专利名称：通过拉曼散射增强核苷酸信号的方法
技术领域：
本方法和设备涉及分子生物学和基因组学领域。更具体而言，这些方法和设备涉及核酸测序。
背景技术：
遗传信息以组织成染色体的非常长的脱氧核糖核酸(DNA)分子的形式储存。人类基因组含有大约30亿个碱基的DNA序列。该DNA序列信息决定了每个个体的多种特征。许多常见的疾病都至少部分地基于DNA序列中的变异。
人类基因组整个序列的测定已经为鉴定这些疾病的遗传根据提供了基础。然而，为了鉴定与每一种疾病相联系的遗传变异，仍有大量的工作需要去做。为了鉴定在DNA序列中促发疾病的特定变化，就要求对表现有每一种这样的疾病的个体或家族的染色体部分进行DNA测序。核糖核酸(RNA)是加工遗传信息时所需要的中间分子，它也能被测序以确定各种疾病的遗传基础。
核酸测序的已有方法是基于按大小分离开的荧光标记核酸的检测，它受到了能被测序的核酸长度的限制。一般来说，一次只能测定500到1000个碱基的核酸序列。这比DNA的功能单位，即基因的长度短得多，后者可能有上万个，甚至十万个碱基长。使用目前的方法来测定一个完整的基因序列，就需要制得该基因的若干拷贝，把它们切为相互重叠的片段，并测序，之后再把相互重叠的DNA序列组合为完整的基因。这个过程费力、昂贵、低效而且耗时。它也通常需要使用荧光或放射性标记，这潜在地引起安全和废物处理问题。
最近，核酸测序的方法已经得以发展，涉及杂交到被限定测序的、附着于DNA芯片上特定位置的短寡核苷酸。这些方法可用于推断短的核酸序列或者用于检测特定核酸在样品中的存在，但不适合用于鉴定长的核酸序列。
下面的附图形成本说明书的一部分，并被包括以进一步说明本发明公开实施方式的某些方面。参照这些附图中一个或多个，结合此处所述的本发明具体实施方式
的详细说明，可以较好地理解本发明的实施方式。
图1说明示例性设备10(未按比例)以及核酸13测序的方法，其中利用与拉曼标记共价连接的核苷酸16。
图2说明示例性设备100(未按比例)以及核酸13测序的方法，其中将释放的核苷酸130与纳米颗粒140共价连接，然后用表面增强拉曼光谱(SERS)180进行检测。
图3说明用于核酸13测序的另一个示例性设备210(未按比例)。
图4显示浓度为100mM的所有四个脱氧核苷单膦酸酯(dNTPs)的拉曼光谱，使用的数据收集时间为100毫秒。对每个不同类型的核苷酸，显示了特征拉曼发射峰。数据在没有核苷酸的表面增强或没有对核苷酸标记的情况下被收集。
图5显示1nM鸟嘌呤的SERS检测，鸟嘌呤通过酸处理由dGMP获得，按照Nucleic Acid Chemistry，Part 1，L.B.Townsend和R.S.Tipson(Eds.)，Wiley-Interscience，New York，1978。
图6显示10nM胞嘧啶的SERS检测，胞嘧啶通过酸处理由dCMP获得。
图7显示100nM胸腺嘧啶的SERS检测，胸腺嘧啶通过酸处理由dTMP获得。
图8显示100pM腺嘌呤的SERS检测，腺嘌呤通过酸处理由dAMP获得。
图9显示用荧光素共价标记的脱氧腺苷三磷酸(上曲线)和未标记dATP(下曲线)的500nM溶液的比较SERS光谱。dATP-荧光素从Roche AppliedScience(Indianapolis，IN)。在荧光素标记的dATP中，检测到SERS信号的强大提高。
图10显示腺嘌呤的0.9nM(纳摩尔)溶液的SERS检测。检测体积为100到150毫微微升，含有估计60个腺嘌呤分子。
图11显示滚环扩增产物的SERS检测，其中使用单链环形M13 DNA模板。
说明性实施方式的描述 公开的方法和设备是用于核酸的快速、自动化的测序。在本发明的具体实施方式
中，这些方法和设备适合用于获得很长的核酸分子的序列，其长度大于1000个、大于2000个、大于5000个、大于10000个、大于20000个、大于50000个、大于100000个或甚至更多个碱基。相比现有技术方法的优越之处包括在单轮测序中阅读长核酸序列的能力，获得序列数据的速度更快，测序的花费降低，以及在产生每单位的序列数据所需要的操作时间上效率更高。
在本发明的各种实施方式中，序列信息可以在使用单个核酸分子的单轮测序过程中获得。在本发明的其它实施方式中，可以对核酸分子的多个拷贝同时或逐个地测序，以确认核酸序列或获得完整的序列数据。在本发明的可选实施方式中，可以既对核酸分子又对其互补链测序，以确认序列信息的准确。在各种实施方式中，要测序的核酸可以共价地或非共价地附着于表面。在具体实施方式
中，例如通过外切核酸酶处理，可以将核苷酸从附着于表面的核酸释放。被释放的核苷酸例如通过微流体系统传送到拉曼检测器，从而允许被释放核苷酸被检测而没有来自核酸、外切核酸酶和/或其它系统组分的背景拉曼信号。
在本发明的某些实施方式中，要测序的核酸是DNA，虽然考虑，其它包含RNA或合成核苷酸类似物的核酸也可以被测序。下面的详细描述包含许多具体的细节，以便提供对本发明公开的实施方式的更全面理解。然而，对本领域技术人员显而易见的是，在没有这些具体细节的情况下，可以实施本发明的实施方式。在其它情况中，本领域熟知的设备、方法、过程和各个组分在这里未进行描述。
在本发明的各种实施方式中，通过拉曼光谱术，例如表面增强拉曼光谱术(surface enhanced Raman spectroscopy(SERS))、表面增强共振拉曼光谱术(surface enhanced resonance Raman spectroscopy(SERRS))、相干反斯托克斯拉曼光谱术(coherenct anti-Stokes Raman spectroscopy(CARS))或其它已知的拉曼检测技术，可以检测未标记的核苷酸。在可选的实施方式中，可将核苷酸共价地连接于拉曼标记，以增强拉曼信号。在一些实施方式中，可使用标准的核酸聚合技术，将标记的核苷酸整合进新合成的核酸链。通常地，将特定序列的引物或一个或多个随机引物与模板核酸杂交。在加入聚合酶和标记的核苷酸后，将拉曼标记的核苷酸共价连接于引物的3′末端，形成在序列上与模板互补的标记核酸链。标记的链可以与未标记模板分离，例如通过加热到大约95℃或其它已知的方法。通过本领域熟知的技术，可以将两个链彼此分离。例如，可以用生物素残基共价地修饰引物寡核苷酸，并可以通过与包被抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的表面结合，分离形成的生物素化核酸。
在本发明的可选实施方式中，用一个或多个外切核酸酶，可以消化标记或未标记的单链核酸分子。技术人员将认识到，本公开的方法并不限于外切核酸酶本身，而可以使用能够将核苷酸从核酸的至少一端逐个除去的任何酶或其它试剂。在本发明的某些实施方式中，标记或未标记的核苷酸逐个地从核酸的3′末端被释放。在与核酸分离后，用拉曼检测单元检测核苷酸。逐个地被检测的核苷酸的信息被用于汇编核酸的序列。从核酸的3′末端释放的核苷酸可通过微流体流动通路传送通过拉曼检测器。在具体的实施方式中，该检测器能够在单分子水平检测标记或未标记的核苷酸。用拉曼检测器检测核苷酸的顺序与核苷酸从核酸的3′末端释放的顺序相同。由此，核酸的序列通过被释放核苷酸的检测顺序而被确定。根据标准的沃森-克里克氢键碱基配对(即，A-T和G-C或A-U和G-C，这取决于是对DNA还是对RNA测序)，在互补链是序列的情况下，模板链在序列上将是互补的。
在某些可选的实施方式中，可将标签分子添加到检测单元上游的反应室或流动通路(flow path)中。当自由核苷酸从核酸分子释放时，该标签分子与游离核苷酸结合并标记所述游离核苷酸。这种释放后标记避免了核酸分子的核苷酸在其释放进入溶液前被标记时遇到的问题。例如，在整合进核酸分子的每个核苷酸在外切核酸酶处理之前被标记时，大体积拉曼标记分子的使用可能产生空间位阻，降低效率并增加测序反应所需的时间。
