专利名称：一种食管癌相关新基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食管癌相关基因、该基因编码的多肽、以及该基因和多肽的用途和制备方法。
利用分子生物学技术，从分子水平认识疾病的病理根源是发现或提供这些疾病的有效治疗方法的有利途径。由于现有技术中还有大量疾病没有找到有效的治疗方法，包括大部分癌症，因此迫切需要找到与这些疾病的病理相关的基因，特别是那些与这些疾病呈负相关、可能用于这些疾病的治疗的基因。
本发明的目的就是提供一种新的与食管癌负相关的基因和该基因编码的多肽。
本发明涉及一种分离的多核苷酸，其包含选自下组的成员(a)编码SEQ ID No.2所示多肽或编码CGMCC保藏号0403(cDRC2)的克隆所含cDNA所编码的成熟多肽的多核苷酸；(b)能与(a)的多核苷酸杂交并与其有至少70％一致性的多核苷酸；和(c)(a)或(b)多核苷酸的多核苷酸片段。
本发明进一步涉及含有上述多核苷酸的载体，用该载体遗传工程化的宿主细胞和包括培养该宿主细胞以表达所述多核苷酸编码的多肽并从培养物中回收目标多肽的多肽生产方法。本发明还涉及一种产生能表达多肽的细胞的方法，包括用所述载体转化或转染细胞。
本发明另一方面涉及选自下组的一种多肽(a)具有SEQ ID No.2的推定氨基酸序列的多肽或其片段、类似物和衍生物；(b)CGMCC保藏号0403的克隆所含cDNA编码的多肽或其片段、类似物和衍生物。
本发明也涉及抗上述多肽的抗体。
本发明还涉及一种体外诊断与本发明上述多肽的表达有关的疾病或疾病易感性的方法，包括在来自宿主的样品中(a)测定编码所述多肽的基因核酸序列中的突变、缺失及重排；和/或(b)测定编码所述多肽的基因核酸序列中的甲基化；和/或(c)测定编码所述多肽的基因mRNA的异常。
本发明另外涉及一种体外诊断方法，包括在来自宿主的样品中分析本发明多肽的存在或量的改变。
本发明上述的和其它的方面对于本领域的技术人员来说，从本文以下的详细描述看应该是很清楚的。
本发明一方面提供了新的多肽，它们是人食管蛋白质多肽pDRC2，及其具有生物活性的诊断或治疗有用的片段、类似物和衍生物。本发明的另一方面，提供了编码这些多肽的分离的核酸分子(DRC2)，包括mRNA、DNA、cDNA(cDRC2)和基因组DNA(gDRC2)，及其具有生物活性的诊断或治疗有用的片段、类似物和衍生物。本发明的再一方面提供了核酸的探针，它包含足够长度的核酸分子以及与DRC2基因序列进行特异性杂交的序列。
图1显示了DRC2的cDNA序列和由此推断的氨基酸序列。这里所用的是标准的氨基酸单字母缩写。用ABIPRISM*377 DNA自动测序仪(Takara公司)进行测序，测序的准确性预计高于98％。
图2是NORTHERN印迹分析的结果图。
图3是RT-PCR分析的结果图。
依据本发明的一方面，它提供了一种分离的核酸(多核苷酸)，这些核苷酸编码具有图1(SEQ ID No.2)所示的推定的氨基酸序列的多肽或者编码1999年6月23日以CGMCC保藏号0403(cDRC2)保藏的克隆cDNA编码的多肽。
编码pDRC2的多核苷酸可以从许多成人和胎儿的cDNA文库中分离，如成人食管的cDNA文库。SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列具有编码一个一个含479氨基酸残基的蛋白质的开放阅读框架。该蛋白与突变的人红细胞膜糖蛋白(GenBank No.2909821)N-端具有最高程度的同源性，在连续的309个氨基酸中有55％的氨基酸相同，71％的氨基酸类似。与正常的人红细胞膜糖蛋白(GenBank No.2909819)N-端在连续的422个氨基酸中有48％的氨基酸相同，64％的氨基酸类似。
本发明的多核苷酸可能以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。DNA可以是双链或者单链的，单链也可以是编码链或者非编码(反义)链。编码多肽的编码序列可以与图1(SEQID No.1)所示的编码序列相同，也可以与所保藏的克隆的编码序列相同，或者可以是一个不同的编码序列，由于遗传密码的冗余或简并性，它与图1(SEQ ID No.2)的或者保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图1(SEQ ID No.2)的多肽或者由保藏的cDNA编码的多肽的多核苷酸可以包括仅仅是成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和任意的另外编码序列及非编码序列，例如内含子或成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端非编码序列。
由此，术语“编码一种多肽的多核苷酸”包括仅含有该多肽编码序列的多核苷酸，也包括含有额外编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明进一步涉及上面所描述的多核苷酸的各种变体，它们编码含有图1(SEQ ID No.2)所示的推定的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的多核苷酸变体。
所以，本发明包括了编码图1(SEQ ID No.2)所示的相同多肽或者保藏克隆的cDNA所编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及这样的多核苷酸的变体，这些变体编码图1(SEQ ID No.2)所示的多肽或保藏克隆的cDNA所编码的多肽的片段、类似物或衍生物。这些核苷酸变体包括缺失变体、置换变体和附加或插入变体。
正如上面所提到的，该多核苷酸可能具有作为图1(SEQ ID No.1)所示的编码序列或保藏序列的天然存在的等位基因变体的编码序列。据本领域所知，一个等位基因变异体是一种发生了一个或多个核苷酸取代、缺失或添加的多核苷酸序列的替代形式，它基本上并不改变所编码的多肽的功能。
本发明的多核苷酸也可能含有与标记序列在同一读框中相融合的编码序列，标记序列帮助本发明多肽的纯化。标记序列在使用细菌宿主时可以是pQE载体的六聚组氨酸标记，以利于融合有标记的成熟多肽的纯化，或者使用哺乳类宿主(如猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系)时，标记序列可以是一种血细胞凝集素(HA)标记。HA标记相当于由流感血细胞凝集素蛋白衍生的一个表位(Wilson等Cell 37767，1984)。
“基因”一词指产生多肽链中涉及的DNA片段，它包括编码区域之前和之后的区域(前导和尾部)及各编码片段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
本发明的全长基因的DNA片段可以用作cDNA文库的杂交探针去分离出全长的cDNA和分离出其它与该基因序列高度类似或生物学功能相似的cDNA。这种类型的探针优选具有至少具有30个碱基，例如包含50或者更多的碱基。这种探针也可以用来鉴定相应于全长的转录物的cDNA克隆和包含调节和启动子区域、外显子及内含子的完整基因的基因组克隆。筛选的一个例子是，利用已知的DNA序列合成一个寡核苷酸探针去分离基因的编码区域。序列与本发明的基因互补的标记的寡核苷酸用于筛选人类cDNA、基因组DNA或mRNA文库，确定与探针杂交的成员。
本发明进一步涉及与上述序列杂交的多核苷酸，这两个序列间至少有70％，优选至少90％，更优选至少95％的一致性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。这里所用的术语“严格条件”意味着两序列之间有95％，优选至少97％一致性才能发生杂交。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽基本保持了与图1的(SEQ ID No.1)或保藏的cDNA编码的多肽相同的生物功能或活性。
