV感染细胞)的识别和杀伤作用实现抗感染(尤其是HCV感染)的目的，实现预防或治疗肝炎的效果。
文档编号A61P1/16GK103110960SQ20131007011
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者陈佳玉, 刘池波, 王海宝, 金晓燕 申请人:陈佳玉, 刘池波, 王海宝