在本发明的某些实施方式中，可将四种类型核苷酸的每一种连接到可区分的拉曼标记。在本发明的其它实施方式中，可以只有嘌呤核苷酸(胞嘧啶和/或胸腺嘧啶和/或尿嘧啶)被标记。在一个示例性实施方式中，标记的核苷酸可包括生物素标记的脱氧胞苷-5′-三磷酸(生物素-dCTP)和地高辛标记的脱氧尿苷-5′-三磷酸(地高辛-dUTP)。在可选的实施方式中，没有核苷酸被标记，未标记的核苷酸用拉曼光谱术检测。
在本发明的特定实施方式中，可以通过将核苷酸共价连接于纳米颗粒，增强拉曼信号。纳米颗粒可以按下面的讨论进行制备，并可以采用已知的方法，通过连接高活性基团例如环氧基团被活化。例如，纳米颗粒可以被包被以3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane(GOP))。GOP包含末端的高活性环氧基团。高活性基团如环氧化物的使用使得可以快速形成纳米颗粒与核苷酸之间的共价键。在一些实施方式中，核苷酸可以通过外切核酸酶活性，从核酸释放，然后与纳米颗粒反应，从而可以形成共价键。可以采用各种方法，使得在纳米颗粒-核苷酸复合物之前，可以有充足的时间形成共价键。例如，可以将含有被释放的核苷酸和活化的纳米颗粒的溶液通过微流体流动进行传送，其经过相对长的流动通路，这使得在核苷酸-纳米颗粒复合物通过拉曼检测器前面之前，有充足的时间形成共价键。通过使用高黏度的流体，例如甘油溶液，可进一步降低流速。高黏度溶液的微流体流动的方法是本领域已知的。
可选地，可采用循环过程，其中首先使纳米颗粒与核酸的3′末端结合。纳米颗粒和连接的核苷酸可通过外切核酸酶活性或化学处理，从核酸的3′末端释放。例如，将末端的核苷酸与核酸连接的磷酸二酯键可以通过酸或碱处理而被切割。连接的纳米颗粒的吸电子效应可使末端的磷酸二酯键特别易于切割，这使得可以一次除去单个核苷酸。释放之后，另一纳米颗粒可与核酸的3′末端反应，循环地重复该过程。可选地，可以使用3′外切核酸酶，以释放核苷酸-纳米颗粒复合物。通过使用连接臂，将活性基团(如环氧化物)与纳米颗粒连接，可以避免纳米颗粒对外切核酸酶活性造成的空间位阻。末端核苷酸释放前连接纳米颗粒使得可以有充足的时间形成共价键。在本发明的其它可选实施方式中，可以调节外切核酸酶活性的速率，以便与核苷酸释放的速率和它们与纳米颗粒共价连接的速率一致。例如，可以将包含核酸和外切核酸酶的反应室的温度控制到降低的温度，在0℃到室温之间。确定了合适的温度之后，用外切核酸酶活性释放的核苷酸可进入流动通路，在那里，它们与活性纳米颗粒在提高的温度下混合，该温度在室温到100℃之间。提高的温度会提高核苷酸和纳米颗粒的反应速率。在不同实施方式中，可以使用约0℃到5℃、5℃到10℃、10℃到15℃、15℃到20℃或20℃到25℃的温度范围，以调节外切核酸酶活性。在某些实施方式中，可使用约20℃到25℃、25℃到30℃、30℃到35℃、35℃到40℃、40℃到45℃、45℃到50℃、50℃到55℃、55℃到60℃、60℃到65℃、65℃到70℃、70℃到75℃、75℃到80℃或80℃到95℃的温度范围，以调节纳米颗粒和核苷酸之间共价键的形成速率。分析作为温度函数的反应速率，以及选择合适的温度范围以匹配外切核酸酶活性和核苷酸-纳米颗粒交联速率，这些都完全在本领域的常规技术之内。
在本发明的一些实施方式中，纳米颗粒是银或金，但也考虑已知可以提供表面增强拉曼信号的其它类型的纳米颗粒。纳米颗粒可以是单个纳米颗粒、纳米颗粒的聚集体，或单个纳米颗粒和聚集纳米颗粒的一些混合物。在某些实施方式中，可使用接头(linker)化合物将核苷酸连接到纳米颗粒。该接头化合物的长度可以是1到100纳米(nm)、2到90nm、3到80nm、4到70nm、5到60nm、10到50nm、15到40nm或20到30nm。在某些实施方式中，接头化合物的长度可以是1到50nm、1到5nm、2到10nm、10到20nm或约5nm。在其它实施方式中，可以使用接头化合物将两个或更多个纳米颗粒连接在一起。
纳米颗粒-核苷酸复合物可以经过流通池(flow-through cell)，在那里，使用拉曼检测单元，通过SERS、SERRS和/或CARS对它们进行检测。在本发明的一些可选实施方式中，核苷酸可以不被修饰，而在其它可选实施方式中，核苷酸可以用一个或多个拉曼标记修饰。在某些实施方式中，每种核苷酸可以被连接到可区分的拉曼标记上。在其它实施方式中，可以只有嘧啶被标记。
定义 如这里所使用，“一个(a)”或“一个(an)”指一个或多于一个的项目。
如这里所使用，“可操作地连接(operably coupled)”意指，在两个或更多个元件之间存在功能性相互作用。例如，如果布置检测器，使得它可以在分析物如核苷酸经过流通池时可以进行检测，则该检测器就是与流通池“可操作地连接”。
“核酸(nucleic acid)”包括DNA、RNA，可以是单链的、双链或三链的以及它们的任何化学修饰形式。事实上，可以考虑核酸的任何修饰形式。如这里所使用，单链核酸可以用前缀“ss”表示，双链核酸用前缀“ds”表示，三链核酸用前缀“ts”表示。“核酸”可以为几乎任何长度，它的碱基数可以是10、20、30、40、50、60、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、500000、1000000、1500000、2000000、5000000或者甚至更多，直到全长染色体DNA分子。
“核苷(nucleoside)”是包括嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤-“A”、胞嘧啶-“C”、鸟嘌呤-“G”、胸腺嘧啶-“T”或尿嘧啶-“U”)或它们的任何化学修饰形式或结构类似物的分子，这些碱基共价连接到戊糖如脱氧核糖、核糖或者戊糖的衍生物或类似物上。
“核苷酸(nucleotide)”指进一步包括至少一个磷酸基团的核苷，该磷酸基团共价连接于戊糖上。在本发明的一些实施方式中，核苷酸是核糖核苷单磷酸或脱氧核糖核苷单磷酸，虽然产生和检测核苷二磷酸或三磷酸也是可以预期的。在本发明的其它实施方式中，核苷可以从核酸分子释放。在核苷酸的结构中进行各种取代或修饰在考虑范围内，只要它们能够通过聚合酶活性整合进核酸以及能够通过外切核酸酶或等效试剂被释放。在涉及与一种或多种类型的核苷酸连接的一个或多个标记的本发明实施方式中，该标记可以和核苷酸的任何部分连接，例如碱基、糖或磷酸基团或它们的类似物。术语“核苷酸”和“标记核苷酸(labelednucleotide)”包括但不限于所有的非天然的核苷酸复合物，例如核苷酸-纳米颗粒复合物和核苷酸-标记复合物。
“拉曼标记(Raman label)”可以是任何能够产生可检测的拉曼信号的有机或无机分子、原子、复合物或结构，包括但不限于合成的分子、染料、天然生成的色素如藻红蛋白、有机纳米结构如C60、巴基球(buckyball)和碳纳米管，金属纳米结构如金或银纳米颗粒或纳米菱镜(nanoprism)以及纳米尺寸半导体如量子点。下面公开了拉曼标记的大量例子。技术人员将认识到，这些例子不是限制性的，“拉曼标记”包括本领域已知的可用拉曼光谱术检测的任何有机或无机原子、分子、化合物或结构。