另一选择是，与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸至少含20个碱基，优选至少30个碱基，更优选至少50个碱基并且具有上面所描述的一致性，可以保留或不保留活性。例如，这样的多核苷酸可以用作为SEQ ID No.1多核苷酸的探针；又如，可以用于多核苷酸的回收或者作为一种诊断探针或PCR引物。
这样，本发明涉及与编码SEQ ID No.2多肽的多核苷酸有至少70％的一致性，优选至少90％，更优选至少95％的一致性的多核苷酸及其片段，这些片段至少有30个碱基，优选至少有50个碱基；还涉及这些多核苷酸编码的多肽。
这里所提及的保藏保持是在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约条件下。这些保藏仅仅是本领域的技术人员的便利准备的，并不是承认根据中国专利法实施细则第25条需要保藏。保藏材料中所含有的多核苷酸序列和多核苷酸编码的氨基酸序列引入本文以供参考，当对本文序列描述有任何争议时用于核实。
本发明进一步涉及具有图1(SEQ ID No.2)所示推定氨基酸序列或者具有保藏的cDNA所编码的氨基酸序列的多肽及其片段、类似物和衍生物。
图1(SEQ ID No.2)所示或保藏的cDNA所编码的多肽的“片段”、“衍生物”和“类似物”指能基本保留该多肽的生物学功能或活性的多肽。由此，类似物包括了蛋白原，蛋白原被切去一部分后被激活，产生一个有活性的成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
图1(SEQ ID No.2)所示的或保藏的cDNA所编码的多肽的片段、衍生物和类似物可以是(i)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基所取代(优选是保守的氨基酸残基)，取代的氨基酸残基是或不是由遗传密码所编码的氨基酸；或(ii)一个或多个氨基酸残基带有取代基团；或(iii)成熟多肽与另一化合物融合在一起，如提高多肽半寿期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)另外的氨基酸与成熟多肽相融合，诸如帮助纯化成熟蛋白的序列或蛋白原序列等。从这些公开内容看，这样的片段、衍生物和类似物相信处于本领域技术人员的知识范围内。
本发明的多肽和多核苷酸优选是以分离的形式提供并被纯化到均一的程度。
“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。
本发明的多肽包括SEQ ID No.2所示的多肽(特别指成熟多肽)，也包括与SEQ ID No.2多肽至少有70％相似性(优选是70％一致性)的多肽，优选至少有90％相似性(优选是90％的一致性)的多肽，更优选至少有95％相似性(优选是95％一致性)的多肽，也包括这些多肽的一些部分，通常这些多肽部分至少含有30个氨基酸、优选至少50个氨基酸。
如本领域所知，两个多肽的相似性是通过比较一个多肽与另一多肽的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代而决定的。
本发明多肽的片段或部分可以用于经肽合成产生相关的全长多肽。因此，这些片段可作为产生全长多肽的中间体。本发明多核苷酸的片段或部分可以用来合成本发明的全长多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明多核苷酸的载体、带有本发明载体的遗传工程宿主细胞和依靠重组技术产生本发明多肽的方法。
宿主细胞是用本发明的载体进行遗传工程化(转导、转化或转染)的，载体可以是一个克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒粒子、噬菌体等等。工程化的宿主细胞能在为适于活化启动子、筛选转化子或扩增DRC2基因而改变的传统营养培养基上培养。培养条件诸如温度、pH等与被选择的细胞原来所用的表达条件一致，对于本领域普通技术人员来说是很明显的。
本发明的多核苷酸可以用来经重组技术产生多肽。例如，该多核苷酸可以存在于一系列用于表达多肽的表达载体中的任一载体上，这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA结合的载体、病毒DNA、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及伪狂犬病毒。不过，只要能在宿主中复制和存活，其它载体也可以利用。
合适的DNA序列可以通过许多方法插到载体中。通常，DNA序列用本领域中已知的方法插入到合适的限制性内切酶位点上。这些方法相信处于本领域技术人员的知识范围内。
表达载体中的DNA序列被有效地与一个合适的表达控制序列(启动子)连在一起，从而指导mRNA的合成。下面提到的是这种启动子的代表LTR或SV40启动子、大肠杆菌的Lac或trp启动子、λ噬菌体的PL启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒中基因表达的其它启动子。表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以具有增强表达的合适序列。
此外，表达载体优选包含能提供表型特征的一个或多个选择标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选，例如真核细胞的培养可用二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，大肠杆菌则可用四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述合适的DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。
下面列举的是合适宿主的代表细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系)或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等等。从这些讲授看，合适宿主的选择应该在本领域技术人员的知识范围内。
特别值得提及的是，本发明也包括含上面概括性描述的一个或多个序列的重组构建体。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，其中正向或反向插入了本发明的一个序列。在此实施方案的一个优选方面，该构建体还包含调节序列，例如启动子，它被有效地连接到该序列上。对于本领域技术人员来说，许多载体和启动子都是已知的，并可通过商业途径获得。下面列举几种载体。细菌的pQE-70、pQE-60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不过，只要是能在宿主中复制和存活，其它质粒或载体也可应用。
启动子区域可以利用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择标记的载体从想要的基因中选择出来。pKK232-8和pCM7是两个合适的载体。特称的细菌启动子包括LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白I。合适载体和启动子的选择应在本领域普通的技术水平之内。
在另一实施方案中，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，比如哺乳类细胞，或者是低等真核细胞，比如酵母细胞，还可以是原核细胞，比如细菌细胞。将构建体导入宿主细胞的方法有磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔或基因枪方法。
宿主细胞中的构建体能够通过传统的方法产生重组序列编码的基因产物。另一途径是，可用传统的肽合成仪合成本发明的多肽。