核酸 要测序的核酸分子可以用本领域已知的任何技术制备。在本发明的某些实施方式中，核酸是天然生成的DNA或RNA分子。实际上，使用公开的方法，可以制备和测序任何天然生成的核酸，包括但不限于染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，和核糖体RNA、转运RNA、不均一核RNA或信使RNA(mRNA)。用于制备和分离各种形式核酸的方法是已知的。(见，例如，Guide to MolecularCloning Techniques，eds.Berger and Kimmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Ed.，eds.Sambrook，Fritsch andManiatis，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。在所引用的参考文献中公开的方法仅仅是示例性的，可以使用本领域已知的任何变通的方法。在对单链DNA(ssDNA)进行测序的情况下，可以采用任何已知方法，从双链DNA(dsDNA)制备ssDNA。这些方法可以涉及加热dsDNA和使链分离，或者可以替代地涉及通过已知的扩增或复制方法，从dsDNA制备ssDNA，例如克隆到M13中。可以使用任何这样的已知方法制备ssDNA或ssRNA。如上所述，例如，采用已知技术，通过生物素标记和与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白连接，可以分离出双链DNA的两个链之一。
虽然本发明的某些实施方式涉及天然生成的核酸的制备，但事实上，可用作外切核酸酶或等效试剂的底物的任何类型的核酸都可能被测序。例如，用各种扩增技术如聚合酶链式反应(PCRTM)扩增制得的核酸可以被测序。(见美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159。)作为选择，待测序的核酸可以用标准载体克隆，标准载体如质粒、粘粒、BACs(细菌人工染色体)或YACs(酵母人工染色体)。(见，例如，Berger and Kimmel，1987；Sambrook et al.，1989。)核酸插入物可以从载体DNA中分离，例如，用合适的限制性内切核酸酶切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳。插入核酸的分离方法是熟知的。
单个核酸分子的分离 在本发明的某些实施方式中，待测序的核酸分子是ssDNA或ssRNA的单个分子。可以使用用于选择和操作单个核酸分子的各种方法，如流体动力学聚焦(hydrodynamic focusing)、微操纵器偶联(micro-manipulator coupling)、光捕获、或这些方法的组合和类似的方法。(见，例如，Goodwin等，1996，Acc.Chem.Res.29607-619；美国专利4,962,037；5,405,747；5,776,674；6,136,543；6,225,068。) 在本发明的某些实施方式中，可以应用微流体学或超微流体学来分选和分离核酸分子。可以运用流体动力学来操纵核酸的运动，使其进入微通道、微毛细管或微孔。在本发明的一个实施方式中，可以使用流体动力来移动核酸分子通过一个梳状结构，从而分离出单个核酸分子。一旦核酸分子被分离开，就可以使用流力聚焦将这些分子定位在反应室内。热学或电学上的势差、压力或真空也都可用来提供操作核酸所需的驱动力。在本发明示例性的实施方式中，为了测序而对核酸进行的操作可以涉及到使用通道砌块(channel block)设计，它整合了微构造出的通道和一体化的胶质材料(参见美国专利5,867,266和6,214,246)。
在本发明的另一个实施方式中，含有核酸分子的样品可以在偶联到固定化表面之前被稀释。在本发明的示例性实施方式中，固定化表面可以是磁性或非磁性微珠子(bead)的形式，或是其他离散的结构单元。经过适当的稀释，每个珠子将具有结合零个或一个核酸分子的统计概率。连接有一个核酸分子的珠子可以用例如荧光染料和流式细胞仪筛选或磁性筛选来鉴定。取决于珠子和核酸的相对大小和均一性，使用磁滤器和质量分离法来分离含有单个结合核酸分子的珠子是可能的。在本发明的其他实施方式中，连接到单个珠子或其他固定化表面的多个核酸可以被测序。
在可选择的实施方式中，可以用有包被的纤维探头(coated fiber tip)，产生用于测序的单个核酸分子(例如，美国专利6,225,068)。在其他可选择的实施方式中，可以制备含有抗生物素蛋白或其他交联剂的单个分子的固定化表面。这样的表面能够连接将被测序的单个生物素化核酸分子。这个实施方式不限于抗生物素蛋白-生物素结合体系，而是可以适用于任何已知的偶联体系。
在本发明其他可选的实施方式中，可以使用光捕获来操纵用于测序的单个核酸分子。(例如，美国专利5,776,674)。示例性的光捕获系统可以在商业上从Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+L GmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M Gmbh(Wolfratshausen，Germany)获得。
拉曼标记 本发明的某些实施方式可以涉及将标记连接到核苷酸，以有助于它们被检测装置测量。可以用于拉曼光谱术的标记的非限定性例子包括TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、藻红、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱(azomethine)、花菁、黄嘌呤、琥珀酰荧光素以及氨基吖啶。这些以及其它拉曼标记可以从商业渠道获得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。
多环芳香化合物可用作拉曼标记，正如本领域所知的。可用于本发明具体实施方式
的其它标记包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在本发明的某些实施方式中，碳纳米管可用作拉曼标记。标记在拉曼光谱术中的用法是已知的(例如美国专利5,306,403和6,174,677)。技术人员将认识到，所用的拉曼标记应当产生可区分的拉曼光谱并可以与不同类型的核苷酸特异地结合或与不同类型的核苷酸特异地发生联系。
标记可以直接与核苷酸连接或者通过各种接头化合物与之连接。用于所公开的方法中的交联剂和接头化合物将在下面做进一步描述。可选地，与拉曼标记共价连接的核苷酸可以从标准商业来源得到(例如，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有被设计为可以与其它分子如核苷酸共价反应的活性基团的拉曼标记是商业可得的(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。制备标记的核苷酸以及将它们整合进核酸的方法是已知的(例如美国专利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
纳米颗粒 本发明的某些实施方式涉及使用纳米颗粒来增强从核苷酸获得的拉曼信号。在本发明的一些实施方式中，纳米颗粒是银或金纳米颗粒，虽然可以使用能够提供表面增强拉曼光谱(SERS)信号的任何纳米颗粒。在本发明的可选实施方式中，纳米颗粒可以是纳米菱镜(Jin等，Science 2941902-3，2001)。在本发明的各种实施方式中，可以使用直径为1nm到2微米(μm)之间的纳米颗粒。在本发明的可选实施方式中，直径为2nm到1μm、5nm到500nm、5nm到200nm、10nm到200nm、20nm到100nm、30nm到80nm、40nm到70nm或50到60nm的纳米颗粒在考虑之列。在本发明的某些实施方式中，平均直径为10到50nm、50到100nm或大约100nm的纳米颗粒在考虑之列。纳米颗粒的形状可以大体上为球形、棒状、尖锐形状、菱面状或尖头状，虽然可以使用任何形状的或不规则形状的纳米颗粒。制备纳米颗粒的方法是已知的(例如，美国专利6,054,495；6,127,120；6,149,868；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.863391-3395，1982；Jin等，2001)。纳米颗粒也可以从商业渠道获得(例如Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。
在本发明的某些实施方式中，纳米颗粒可以是单个纳米颗粒和/或纳米颗粒的随机聚集体(胶状纳米颗粒)。在本发明的其它实施方式中，纳米颗粒可以被交联，以产生特定的纳米颗粒聚集体，例如二聚体、三聚体、四聚体或其它聚集体。某些可选的实施方式可使用不同大小的聚集体的不均一混合物，而其它可选的实施方式可使用纳米颗粒的均一群体。在某些实施方式中，包含选择数目的纳米颗粒的聚集体(二聚体、三聚体等)可以用已知的方法进行富集或提纯，例如在蔗糖溶液中的超离心法。在本发明的各种实施方式中，大小为大约100、200、300、400、500、600、700、800、900到1000nm或更大的纳米颗粒聚集体在考虑之列。
交联纳米颗粒的方法是已知的(例如，Feldheim，“Assembly ofmetalnanoparticle arrays using molecular bridges，”The Electrochemical Society Interface，Fall，2001，pp.22-25)。金纳米颗粒可以例如使用具有末端硫醇基或巯基的双功能接头化合物进行交联。与金纳米颗粒反应后，接头形成纳米颗粒二聚体，其被接头的长度分开。在本发明的其它实施方式中，可以使用具有三个、四个或更多个硫醇基的接头，同时连接多个纳米颗粒(Feldheim，2001)。使用相对于接头化合物为过量的纳米颗粒，防止了多重交联(multiple cross-link)和纳米颗粒沉淀(nanoparticle precipitation)的形成。银纳米颗粒的聚集体可以通过本领域已知的标准合成方法形成。
在本发明的可选实施方式中，在纳米颗粒与接头化合物连接之前，可以对纳米颗粒进行修饰，以包含各种活性基团。修饰的纳米颗粒是商业可得的，例如来自Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的Nanogold纳米颗粒。Nanogold纳米颗粒可以用单个或多个马来酰亚胺、胺或其它基团连接每个纳米颗粒而获得。Nanogold纳米颗粒也可以以带正电荷或负电荷的形式获得。可以将这种修饰的纳米颗粒与各种已知的接头化合物连接，从而提供纳米颗粒的二聚体、三聚体或其它聚集体。
所使用的接头化合物的类型是没有限制的，只要它导致产生在溶液中不会沉淀的纳米颗粒小聚集体。在本发明的一些实施方式中，接头基团可以包括苯乙炔聚合物(Feldherm，2001)。可选地，接头基团可以包括聚四氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯或其它已知聚合物。所用的接头化合物并不限于聚合物，而也可以包括其它类型的分子，例如硅烷、烷烃、衍生化硅烷或衍生化烷烃。
在本发明的各种实施方式中，纳米颗粒可以共价地与核苷酸连接。在本发明的可选实施方式中，核苷酸可以直接地与纳米颗粒连接，或者可以与共价地或非共价地与纳米颗粒键合的接头化合物连接。在本发明的这些实施方式中，不是将两个或更多个纳米颗粒交联在一起，而是可以使用接头化合物将核苷酸与纳米颗粒或纳米颗粒聚集体相连。在本发明的特定实施方式中，纳米颗粒可以被包被以衍生化的硅烷。使用标准方法，可以将这种改性的硅烷共价地连接到核苷酸。已知可以将核酸交联到下面所讨论的表面的各种方法也可以用于将核苷酸连接到纳米颗粒。预期用于连接核苷酸的接头化合物可以具有几乎任何长度，其范围是大约0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、35、40、45、50、55、60、65、60、80、90到100nm或更大长度。本发明的某些实施方式可以使用不均一长度的接头。
在本发明的其它实施方式中，核苷酸可以被吸附在纳米颗粒的表面，或者非常靠近纳米颗粒(约0.2到1.0nm之间)。技术人员将认识到，核苷酸与纳米颗粒的共价连接对于通过SERS、SERRS或CARS产生增强的拉曼信号并不是必需的。
在本发明的一些实施方式中，当核苷酸和纳米颗粒通过微流体通道时，可以将它们连接，形成核苷酸-纳米颗粒复合体。在本发明的某些实施方式中，进行交联反应的有效时间长度可以被限制。这些实施方式可以使用具有快速反应速率的高活性交联基团，例如环氧基、叠氮基、芳基叠氮基、三嗪基或重氮基。在本发明的某些实施方式中，可以通过暴露于强光如激光，对交联基团进行光活化。例如重氮或叠氮化合物的光活化分别导致形成高活性的卡宾和氮宾部分。在某些实施方式中，可以选择活性基团，以便它们可以只将纳米颗粒与核苷酸连接，而不将纳米颗粒相互交联。能够结合到核苷酸的活性交联基团的选择和制备是本领域已知的。在本发明的可选实施方式中，核苷酸本身可以被共价地修饰，例如用可以与金纳米颗粒相连的巯基进行修饰。
在本发明的某些实施方式中，可以通过本领域已知的任何方法，操纵纳米颗粒进入微流体通道，所述方法例如微流体学、超微流体学、流体动力学聚焦或电渗。在一些实施方式中，带电荷接头化合物或带电荷纳米颗粒的使用可以通过利用电梯度，有助于操纵纳米颗粒。
核酸的固定化 在本发明的某些实施方式中，可以将一个或多个核酸分子连接到表面上，例如功能化玻璃、硅、硅酸盐、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、聚二氟偏二乙烯(PVDF)、银或其他金属包覆的表面、石英、塑料、PTFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、乳胶、尼龙、硝化纤维素、玻璃珠、磁珠、光聚合物或本领域已知的在其表面整合有功能基如氨基、羧基、硫醇基、羟基或Diels-Alder反应物的任何其它材料，上述光聚合物含有光活性物质如氮宾、卡宾和能与核酸分子形成共价连接的羰自由基(见美国专利5,405,766和5,986,076)。
在本发明的一些实施方式中，表面功能基可以与交联化合物共价地连接，以便可以在没有空间位阻的情况下发生核酸分子与外切核酸酶和/或聚合物酶之间的结合作用。典型的交联基团包括乙二醇低聚体和二胺。连接可以通过共价的或非共价的结合。将核酸分子连接到表面上的各种方法是本领域已知的，可以被应用。在本发明的某些实施方式中，将核酸分子固定在位置上并浸在流过流动通路和/或微流体通道的微流体流中，该流动通路和/或通道将释放的核苷酸传送通过检测单元。在非限定性例子中，微流体流可以形成自流过流动通路和/或微流体通道的大量溶剂流(a bulk flow of solvent)。
在本发明的可选实施方式中，大量介质(bulk medium)只是缓慢流动或根本不流动，但溶液内带电荷的物质(如带负电的核苷酸)响应于外部施用的电场而流过流动通路和/或微流体通道。