在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA，也可以用无细胞翻译体系产生这种蛋白质。适合于原核和真核宿主的克隆和表达载体Sambrook等人已在《分子克隆实验指南》(第二版，冷泉港出版社，纽约，1989)中进行了描述。
在高等真核生物中，编码本发明多肽的DNA的转录可以通过在载体中插入一增强子序列而被提高。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有大约l0-300bp，作用于启动子，提高它的转录。例如，SV40的位于复制起点后侧100-270bp处的增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包含复制起点和用于转化宿主细胞的选择标记，例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，还包含从高效表达基因而来的启动子，从而介导下游结构序列的转录。这些启动子可以从编码糖酵解酶的操纵子中得来，诸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α因子、酸性磷酸酶或热休克蛋白。异源的结构序列以适当的方位与翻译起始和终止序列以及其它优选的序列装配在一起。可选择的情况是，异源的序列可以编码一个融合蛋白，该蛋白含有一个N末端确认肽，表现出预期的特征，例如所表达的重组产物的稳定化和提纯简化。
细菌适用的有效表达载体这样来构建将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号被插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。载体应包含一个或多个表型选择标记和复制起点，复制起点保证了载体在宿主中能保留下来，更理想的是能使载体得到扩增。适于转化的原核宿主有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单孢菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种细菌，其它的宿主也可以被选择。
作为一个代表性的但非限定性的例子，细菌适用的有效表达载体包括一个选择标记和细菌的复制起点，它衍生于从商业途径获得的、具有众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件的质粒。这些商业化的载体包括诸如pKK223-3(Pharmacia)和pGEM1 (Promega)等。pBR322的“骨架”部分与合适的启动子和被表达的结构序列组合在一起。
在转化合适的宿主菌株和宿主菌株生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。
通常用离心的方法收获细胞，用物理或化学的方法破碎细胞，将粗提物保留以进一步纯化。用于表达蛋白的微生物细胞可以用任何便捷的方法破碎，包括冻融循环、超声波、机械破碎，或者使用细胞溶解剂，这些方法都是本领域的技术人员熟知的。
各种哺乳动物细胞的培养系统也能用于表达重组蛋白。哺乳类表达系统的例子有Gluzman(Cell 23175，1981)所描述猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，及其它的能表达相容载体的细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点、适当的启动子、增强子及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传元件。
多肽可以从重组细胞培养物中回收和纯化出来，回收和纯化的方法有硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。形成成熟蛋白的完整构象需要蛋白质的再折叠步骤。高效液相层析(HPLC)应用于最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是纯化的天然产物，也可以是化学合成的产物，还可以从原核或真核宿主(例如，培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞)经重组技术产生。根据重组生产方法中所用的宿主不同，本发明中的多肽可能被糖基化或不被糖基化。该多肽也可能具有起始的甲硫氨酸残基。
本发明中的多核苷酸和多肽可用作研究试剂和材料，以发现人类疾病的治疗和诊断方法。
这种多核苷酸和其编码的多肽也用于体外的相关科学研究、DNA合成和DNA载体的制备，还用于设计治疗和诊断人类疾病的方法。
全长DRC2基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，从而分离出全长的基因和与之有高度序列相似性或相似生物学活性的其它基因。这种类型的探针一般至少有20个碱基。但是，这些探针优选至少有30个碱基并且一般不超过50个碱基，尽管它们可以具有更多的碱基。该探针也可以用于鉴定相应于全长转录物的cDNA克隆或具有完整基因，包括调节和启动子区域、外显子及内含子的基因组克隆。筛选的一种方法是，利用已知的DNA序列合成一个寡核苷酸探针，用它去分离出基因的编码区域。序列与本发明的基因互补的标记的寡核苷酸可用于筛选人类cDNA文库、基因组文库、mRNA文库，以确定文库中哪些成员与探针杂交。
本发明还涉及以DRC2基因产物作为检测与DRC2的核酸序列突变或甲基化相关的疾病或对疾病的易感性的诊断方法的构成部分。这些疾病与本发明的DRC2基因的mRNA及编码的蛋白质表达不足有关，例如肿瘤和癌症。
可以用各种技术在DNA的水平上检测出DRC2基因突变的个体。用于诊断的核酸可以从病人的细胞中获得，例如血液、尿液、唾液、活组织检查和尸体解剖材料。基因组DNA可以直接用于检测，也可以在检测分析前用PCR(Saiki et al.Nature 324163-166，1986)进行酶法扩增。RNA或cDNA也可用于同样目的。例如，与编码DRC2基因的核酸互补的PCR引物可用来鉴定和分析DRC2基因的突变。例如，从扩增产物的大小与正常基因型相比发生的变化中可以检出缺失和插入突变。将扩增的DNA与放射性标记的DRC2 RNA杂交可检测点突变，或者使用放射性标记DRC2反义DNA序列来杂交。用RNA酶A消化或从熔解温度的不同可以区分完全配对的序列与错配的双螺旋。
通过检测DNA片段在含有或不含有变性剂的凝胶中的电泳迁移率的变化，可以进行基于DNA序列差异的遗传学测试。小序列的缺失和插入可以从高分辨率的凝胶电泳中看出。例如，不同大小的DNA片段可以在变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中区别出来。含有点突变的DNA序列与正常的DNA序列分别变性后在不含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中可因构象的不同(泳动速度不同)而区别开来。
核酸酶保护实验可以揭示特定位置的序列变化，比如RNA酶和S1酶保护法或者化学断裂法(例如，Cotton等PNAS 854397-4401，1985)。
本发明也涉及用于检测各种组织中DRC2基因的DNA甲基化的诊断方法。DNA水平的甲基化可以直接导致基因mRNA转录的改变，也可以通过引起基因组的不稳定、从而引发基因突变而改变基因的正常转录。DNA甲基化可以采用Herman(PNAS 939821-9826，1996)描述的甲基化特异性PCR方法进行检测总之，特异DNA序列可以用下述方法检测杂交、RNA酶保护、化学断裂、直接DNA测序或使用限制性内切酶(例如，限制片段长度的多态性RFLP)及基因组DNA的Southern印迹技术。
除了较传统的凝胶电泳和DNA测序方法外，突变还可用原位分析检测出来。