通过各种已知方法，可以实现核酸分子的固定化。在本发明的示例性实施方式中，固定化可以通过这样的方法完成，即用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆表面，接着进行生物素化核酸的连接(Holmstrom等，Anal.Biochem.209278-283，1993)。固定化亦可这样实现，即用聚L-Lys(赖氨酸)或聚L-Lys，Phe(苯丙氨酸)包覆硅、玻璃或其他表面，接着用双功能交联剂共价连接氨基或巯基修饰的核酸(Running等，BioTechniques 8276-277，1990；Newton等，NucleicAcids Res.211155-62，1993)。可以通过使用氨基硅烷将胺残基包覆在表面上。
可以将5′-磷酸化核酸直接共价连接到化学修饰的表面，从而实现固定化(Rasmussen等，Anal.Biochem.198138-142，1991)。核酸与表面之间的共价键通过与水溶性碳二亚胺的缩合而形成。这种方法有助于核酸通过其5′-磷酸进行主要的5′-连接。
要将DNA结合到玻璃上，通常要先对玻璃表面进行硅烷化，然后用碳二亚胺或戊二醛活化。可选择的步骤可以使用的试剂例如3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，DNA通过整合到分子的3′或5′端的氨基接头来联接。使用紫外辐射可以将DNA直接结合到膜表面。核酸固定化技术的其他非限制性实例公开在美国专利5,610,287、5,776,674和6,225,068。
双功能交联剂可以在本发明的各种实施方式中被使用，例如连接核酸分子到表面。可以根据双功能交联剂的功能基的特异性，例如氨基、胍基、吲哚或羧基特异性基团来划分它们。用于交联分子的示例性方法公开在美国专利5,603,872和5,401,511。交联剂包括戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)。
核酸合成聚合酶 本发明的某些实施方式涉及将合成试剂例如DNA聚合酶结合到引物分子以及将拉曼标记核苷酸添加到该引物的3′末端。聚合酶的非限定性例子包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和RNA依赖型RNA聚合酶。关于这些聚合酶在“校正”活性以及要求或不要求引物和启动子序列方面的差别是本领域已知的。当RNA聚合酶用作聚合酶时，要测序的模板分子可以是双链DNA。聚合酶的非限定性例子包括海栖热袍菌(Thermatoga maritima)DNA聚合酶、AmplitaqFSTMDNA聚合酶、TaquenaseTMDNA聚合酶、ThermoSequenaseTM、TaqDNA聚合酶、QbetaTM复制酶、T4 DNA聚合酶、嗜热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶、RNA依赖型RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
许多聚合酶是商业可得的，包括Pwo DNA聚合酶(BoehringerMarmheim Biochemicals，Indianapolis，IN)；Bst聚合酶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)；IsoThermTMDNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)；莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶，Pfu DNA聚合酶，禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶，黄色栖热菌(Thermus flavus(Tfl))DNA聚合酶和热球菌(Thermococcus litoralis(Tli))DNA聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)；RAV2逆转录酶，HIV-1逆转录酶，T7RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，SP6 RNA聚合酶，大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶，水生栖热菌(Thermos aquaticus)DNA聚合酶，T7DNA聚合酶+/-3′→5′外切核酸酶，DNA聚合酶I的Klenow片段，‘普遍存在’栖热菌(Thermus′ubiquitous′)DNA聚合酶以及DNA聚合酶I(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。可以使用具有模板依赖性的标记核苷酸聚合能力的本领域已知的任何聚合酶。(参见，例如，Goodman和Tippin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1(2)101-9，2000；美国专利6,090,589。)使用聚合酶从标记核苷酸合成核酸的方法是已知的(例如，美国专利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
引物 一般地，引物的长度在10到20个碱基之间，虽然可以使用更长的引物。在本发明的某些实施方式中，引物被设计为，在序列上与模板核酸分子的已知部分互补。可以使用已知的引物序列，例如，在引物被选择用于鉴定与已知的恒定染色体序列邻近的序列变体时，在将未知的核酸序列插入已知序列的载体时，或者在天然核酸已经被部分测序时。任何序列的引物的合成方法是已知的。本发明的其它实施方式涉及在不存在已知的引物结合位点时测序核酸。在这样的情况下，可能使用随机引物，例如随机六聚体或随机寡聚体，以启动聚合。
核酸消化 在本发明的某些实施方式中，核酸测序的方法涉及外切核酸酶或等效试剂与核酸分子自由端的结合以及一次移去一个核苷酸。可能使用的核酸消化酶的非限定性例子包括大肠杆菌(E.coli)外切核酸酶I、III、V或VII、Bal 31外切核酸酶、绿豆核酸酶、S1核酸酶、E.coli DNA聚合酶I全酶或Klenow片段、RecJ、外切核酸酶T、T4或T7 DNA聚合酶、Taq聚合酶、外切核酸酶T7基因6、蛇毒磷酸二酯酶、脾磷酸二酯酶、热球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶、热球菌属(Pyrococcus sp.)GB-D DNA聚合酶、λ(lambda)外切核酸酶、金黄色葡萄球菌(S.aureus)微球菌核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、核糖核酸酶A、T1微球菌核酸酶或本领域已知的其他外切核酸酶。外切核酸酶可以由商业来源获得，如NewEngland Biolabs(Beverly，MA)、Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、Sigma Chemicals(St.Louis，MO)或Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