本发明也涉及用于检测各种组织中DRC2基因的mRNA表达异常的诊断方法。mRNA水平的变化可用逆转录PCR(RT-PCR)、Northern Blot、DotBlot或RNA原位杂交等方法进行检测。这些方法对于本领域的技术人员来说，从本文的公开看应该是很清楚的。
本发明还涉及用于检测各种组织中DRC2基因蛋白水平改变的诊断方法，与正常对照组织样品相比，DRC2基因蛋白的减少可检测疾病或对疾病易感性的存在(如肿瘤)。测定宿主样品中DRC2基因蛋白水平的方法是本领域技术人员熟知的，包括放射性免疫测定法、竞争性结合测定法、Western印迹分析、酶联免疫吸附法和夹心测定法。酶联免疫吸附法(ELISA)(Coligan等.Current Protocols in Immunology Vol.1，No.2，Chapter 6，1991)要预先准备对DRC2抗原的特异性抗体，优选是单克隆抗体。另外，还要准备抗单克隆抗体的报告抗体。报告抗体上连有一个可检测的试剂，诸如放射性、荧光或辣根过氧化物酶。从宿主取得样品并在一个固相载体上温育，例如聚苯乙烯反应板，它能吸附样品中的蛋白。然后用一种非特异性蛋白如牛血清白蛋白(BSA)温育，覆盖板上任何游离的蛋白结合位点。第二步，加入单克隆抗体在板中温育，这时，单克隆抗体与附着在聚苯乙烯反应板上的DRC2基因蛋白结合。所有未结合上的单克隆抗体用缓冲液洗去。与辣根过氧化物酶相连的报告抗体此时加入板中，结果报告抗体就与结合在DRC2抗原上的单克隆抗体相结合。未结合上的报告抗体也被洗掉。然后加入过氧化物酶的底物，在一定的时间内所形成的颜色的深浅与标准曲线作比较，就能测出一定体积的病人样品中DRC2基因蛋白的含量。
竞争测定法也使用于这项检测。将DRC2抗原的特异性抗体连到一个固相载体上，然后让标记的DRC2和从宿主获得的样品一起通过固相载体并检测标记物的数量，例如用液相闪烁色谱，标记物的数量与样品中的DRC2的数量相关。夹心测定法类似于酶联免疫吸附法。在夹心测定法中，DRC2通过固体载体，与吸附在固相载体上的抗体结合。第二种抗体又结合到DRC2上。第三种抗体是被标记的并对第二种抗体有特异性，当它通过固相载体时就结合到第二种抗体上，然后检测它的数量。
pDRC2多肽及其具有生物活性的诊断或治疗有用的片段、类似物和衍生物可以与药学可接受载体一起在组合物中使用，下面将对此进行描述。
pDRC2多肽及其具有生物活性的诊断或治疗有用的片段、类似物和衍生物可以与合适的药物载体结合使用。这样的组合物中包括有效治疗剂量的多肽和药学可接受的载体或赋形剂。这样的载体有一但并不限制于一盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。配制品应该适合给药方式。
本发明也提供了一种药物包装或试剂盒，包括一个或多个装有一种或多种本发明的药物组合物的成分的容器。另外，这些多肽及其具有生物活性的诊断或治疗有用的片段、类似物和衍生物也可与其它的治疗化合物组合使用。
这些药物组合物可用一种方便的方式给药，诸如表皮、静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮下、鼻内或真皮内途径。这些药物组合物以治疗和/或预防具体适应症的有效剂量使用。
根据本发明，pDRC2多肽可经体内表达而使用，通常称之为“基因治疗”。
例如，病人的细胞可以在离体情况下用一个编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)工程化，再将工程化的细胞供给待治疗的病人。这样的方法是本领域中大家所熟悉的。例如，可以用包含编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒进行细胞工程化。
同样，用本领域所知的方法可以在体内工程化细胞以体内表达多肽。如本领域中所知，用于产生含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞可以注入病人体内，使体内细胞工程化并在体内表达该多肽。从本发明的讲授看，这些以及其它的多肽给药方式对于本领域技术人员是很清楚的。例如除了逆转录病毒外，还有别的用于工程化细胞的表达载体，例如腺病毒，把它与一个合适的运输载体结合后可在体内工程化细胞。
可以衍生出上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括-但并非限制于-Moloney鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳斯氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和哺乳动物肿瘤病毒。一个实施方案是逆转录病毒质粒载体可衍生于Moloney小鼠白血病病毒。
载体包含一个或多个启动子。可使用的合适启动子包括-但并非限制于-逆转录病毒的LTR、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子(MillerBiotechniques，Vo1.7，No.9，pp980-990，1989)或其它启动子(例如，细胞的启动子，比如真核细胞的启动子有-但不限制于一组蛋白、polIII、β-肌动蛋白的启动子)。其它可用的病毒启动子有-但不限制于-腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。从这里的讲授，本领域技术人员将对合适启动子的选择很清楚了。
编码本发明多肽的核酸序列在相应启动子的控制之下。合适的启动子包括，但不限制于，腺病毒的启动子，比如腺病毒主要晚期启动子；或异源启动子，比如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞体病毒(RSV)启动子；可诱导的启动子，比如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，比如单纯性疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒的LTR(包括上面所描述的修饰的逆转录病毒的LTR)；β-肌动蛋白启动子；及人生长激素启动子。也可以是控制编码该多肽的基因的自身启动子。
用逆转录病毒质粒载体转导包装细胞系而形成生产细胞系。用于转染的包装细胞包括，但不限制于，PE501、PA317、Ψ-2、Ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、GP+E-86、GP+envAM12和DNA细胞系，如Miller所描述(Human Gene Therapy Vol.1，pp5-14，1990)，可参考全文。可用本领域的已知方法用载体转导包装细胞系。这些方法包括，但不限制于，电穿孔、使用脂质体和磷酸钙沉淀。一种可选择的方法是将逆转录质粒载体包裹进脂质体中或与脂类偶联，然后注入宿主中。
生产细胞系产生具感染性的逆转录病毒颗粒，此病毒颗粒中包含编码这些多肽的核酸序列。这样的逆转录病毒载体颗粒可用于体外或体内转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可用于转导的真核细胞包括，但不限制于，胚胎干细胞、胚胎癌细胞、造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
多肽及其片段、衍生物或类似物或表达它们的细胞可用作免疫原以产生其抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。本发明也包含了嵌和的、单链的和人源化的抗体以及Fab片段、或Fab表达文库的产物。本领域已知的各种方法可用于这样的抗体和片段的产生。
所产生的抗本发明序列相应的多肽的抗体可通过直接将多肽注射给动物或将多肽导入动物(最好不是人)而获得。所得到的抗体可与多肽本身结合。用这种方法，甚至用只编码一个多肽片段的序列也能产生结合整个天然多肽的抗体。然后，抗体可用来把多肽从表达它的组织中分离出来。
制备单克隆抗体可以用连续细胞系培养产生抗体的技术。例如，用杂交瘤技术(Kohle＆MilsteinNature 256495-497，1975)、Trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等.Immunology Today 472，1983)和EBV-杂交瘤技术产生人的单克隆抗体(Cole等MonoclonalAntibodles and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Incpp77-96，1985)。
单链抗体产生技术(美国专利4，946，778)适用于产生本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。转基因动物也可用来表达本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。
本发明将在下面的实施例中进一步描述。但是本发明并不局限于这些实施例。所有的份和量，除非另有说明都按重量计。
为便于理解下面的实施例，先解释一些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”的命名用一小写的p，在前面和/或后面接大写的字母和/或数字。出发质粒可从商业获得，也可在不受限制的基础上公开获得，或者按已公布的方法从可获得的质粒构建。另外，所描述质粒的等价质粒在本领域中已知，对于一般的技术人员来说是很清楚的。
DNA的“消化”指用限制酶对DNA进行催化性切割，限制酶只作用于DNA序列的特定位点。这里所用的各种限制酶可从商业获得，它们的反应条件、辅助因子和其它的要求按照一般技术人员所知的应用。为了分析需要，通常在大约20μl的缓冲溶液中加入1μg质粒或DNA片段和大约2个单位的酶。为了分离DNA片段用于质粒构建，通常在一个较大的的体积中用20到250个单位的酶消化5到50μg的DNA。生产厂家会指明对特异限制酶合适的缓冲液和底物的量。通常所用的温育时间大约是37℃一个小时，但根据厂家的指示可以有所改变。限制性消化之后直接在聚丙烯酰胺胶上进行电泳，分离出想要的片段。
根据所切割成的片段大小进行分离可用8％的聚丙烯酰胺凝胶(Goedde等.Nucleic Acids Research 84057，1980)。
“寡核苷酸”指能化学合成的单链多脱氧核糖核苷酸或两条互补的多脱氧核糖核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不含有5’端磷酸，所以如果没有在激酶作用下用ATP加上一个磷酸，它就不能与另一个寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有被脱磷酸化的片段连接。
“连接”指在两个双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程。除非提供了别的方法，连接可以在已知的缓冲液和条件下进行，即每0.5mg约等摩尔量的用于连接的DNA片段加10个单位的T4 DNA连接酶(“连接酶”)。
除非另有说明，转化均用Graham＆Van der EbVirology 52456-457，1973中所描述的方法进行。
实施例1cDRC2的克隆用Trizol(Gibco)试剂按说明书分别提取手术切除的食管癌标本及切端正常组织(病理切片证实无癌细胞)的总RNA，用无RNase活性的DNase消化以去除残留的基因组DNA。紫外分光光度仪定量后，各取3mg总RNA在20ml体系中进行逆转录，反应条件为1 X PCR缓冲液，2.5mMMgCl2，10mM DTT，500mM dNTPs，10mM GTl5N(N代表A，G和C)，Superscript Ⅱ逆转录酶200单位(Gibco)，42℃保温60分钟后，所得cDNA于-20℃保存。
取0.5mlcDNA在20ml反应体系进行如下差异显示PCR(DD-PCR)1XPCR缓冲液，1．5mMgCl2，200mM dNTPs，1mM 10-mmer随机引物(Operon)，3mM GT15N (N代表A，G和C)，Taq酶(Gibco)1单位。PCR循环参数为95℃预变性1分钟，95℃ 15秒，39℃ 4分钟，72℃ 2分钟4个循环后，95℃ 15秒，39℃ 2分钟，72℃ 1分钟再进行35个循环后，72℃延伸5分钟。PCR反应在PE9600 PCR系统中进行。
DD-PCR产物以食管癌和切端正常组织相临泳道上样，于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中电泳，用硝酸银染色后可见清晰的条带。切下正常组织泳道可见、癌组织泳道缺少的差异带作为模板，按上述DD-PCR条件进行二次扩增，扩增产物用Wizard PCR Preps DNA PurificationSystem (Promega)直接回收，克隆于pGEM-T Easy载体(Promega)，用ABIPRISM*377 DNA自动测序仪进行测序。由此获得cDRC2的3’端序列。
根据测序结果合成引物，用Marathon cDNA RACE System(Clontech)钓取cDRC2的5’上游序列，克隆测序后与上述3’端序列拼接。再根据拼接后的序列两端合成引物，用PCR方法扩增cDRC2全长cDNA，进一步克隆测序加以验证。结果，获得了含有SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的质粒pGEM-T Easy，含有该质粒的大肠杆菌菌株DH5α已于1999年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京中关村，100080)保藏，保藏号为CGMCC 0403。
实施例2DRC2基因的Northern印迹和RT-PCR分析以克隆的cDRC2 3’端序列为探针，用Primer-a-Gene随机引物标记试剂盒对探针进行α-32P-dATP/dCTP标记。将食管癌和切端正常组织RNA转移至尼龙膜并固定，用标记的探针与之进行Northern杂交，鉴定克隆的cDNA片段确实来自PAGE胶上所切的带(即切端正常组织表达，食管癌不表达)同时估计DRC2基因的RNA大小。Northern印记的结果如图2所示，图中T1、T2代表食管癌组织，N1、N2代表癌旁组织。
按照cDRC2 3’端序列合成引物，扩大标本量进行逆转录PCR(RT-PCR，α-Tubulin用作内对照)分析，RT-PCR分析的结果见图3。图中上边一行代表α-Tubulin对照，下边一行代表DRC2。T代表食管癌组织，N代表癌旁组织，A、B代表食管癌细胞系。根据cDRC1在所有切端正常组织标本均有PCR产物、而在大多数食管癌标本缺少PCR产物的结果，判断cDRC2是与食管癌发生相关的基因。