技术人员会认识到，具有外切核酸酶活性的酶可以从核酸分子的5′端、3′端或任意一端移去核苷酸。它们可以对RNA、DNA或两者显示特异性。它们的活性可能依赖于单链或双链核酸的使用。它们可以不同程度地受到盐浓度、温度、pH或二价阳离子的影响。外切核酸酶的这些及其他性质在本领域是已知的。在本发明的某些实施方式中，可以操纵外切核酸酶的活性速率，以与检测装置对核苷酸的最佳分析速率相吻合。用于调节外切核酸酶活性速率的各种方法是已知的，包括调节反应室中的温度、压力、pH、盐浓度或二价阳离子浓度。
虽然通过外切核酸酶活性，核苷单磷酸一般会从核酸释放，但本发明的实施方式并不限于游离核苷酸或核苷的任何特定形式的检测，而是包括可以从核酸释放的任何单体。
反应室和集成芯片 本发明的一些实施方式涉及包括反应室的设备，该反应室被设计用来盛放在含水环境中的固定化表面、核酸分子、外切核酸酶和核苷酸。在本发明的一些实施方式中，反应室是可以控温的，例如通过加入帕尔帖元件(Pelletierelements)或本领域已知的其他方法。用于控制小体积液体的温度的方法是已知的。(见，例如，美国专利5,038,853，5,919,622，6,054,263和6,180,372。) 在本发明的某些实施方式中，反应室和任何相关联的液体通道，例如流动通路、微流体通道或通道都可以用批制造工艺来制造，如同在计算机芯片制造和/或微毛细管芯片制造领域中已知的情况，上述通道用于提供与废物口、核酸加载口、纳米颗粒库、外切核酸酶源或其它流体室的连接。在本发明的一些实施方案中，反应室和设备的其他组件如流动通路和/或微流体通道可以制造为单个集成芯片。这样的芯片可以用本领域已知的方法制造，如使用光平板印刷和蚀刻。然而，制造方法是不受限的，可以使用本领域已知的其他方法，如激光切割、注塑、浇铸、分子束外延、蘸水笔纳米石版印刷术、化学气相沉积(CVD)制造、电子束或聚焦电子束技术或压印技术。对于本发明的某些实施方式，可以使用纳机电系统的制造方法。(见，例如，Craighead，Science 2901532-36，2000.)微加工芯片可以在商业上获得，来源如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
为了便于检测单元对核苷酸的检测，构成流动通路或流通池的材料可以被选择为，对于检测单元使用的激发和发射频率处的电磁辐射是可透过的。可以使用玻璃、硅以及在拉曼光谱使用的波长范围内通常是可透性的其他任何材料。在本发明的一些实施方式中，与检测单元相对的流动通路或流通池表面可以用银、金、铂、铜、铝或对于检测单元相对不透光的其他材料包覆。在那个位置，不透光材料可以用来增强例如SERS的拉曼信号，而不会干扰检测单元的功能。可选地，流动通路或流通池可以包括包含有银、金、铂、铜、铝或其它拉曼信号增强金属的网格。在本发明的其它可选实施方式中，流动通路或流通池可以包含金属纳米颗粒。
流动通路和微流体通道
在本发明的某些实施方式中，从核酸释放的核苷酸沿着流动通路和/或微流体通道移动并经过检测单元。用于运送核苷酸的技术的非限制性实例包括微流体技术。流动通路和/或微流体通道可包含微毛细管(例如，从ACLARABioSciences Inc.，Mountain View，CA获得)或液体集成电路(例如，CaliperTechnologies Inc.，Mountain View，CA)。微通道流动通路的直径可以为约5到200μm，大约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm。
在本发明的某些实施方式中，要检测的核苷酸通过溶剂的整体流动(bulk folw)沿着流动通路和/或微流体通道运动。在本发明的其他实施方式中，可以使用微毛细管电泳沿着流动通路和/或微流体通道运送核苷酸。微毛细管电泳通常涉及使用很细的毛细管或通道，其中可以充有或不充有特定的分离介质。带有适当电荷的分子物质，例如带负电的核苷酸，可以在施加的电场作用下发生电泳，负极在设备的反应室一侧，正极在检测单元一侧。尽管电泳常常是用来对同时加到微毛细管中的组分的混合物进行大小分离，但是它也可以用来运送逐个地从核酸释放的大小类似的核苷酸。因为嘌呤核苷酸(A、G)比嘧啶核苷酸(C、T、U)大，所以前者迁移得更慢，因此，流动通路和/或微流体通道的长度和相应的通过检测单元的时间可保持为最小值，以防止有差异的迁移将从核酸释放的核苷酸次序打乱。作为选择，可以对填充在微毛细管中的介质进行选择，以便使嘌呤和嘧啶核苷酸以相近或相同的迁移速率沿着流动通路和/或微流体通道运动。微毛细管电泳方法已经被公开，例如Woolley and Mathies(Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111348-352，1994)。
在本发明的某些实施方式中，流动通路和/或微流体通道可以包含具有相对高黏度的水溶液，例如甘油溶液。这种高黏度溶液可以降低流速和增加有效的反应时间，例如可用于核苷酸交联到纳米颗粒的反应的时间。
包括微毛细管电泳器件在内的微流体器件的微加工已经被公开，例如，Jacobsen等(Anal.Biochem，209278-283，1994)；Effenhauser等(Anal.Chem.662949-2953，1994)；Harrison等(Science 261895-897，1993)和美国专利5,904,824。这些方法可以包括采用硅母板(silicon master)的微成型技术(micromoldingtechnique)，所述硅母板是在石英、硅或其他晶体衬底或芯片上对微米级通道采用标准的照相平版印刷法或聚焦离子束技术或照相平版蚀刻而制成的。这些技术可容易地适用于本公开的方法和设备中。在本发明的一些实施方式中，使用本领域已知的技术，微毛细管可以用制造反应室所用的同种材料加工。
检测单元 在本发明的各种实施方式中，检测单元被设计成利用拉曼光谱术对核苷酸进行检测和定量。利用拉曼光谱术检测微摩尔浓度的核苷酸的方法在本领域是已知的。(见，例如，美国专利5,306,403；6,002,471；6,174,677)。在单分子水平检测核苷酸的示例性方法在下面的实施例中公开。关于表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)和相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)的变化已经被公开。对于与粗糙金属表面如银、金、铂、铜或铝表面邻近的分子，拉曼检测的灵敏度可提高106或更多倍数。
拉曼检测单元的一个非限制性例子公开在美国专利6,002,471。激发光束由倍频钕:钇铝石榴石(Nd:YAG)激光器产生，波长为532nm；或者由倍频钛:蓝宝石(Ti:sapphire)激光器产生，波长为365nm。可以使用脉冲激光束或连续激光束。激发光束经过共聚焦光学元件和显微物镜，聚焦在流动通路和/或流通池上。来自核苷酸的拉曼发射光由显微物镜和共聚焦光学元件收集，然后连到单色仪上进行光谱分离。共聚焦光学元件用于降低背景信号，包括双色滤片、二次滤片、共聚焦孔、透镜和平面镜。标准的全视场光学元件可以同共聚焦光学元件一起使用。拉曼发射信号由拉曼检测器检测，该检测器包括与用于信号计数和数字化的计算机相连接的雪崩光电二极管。
拉曼检测单元的另一个例子公开在美国专利5,306,403，其包括SpexModel 1403双栅分光光度计，并配有砷化镓光电倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402)，它以单光子计数模式运作。激发源包括来自SpectraPhysics的514.5nm线氩离子激光器，Model 166和氪离子激光器(Innova 70，Coherent)的647.1nm线。
可选择的激发源包括337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的氦-镉激光器(Liconox)(美国专利6,174,677)、发光二极管、Nd:YLF激光器和/或各种离子激光器和/或染料激光器。激发光束可以用带通滤波器(Corion)进行光谱纯化，并可以用6×物镜(Newport，Model L6X)聚焦到流动通路和/或流通池上。可以用物镜来激发核苷酸和收集拉曼信号，其中使用全息光束分离器(KaiserOptical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，以产生激发光束和发射的拉曼信号的直角几何形状。可以使用全息阶式滤波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)来减少瑞利散射。可选择的拉曼检测器包括ISA HR-320光谱摄制仪，其装配有红增强放大电荷耦合器件(RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)。可以使用其他类型的检测器，如傅立叶变换摄谱仪(基于Michaelson干涉仪)、电荷注入仪、光电二极管阵列、InGaAs检测器、电子倍增CCD、增强CCD和/或光电晶体管阵列。
本领域已知的任何适当形式或结构的拉曼光谱术或相关技术都可以用来检测核苷酸，包括但不限于常规拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)、受激拉曼散射术、反拉曼光谱术、受激增益拉曼光谱术、超拉曼散射、分子光学激光检测器(MOLE)或拉曼显微探针或拉曼显微镜或共聚焦拉曼微光谱测定法、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱术、时间分辨共振拉曼、拉曼退耦光谱术或紫外-拉曼显微术。
信息处理和控制系统以及数据分析 在本发明的某些实施方式中，核酸测序设备可以包含信息处理系统。本公开的方法和设备并不限制所使用的信息处理系统的类型。一个示例性的信息处理系统可以包含计算机，其包括用于信息交流的总线和用于信息处理的处理器。在本发明的一个实施方式中，处理器选自Pentium系列处理器，包括但不限于PentiumII系列、PentiumIII系列和Pentium4系列处理器，它们可以从IntelCorp.(Santa Clara，CA)获得。在本发明的可选实施方案中，处理器可以是Celeron、Itanium或Pentium Xeon处理器(Intel Corp.，Santa Clara，CA)。在本发明的各种其他实施方式中，处理器可以基于Intel结构，如IntelIA-32或IntelIA-64结构。作为选择，可以使用其他处理器。信息处理和控制系统可以进一步包括本领域已知的任何外围设备，例如存储器、显示器、键盘和/或其它设备。
在本发明的具体实施方式
中，检测单元可以在操作上连接到信息处理系统。来自检测单元的数据可由处理器处理，然后数据储存在存储器中。关于标准核苷酸的发射谱图的数据也可储存在存储器中。处理器可以比较流动通路和/或流通池中核苷酸的发射光谱，以确定从核酸分子释放的核苷酸类型。存储器也可以储存从核酸分子释放的核苷酸的顺序。处理器可以分析来自检测单元的数据，以确定核酸的序列。当检测到重叠信号时，信息处理系统也可以实施标准程序，例如减去背景信号和确定“碱基判定(basecalling)”。
虽然公开的方法可在程控处理器的控制下进行，但在本发明的可选实施方式中，这些方法可以完全或部分地由可编程的或硬编码的逻辑来实施，例如现场可编程门阵列(FPGAs)、TTL逻辑或专用集成电路(ASICs)。另外，可以通过程序控制的通用计算机组件和/或客户硬件组件的任意组合来实施所公开的方法。
在数据收集操作之后，数据通常会被报告给数据分析操作。为了方便分析操作，由检测单元获得的数据通常是使用数字计算机来分析，如上所述。典型地，计算机被恰当地编程以接受和存储由检测单元获得的数据，以及分析和报告收集到的数据。
在本发明的某些实施方式中，可以使用客户定制软件包来分析由检测单元获得的数据。在本发明的可选实施方式中，可以使用信息处理系统及公开可利用的软件包，进行数据分析。可用于DNA序列分析的有用软件的非限制性例子包括PRISMTMDNA测序分析软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)、SequencherTM软件包(Gene Codes，Ann Arbor，MI)和通过美国国家生物技术信息机构获得的各种软件包，网址为www.nbif.org/links/1.4.1.php。
实施例实施例1核苷酸的拉曼检测方法和设备 在非限定性的例子中，拉曼检测单元的激发光束由钛:蓝宝石激光器(Mira，Coherent)产生，波长为近红外波长(750～950nm)，或由镓铝砷二极管激光器(PI-ECL系列，Process Instruments)产生，波长为785nm或830nm。使用脉冲激光束或连续光束。激发光束被分色镜(Kaiser Optical的全息阶式滤波器或Chroma或Omega Optical的双色干涉滤光器)反射为与收集的光束共线的几何关系。反射的光束通过显微镜物镜(Nikon LU系列)，被聚焦在放置有目标分析物(核苷酸或嘌呤或嘧啶碱基)的拉曼活性基质。
来自分析物的拉曼散射光被同一显微镜物镜收集，并通过分色镜，到达拉曼检测器。拉曼检测器包括聚焦透镜、摄谱仪和阵列检测器。聚焦透镜聚焦拉曼散射光，通过摄谱仪的入口狭缝。摄谱仪(Acton Research)包括光栅，光栅按波长分散光线。分散的光线成像在阵列检测器(RoperScientific公司的背景照明深度耗尽CCD照相机)上。阵列检测器与控制器电路相连，其与计算机连接，以传输数据和控制检测器功能。
对于表面增强拉曼光谱术(SERS)，拉曼活性基质由金属纳米颗粒或覆盖金属的纳米结构组成。用Lee和Meisel(J.Phys.Chem.，863391，1982)的方法，制备银纳米颗粒，大小为5到200nm。可选地，将样品放置在显微镜物件下面的铝基质上。下面讨论的附图是在铝基质上的静止样品中收集的。通过被照明样品的聚光体积，确定检测的分子数目。
使用100μm或200μm的微流体通道，证实SERS检测单个核苷酸的能力。在本发明的各种实施方式中，核苷酸可通过微流体通道(约5到200μm宽)被传送到拉曼活性基质。微流体通道可以用聚二甲基硅氧烷(PDMS)成型(molding)来制造，使用Anderson等公开的技术(“Fabrication of topologicallycomplex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping，”Anal.Chem.723158-3164，2000)。
当SERS在存在银纳米颗粒的情况下进行时，核苷酸、嘌呤或嘧啶分析物与LiCl(最终浓度为90μM)和纳米颗粒(银原子最终浓度为0.25M)混合。使用室温的分析物溶液，收集SERS数据。
结果 使用上面公开的系统，通过SERS，分析核苷单磷酸、嘌呤碱基和嘧啶碱基。表1显示各种感兴趣分析物的当前检测极限。
表1核苷单磷酸、嘌呤和嘧啶的SERS检测