实施例3DRC2的细菌表达和纯化编码pDRC2的cDNA序列用PCR扩增，所用的寡核苷酸引物与cDRC2核酸序列的5’和3’末端相应。另外的与DRC2基因相应的核苷酸也分别加入到5’和3’末端序列中。5’端寡核苷酸引物的序列是5’-CGGCCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3，(SEQ ID No.3)，它包含一个NcoI限制酶切位点(斜体)，接着是DRC2编码序列的17个核苷酸(划线部分)，从cDRC2开放阅读框序列的第5个核苷酸开始。ATG密码子包含在NcoI位点中。在ATG之后的那个密码子中，第一个碱基来自NcoI位点，剩下的两个碱基与cDRC2开放阅读框序列的第5-6核苷酸一致。3’端序列为5'-CCCGGATCCACCTGCCCTGGGAGCCTA-3’(SEQ ID No.4)，它包含一个BamHI位点(斜体)，接着是包含基因终止密码子的特异序列的18个核苷酸(下划线部分)。这些限制酶切位点与细菌表达载体pQE-60(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA)上的限制酶切位点一致。pQE-60编码抗生素抗性(ampr)、一个细菌复制起点(ori)一个IPTG调节的启动子操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-His标记和限制酶切位点。然后用NcoI和BamHI消化pQE-60。将扩增的序列连到pQE-60中，插入到编码组氨酸标记和RBS序列的框架中。用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)，所用的方法在Sambrook等著的《分子克隆实验指南》(第二版，冷泉港实验室出版社，1989)中有描述。M15/rep4含有多拷贝的pREP4质粒，该质粒表达LacI抑制因子，也表现卡那霉素抗性(Kanr)。转化子在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上鉴定，选择能生长的抗性菌落。分离出质粒DNA并用限制性分析确认。让含有想要的构建体的克隆在补有Amp(100mg/ml)和Kan(25m／ml)的LB液体培养基中过夜生长(O／N)。再将O／N培养物以1∶100到1∶250的比率接种到大的培养液中。让细胞生长到最佳密度O.D.600在0.4到0.6之间。然后加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代砒喃半乳糖苷)。IPTG通过使LacI抑制因子失活而进行诱导，清理P/O导致基因表达增高。再让细胞生长3到4小时。通过离心收获细胞。将细胞沉淀溶解在6M的pH5.0盐酸胍中。澄清之后，在允许包括6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，用镍螯合柱层析从溶液中纯化出溶解的DRC2(Hochuli et al.J chromatography 411177-184，1984)。用6M盐酸胍将DRC2(纯度＞98％)从柱上洗脱下来。除去盐酸胍使蛋白质复性可用几种方案达到(Jaenicke＆RudolphProtein Structure-A Practical Approach，IRL Press，NewYork，1990)。首先，用分步透析除去盐酸胍。或者，将从镍螯合柱上分离下来的纯化的蛋白结合到另一个柱上，这个柱有一线性降低的盐酸胍梯度。结合到这个柱上时蛋白质就可以复性了，然后用含有250mM咪唑、150mM NaCl、25mM Tris-HCl pH7.5和10％甘油的缓冲液洗脱下来。最后，用含有5mM碳酸氢铵的储存缓冲液对可溶性蛋白进行透析。
实施例4重组DRC2在COS细胞中的表达表达质粒DRC2 HA衍生自载体pcDNAI/Amp(Invitrogen，Inc.)，其包括1)SV40复制起点；2)氨苄青霉素抗性基因；3)大肠杆菌复制起点；4)CMV启动子，后接一个多克隆位点区域、一个SV40内含子和多聚腺苷化位点。编码整个DRC2及其3’末端同框融合的一个HA标记的DNA片段被克隆进载体的多克隆位点区域，重组蛋白在CMV启动子的支配下表达。HA标记是前面描述过的流感血细胞凝集素蛋白(Wilson等Cell37767，1984)的一个表位。HA标记融合到靶蛋白上便于用识别HA表位的抗体检出重组蛋白。
下面是质粒的构建策略编码pDRC2的cDNA序列用双引物PCR构建5’端引物为5’-CCCAAGCTTCAGCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’(SEQ ID No.5)，它包含一个HindIII限制酶切位点(斜体)，接着是DRC2编码序列的25个核苷酸(下划线部分)，ATG密码子为位于HindIII位点后的第5-7碱基。3’端序列是5’-CCCTCTAGACCTCACCTGCCCTGGGAGCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA-3，(SEQ ID No.6)，它包含一个XbaI位点(斜体)、DRC2基因编码序列后22个核苷酸(划线部分，最后3碱基为终止密码子)和HA标记。所以PCR产物包含一个HindIII位点、DRC2的完整编码序列、紧接的融合在同一个框架的HA标记、DRC2的翻译终止密码子及其后19碱基的非编码序列、一个XbaI位点。将PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp用HindIII和XbaI限制性内切酶进行消化并连接起来。用连接混合物转化大肠杆菌菌株SURE(Stratagene，Inc.)。将转化物铺在氨卞青霉素平板上，选择抗性菌落。从转化子中分离出质粒DNA，并用限制性分析检查是否出现了正确的片段。为了表达重组DRC2，通过DEAE-葡聚糖方法(Sambrook等分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，1989)用表达载体转染COS细胞。DRC2-HA蛋白的表达可用放射性标记和免疫沉淀法检测(Harlow＆Lane抗体实验室手册，冷泉港实验室出版社，1988)。转染后两天用35S-半胱氨酸标记细胞8小时，然后收集培养液，用去污剂裂解细胞(RIPA缓冲液150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mM Tirs，pH7.5)。用一种HA特异的单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养液，再用SDS-PAGE分析沉淀蛋白。
实施例5用杆状病毒表达体系克隆和表达DRC2编码全长DRC2蛋白的DNA序列用PCR扩增，寡核苷酸引物与基因的5’和3’端序列一致5’端引物序列是5’-CCCGGATCCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’(SEQ ID No.7)，它包含一个BamHI限制酶切位点(斜体)，接着是DRC2编码序列的21个核苷酸(下划线、部分)，ATG密码子为位于BamHI位点后的第1-3碱基。3’端序列是5’-CCCGGTACCTCACCTGCCCTGGGAGCCTA-3’(SEQ ID No.8)，它包含一个Asp781位点(斜体)，接着是包含终止密码子的DRC2基因20个核苷酸特异序列(下划线部分)。扩增的序列用一个商业上可得到的试剂盒(Qiagen，Inc.)从1％琼脂糖凝胶中分离出来。用内切酶BamHI和Asp781消化该片段，然后再次在1％琼脂糖凝胶上纯化。该片段被指定为F2。
载体pRGl(pVL941载体的修饰物)被用于杆状病毒表达体系中的DRC2蛋白的表达(Sumers＆Smith杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册，1987)。此表达载体包括苜蓿Y纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子及其后的限制性内切酶BamHI和Asp781的识别位点。猴病毒SV40的多腺苷酸化位点被用于高效多腺苷酸化。为了便于选择重组病毒，在多角体蛋白启动子的同一方向插入了大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，后面跟着多角体蛋白基因的多腺苷酸化信号。多角体蛋白序列两侧是病毒序列，用于与共转染的野生型病毒DNA进行细胞介导的同源重组。许多其它的杆状病毒载体可代替pRGl，例如pAc373、pVL941和pAcIM1等。
用限制酶BamHI和Asp781消化质粒，然后用小牛小肠磷酸酶经本领域已知的方法去磷酸化。用商业所获得的试剂盒(Qiagen，Inc.)从1％琼脂糖凝胶中分离出DNA。这个载体DNA被指定为V2。
F2片段和去磷酸化的质粒V2用T4 DNA连接酶连接起来，然后转化大肠杆菌HB101细胞，用BamHI和Asp781酶鉴定出含有带DRC2基因的质粒(pBac-DRC2)的细菌。被克隆片段的序列用DNA测序确认。
5μg的质粒pBac-DRC2与1μg的商业获得的线性化杆状病毒(“BaculoGoldTMbaculovirus DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)一起转染，使用脂质体转染法(Felgner et al.Proc Natl Acad Sci USA847413-7417，1987)。
1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的质粒pBac-DRC2在无菌的微量滴定板的加样孔中混合，孔中含有50μl无血清的Grace氏培养基(LifeTechnologies IncGaithersburg，MD)。再加入10μl脂质体转染剂和9)μl Grace氏培养液，混匀，室温下温育15分钟。然后将转染混合物滴加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中，这些细胞用1ml无血清的Grace氏培养液接种在一块35mm的组织培养板上。前后晃动培养板以混匀新加进的溶液，27℃温育5个小时。5小时后从培养板上移去转染溶液，加入1ml添加了10％胎牛血清的Grace氏昆虫培养液。将培养板重新放回培养箱中，27℃持续培养4天。
4天后收集上清夜，用类似于Summers和Smith所描述的方法进行噬菌斑试验。改变之处是使用了带有“Blue Gal”(Life Technologies IncGaithersburg)的琼脂糖凝胶，它使得可以很容易的分离出蓝色嗜菌斑。(关于嗜菌斑试验的详细描述可参见Life Technologles IncGaithersburg分送的昆虫细胞培养及杆状病毒学用户指导的第9-10页。)系列稀释后四天，病毒进到细胞中，用Eppendorf吸管头挑取蓝色嗜菌斑。在含有200μl Grace氏培养液的Eppendorf管中重悬含有重组病毒的琼脂。短暂离心去除琼脂，含有重组杆状病毒的上清液用于接种在35mm平皿里的Sf9细胞。4天后收获培养皿中的上清液，储存在4℃。
Sf9细胞生长在补充有10％热灭活FBS的Grace氏培养基中。这些细胞用重组杆状病毒V-DRC2感染，感染复数(MOI)为2。6小时后除去原培养基，用不含甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培养基取代(LifeTechnologies IncGaithersburg)。42小时后加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi的35S-半胱氨酸(Amersham)。再将细胞温育16小时，离心收获细胞，用SDS-PAGE和放射自显影可看到被标记的蛋白。
实施例6基因治疗表达成纤维细胞可从一皮肤活组织检查对象获得。所得组织被放到组织培养基中分成小块。小而厚的组织块被放到一个组织培养瓶的潮湿面上，大约每瓶放十块。将瓶子倒转、盖紧，室温中放置过夜。室温中24小时后，倒转瓶子，组织块仍固定在瓶底，加入新鲜的含有10％FBS、青霉素和链霉素的培养基(例如Ham’s F12培养基)。然后在37℃培养约一个星期。这时，加入新鲜培养基，此后每隔几天换一次。再培养两个星期后，出现了一单层成纤维细胞，将其用胰蛋白酶消化并刮入更大的培养瓶中。
pMV-7(Kirschmeier et al.DNA 7219-25，1988)侧翼是Moloney小鼠肉瘤病毒的长末端重复序列，用EcoRI和HindIII消化它，随后用小牛小肠鳞酸酶处理。线性的载体在琼脂糖凝胶上分开并用玻璃珠纯化出来。
编码本发明多肽的cDNA用PCR扩增，引物分别与5’和3’末端序列相符。5’端引物含有一个EcoRI位点，3’端引物含有一个HindIII位点。将等量的Moloney小鼠肉瘤病毒的线性骨架扩增的EcoRI和HindIII位点片段加在一起，再加入T4 DNA连接酶，保持在适合于两片段连接的条件下。连接混合物用于转化细菌HB101，然后为了确定载体上具有正确插入的基因将细菌铺到含卡那霉素的琼脂上。
兼嗜性的pA317或Gp+am12包装细胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中组织培养到铺满的密度。在培养基中加入含所需基因的载体，用它转导包装细胞。包装细胞产生带所需基因的具感染力的病毒颗粒(包装细胞在此称为生产细胞)。
在被转导的生产细胞中加入新鲜的培养基，随后从铺满生产细胞的10cm板上收获培养液。耗尽的培养液中含有具抗感染力的病毒颗粒，用微孔滤膜过滤除去解离的生产细胞，这一培养液又用于感染成纤维细胞。从亚铺满的成纤维细胞除去培养基，快速换为来自生产细胞的培养液。又用新鲜的培养基取代这一培养基。如果病毒的滴度高，那么基本上所有的成纤维细胞都将被转染，不需要进行选择。如果滴度非常低，那么需要用一个带有选择标记诸如neo或his的逆转录载体。
工程化的成纤维细胞可以单独注入宿主，或者在Cytodex3微载体珠上生长到铺满时注入宿主。这时，成纤维细胞产生蛋白产物。
根据上面的讲授，可能对本发明进行各种修改和变异，所以在所附权利要求的范围内，本发明可以以不同于已具体描述的方式实施。
序列表SEQ ID No.1cDRC21，949bp，5’-3’ORF41-1，480(1，440bp)479aa1 GGAACCGCCC GCTGCCAGCC CGGCCAGGCA CCCCTGCAGC ATGGCCTGGA51 ACACCAACCT CCGCTGGCGG CTGCCGCTCA CCTGCCTGCT CCTGCAGGTG101 ATTATGGTGA TTCTCTTCGG GGTGTTCGTG CGCTACGACT TCGAGGCCGA151 CGCCCACTGG TGGTCAGAGA GGACGCACAA GAACTTGAGC GACATGGAGA201 ACGAATTCTA CTATCGCTAC CCAAGCTTCC AGGACGTGCA CGTGATGGTC251 TTCGTGGGCT TCGGCTTCCT CATGACTTTC CTGCAGCGCT ACGGCTTCAG301 CGCCGTGGGC TTCAACTTCC TGTTGGCAGC CTTCGGCATC CAGTGGGCGC351 TGCTCATGCA GGGCTGGTTC CACTTCTTAC AAGACCGCTA CATCGTCGTG401 GGCGTGGAGA ACCTCATCAA CGCTGACTTC TGCGTGGCCT CTGTCTGCGT451 GGCCTTTGGG GCAGTTCTGG GTAAAGTCAG CCCCATTCAG CTGCTCATCA501 TGACTTTCTT CCAAGTGACC CTCTTCGCTG TGAATGAGTT CATTCTCCTT551 AACCTGCTAA AGGTGAAGGA TGCAGGAGGC TCCATGACCA TCCACACATT601 TGGCGCCTAC TTTGGGCTCA CAGTGACCCG GATCCTCTAC CGACGCAACC651 TAGAGCAGAG CAAGGAGAGA CAGAATTCTG TGTACCAGTC GGACCTCTTT701 GCCATGATTG GCACCCTCTT CCTGTGGATG TACTGGCCCA GCTTCAACTC751 AGCCATATCC TACCATGGGG ACAGCCAGCA CCGAGCCGCC ATCAACACCT801 ACTGCTCCTT GGCAGCCTGC GTGCTTACCT CGGTGGCAAT ATCCAGTGCC851 CTGCACAAGA AGGGCAAGCT GGACATGGTG CACATCCAGA ATGCCACGCT901 CGCAGGAGGG GTGGCCGTGG GTACCGCTGC TGAGATGATG CTCATGCCTT951 ACGGTGCCCT CATCATCGGC TTCGTCTGCG GCATCATCTC CACCCTGGGT1001 TTTGTATACC TGACCCCATT CCTGGAGTCC CGGCTGCACA TCCAGGACAC1051 ATGTGGCATT AACAATCTGC ATGGCATTCC TGGCATCATA GGCGGCATCG1101 TGGGTGCTGT GACAGCGGCC TCCGCCAGCC TTGAAGTCTA TGGAAAAGAA1151 GGGCTTGTCC ATTCCTTTGA CTTTCAAGGT TTCAACGGGG ACTGGACCGC1201 AAGAACACAG GGAAAGTTCC AGATTTATGG TCTCTTGGTG ACCCTGGCCA1251 TGGCCCTGAT GGGTGGCATC ATTGTGGGGC TCATTTTGAG ATTACCATTC1301 TGGGGACAAC CTTCAGATGA GAACTGCTTT GAGGATGCGG TCTACTGGGA1351 GATGCCTGAA GGGAACAGCA CTGTCTACAT CCCTGAGGAC CCCACCTTCA1401 AGCCCTCAGG ACCCTCAGTA CCCTCAGTAC CCATGGTGTC CCCACTACCC1451 ATGGCTTCCT CGGTACCCTT GGTACCCTAG GCTCCCAGGG CAGGTGAGGA1501 GCAGGCTCCA CAGACTGTCC TGGGGCCCAG AGGAGCTGGT GCTGACCTAG1551 CTAGGGATGC AAGAGTGAGC AAGCAGCACC CCCACCTGCT GGCTTGGCCT1601 CAAGGTGCCT CCACCCCTGC CCTCCCCTTC ATCCCAGGGG GTCTGACTGA1651 GAATGGAGAA GGAGAAGCTA CAAAGTGGGC ATCCAAGCCG GGTTCTGGCT1701 GCAGAAGTTC TGCCTCTGCC TGGGGTCTTG GCCACATTGG AGAAAAACAG1751 GCTCAAAGTG GGGCTGGGAC CTGGTGGGTG AACCTGAGCT CTCCCAGGAG1801 ACAACTTAGC TGCCAGTCAC CACCTATGAG GCTCTTCTAC CCCGTGCCTG1851 CACCTCGGCC AGCATCTCCT ATGCTCCCTG GGTCCCCCAG ACCTCTCTGT1901 GTTGTGTGCG TGGCAGCCTC CAGGAATAAA CATTCTTGTT GTCCTTTGCSEQ ID No.2pDRC2(479aa)MAWNTNLRWRLPLTCLLLQVIMVILFGVFVRYDFEADAHWWSERTHKNLSDMENEFYYRYPSFQDVHVMVFVGFGFLMTFLQRYGFSAVGFNFLLAAFGIQWALLMQGWFHFLQDRYIVVGVENLINADFCVASVCVAFGAVLGKVSPIQLLIMTFFQVTLFAVNEFILLNLLKVKDAGGSMTIHTFGAYFGLTVTRILYRRNLEQSKERQNSVYQSDLFAMIGTLFLWMYWPSFNSAISYHGDSQHRAAINTYCSLAACVLTSVAISSALHKKGKLDMVHIQNATLAGGVAVGTAAEMMLMPYGALIIGFVCGIISTLGFVYLTPFLESRLHIQDTCGINNLHGIPGIIGGIVGAVTAASASLEVYGKEGLVHSFDFQGFNGDWTARTQGKFQIYGLLVTLAMALMGGIIVGLILRLPFWGQPSDENCFEDAVYWEMPEGNSTVYIPEDPTFKPSGPSVPSVPMVSPLPMASSVPLVPSEQ ID No.35’-CGGCCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’ 26bpSEQ ID No. 4: 5’-CCCGGATCCACCTGCCCTGGGAGCCTA-3’27bpSEQ ID No. 5: 5’-CCCAAGCTTCAGCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’ 34bpSEQ ID No. 6: 5’-CCCTCTAGACCTCACCTGCCCTGGGAGCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA-3’ 58bpSEQ ID No. 7: 5’-CCCGGATCCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’ 30bpSEQ ID No. 8: 5’-CCCGGTACCTCACCTGCCCTGGGAGCCTA-3’
权利要求
1．一种分离的多核苷酸，包括选自下组的成员(a) 编码SEQ ID No.2所示多肽的多核苷酸；(b)能与(a)的多核苷酸杂交并与其有至少70％一致性的多核苷酸；和(c)(a)或(b)多核苷酸的多核苷酸片段。
2．权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA。
3．权利要求2的多核苷酸，其编码含SEQ ID No.2中从1到479位氨基酸的多肽。
4．权利要求2的多核苷酸，其核苷酸序列选自SEQ ID No.1的核苷酸序列。
5．一种分离的多核苷酸，包括选自下组的成员(a)编码CGMCC保藏号0403(cDRC2)的克隆所含cDNA所编码的成熟多肽的多核苷酸；(b)能与(a)的多核苷酸杂交并与其有至少70％一致性的多核苷酸；和(c)(a)或(b)多核苷酸的多核苷酸片段。
6．含有权利要求2的DNA的载体。
7．用权利要求7的载体遗传工程化的宿主细胞。
8．一种产生多肽的方法，包括培养权利要求7的宿主细胞以表达所述DNA编码的多肽，并从培养物中回收目标多肽。
9．一种产生能表达多肽的细胞的方法，包括用权利要求6的载体转化或转染细胞。
10．选自下组的一种多肽(a)具有SEQ ID No.2的推定氨基酸序列的多肽或其片段、类似物和衍生物；(b)CGMCC保藏号0403的克隆所含cDNA编码的多肽或其片段、类似物和衍生物。
11．抗权利要求10的多肽的抗体。
12．含有权利要求1或5的多核苷酸或权利要求10的多肽和药用载体的药物组合物。
13．体外诊断与权利要求10的多肽的表达有关的疾病或疾病易感性的方法，包括在来自宿主的样品中(a)测定编码所述多肽的基因核酸序列中的突变、缺失及重排；和/或(b)测定编码所述多肽的基因核酸序列中的甲基化；和/或(c)测定编码所述多肽的基因mRNA的异常。
14．一种疾病的体外诊断方法，包括在来自宿主的样品中分析权利要求10的多肽的存在或量的改变。
全文摘要
本发明公开了分离的食管癌相关新基因DRC2的DNA、RNA及其编码的多肽,以及应用重组技术产生这种多肽的方法。并且公开了通过检测该基因核酸序列突变、甲基化、RNA及多肽水平的改变,检测与该基因的核酸及其编码多肽异常有关的疾病的诊断方法,也公开了利用该基因的核酸序列和多肽治疗与该基因异常有关的疾病(如肿瘤和癌症)。
文档编号C12N15/11GK1283694SQ9911752
公开日2001年2月14日 申请日期1999年8月10日 优先权日1999年8月10日
发明者王明荣, 许智雄, 徐昕, 蔡岩, 韩亚玲, 王子平, 吴孔明, 王秀琴, 吴旻 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所