只对腺嘌呤核苷酸进行条件优化。确定LiCl(最终浓度为90μM)，以提供腺嘌呤核苷酸的最佳SERS检测。通过使用其它碱金属卤化物盐例如NaCl、KCl、RbCl或CsCl，可能有助于其它核苷酸的检测。要求保护的方法并不被所用的电解质溶液限制，可以考虑使用其它类型的电解质溶液，例如MgCl、CaCl、NaF、KBr、LiI等。技术人员将认识到，不显示强拉曼信号的电解质溶液将对核苷酸的SERS检测提供最小的干扰。结果表明，上面公开的拉曼检测系统和方法能够检测和鉴定单个分子的核苷酸和嘌呤碱基。这是在单个核苷酸水平上未标记核苷酸的拉曼检测的首次报道。
实施例2核苷酸、嘌呤和嘧啶的拉曼发射光谱 采用实施例1的方案，进行所指明的变化，获得感兴趣的各种分析物的拉曼发射光谱。图4显示四种核苷单磷酸中每一种的100mM溶液的拉曼发射光谱，其中不存在表面增强并且没有拉曼标记。溶液中不加入LiCl。使用100毫秒(msec)的数据收集时间。较低浓度的核苷酸可用较长的收集时间进行检测。激发发生在514nm处。对于下面的每一个图，使用785nm的激发波长。如图4所示，未增强的拉曼光谱显示了四种未标记核苷单磷酸中每一种的特征发射峰。
图5显示1nM鸟嘌呤溶液的SERS光谱，其中存在LiCl和银纳米颗粒。通过酸处理，从dGMP获得鸟嘌呤，如Nucleic Acid Chemistry，Part 1，L.B.Townsend and R.S.Tipson(eds.)，Wiley-Interscience，New York，1978中所讨论的。用100msec的数据收集时间，获得SERS光谱。
图6显示10nM胞嘧啶溶液的SERS光谱，胞嘧啶通过酸水解从dCMP获得。用1秒的收集时间，收集数据。
图7显示100nM胸腺嘧啶溶液的SERS光谱，胸腺嘧啶通过dTMP的酸水解获得。用100msec的收集时间，收集数据。
图8显示100pM腺嘌呤溶液的SERS光谱，腺嘌呤通过dAMP的酸水解得到。数据收集1秒。
图9显示500nM dATP溶液(下曲线)和荧光素标记的dATP溶液(上曲线)的SERS光谱。dATP-荧光素从Roche Applied Science(Indianapolis，IN)购得。该图表明，由于标记了荧光素，SERS信号急剧增加。
实施例3核苷酸和扩增产物的SERS检测银纳米颗粒的形成 根据Lee和Meisel(1982)的方法，产生用于SERS检测的银纳米颗粒。将18毫克AgNO3溶解在100mL(毫升)的蒸馏水中，并加热沸腾。在10min的期间，逐滴加入10mL 1％的柠檬酸钠溶液到AgNO3溶液中。维持溶液再沸腾一小时。将形成的银胶体溶液冷却并存放。
腺嘌呤的SERS检测 拉曼检测系统如实施例1所公开。用2mL蒸馏水稀释1mL银胶体溶液。在铝盘上，将稀释的银胶体溶液(160μL)(微升)与20μL 10nM(纳摩尔)的腺嘌呤溶液和40μL的LiCl(0.5摩尔)混合。LiCl作为腺嘌呤的拉曼增强剂。样品中腺嘌呤的最终浓度是0.9nM，样品的检测体积为约100到150毫微微升，含有估计60个腺嘌呤分子。拉曼发射光谱的收集使用785nm处激发的激发源，收集时间为100毫秒。如图10所示，这个过程说明了60个腺嘌呤分子的检测，其中检测到的强发射峰在大约833nm和877nm处。如实施例1所讨论，已经表明，使用所公开的方法和设备，检测到腺嘌呤的单个分子。
滚环扩增 将1皮摩尔(pmol)的滚环扩增(RCA)引物加入到0.1pmol的环形单链M13DNA模板中。用1×T7聚合酶160缓冲液(20mM(毫摩尔)Tris-HCl、pH7.5、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇)、0.5mM dNTPs和2.5单位的T7 DNA聚合酶，在37℃温育该混合物2小时，形成RCA产物。通过混合和温育不含DNA聚合酶的相同试剂，制备阴性对照(negative control)。
RCA产物的SERS检测 将1μL的RCA产物和1μL的阴性对照样品分开点置于铝盘上并进行空气干燥。用5μL的1×PBS(磷酸盐缓冲的盐水)润洗每个点。重复润洗三次，最后的润洗完毕后，对铝盘进行空气干燥。
将上述制备的1毫升银胶体溶液用2mL蒸馏水稀释。将8微升的稀释银胶体溶液与2μL 0.5M LiCl混合，并加入到铝盘上的RCA产物点上。将同样的溶液加入到阴性对照物点上。按上述收集拉曼信号。如图11所示，RCA产物是SERS可检测的，其中发射峰在约833和877nm处。在此方案的条件下，用LiCl增强剂，腺嘌呤部分的信号强度强于鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的信号强度。阴性对照(未图示)表明，拉曼信号对RCA产物是特异性的，因为在没有扩增的情况下未观察到信号。
实施例4核酸的外切核酸酶消化 按照Sauer等的方法(J.Biotech.86181-201，2001)，进行外切核酸酶处理。在5′端用生物素标记的单个核酸分子通过核酸模板的PCR扩增进行制备，其中使用5′-生物素化寡核苷酸引物。制备锥形的3μm单模式光学纤维(single-mode optical fiber)(SMC-A0630B，Laser Components GmbH，Olching，Germany)。用HF对玻璃纤维进行化学蚀刻，形成锋利的尖端。在涂覆3-巯基丙基三甲氧基硅烷后，用γ-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰胺(GMBS)处理尖端。用链霉抗生物素蛋白活化纤维尖端，其被允许与生物素化DNA结合。通过洗涤，除去未结合的DNA。
将包含单个分子的结合DNA的纤维插入与5μm微通道相连的PDMS反应室。在反应室中加入外切核酸酶I，以起始ssDNA的切割。通过使用光学捕获，将外切核酸酶限制在反应室(例如Walker等，FEBS Lett.45939-42，1999；Bennink等，Cytometry 36200-208，1999；Mehta等，Science 2831689-95，1999；Smith等，Am.J.Phys.6726-35，1999)。光学捕获仪器可从Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+L GmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M.Gmbh(Wolfratshausen，Germany)得到。核苷单磷酸由外切核酸酶消化释放，并通过微流体流动被运输通过拉曼检测器，如实施例1所公开。将90μM浓度的LiCl加入到检测混合物中，用银纳米颗粒填充邻近检测器的微流体通道，所述银纳米颗粒按照Lee和Meisel(1982)的方法制备。当流过拉曼检测器时，单个核苷酸被检测，从而可以测定核酸序列。
实施例5应用拉曼标记的核苷酸进行核酸测序 本发明的某些实施方式被示例于图1中。图1说明用于测序单个单链核酸分子13的方法和设备10，该核酸分子13被连接到反应室11中的固定化表面14上，并在解构反应中被分解。在本发明的这些实施方式中，反应室11包含一个或多个外切核酸酶15，外切核酸酶一次一个地逐个从核酸分子13的未连接端17移去核苷酸16。
当核苷酸16被释放，它们沿流动通路12移动通过检测单元18。检测单元18包括激发源19，例如激光，它发出激发光束20。激发光束20与释放的核苷酸16相互作用，使得电子被激发到较高的能量状态。通过拉曼光谱检测器21检测电子回到较低的能量状态所产生的拉曼发射光谱，拉曼光谱检测器21例如光谱仪、单色仪或电荷耦合器件(CCD)如CCD照相机。
及应室和流动通路的制备 将Borofloat玻璃晶片(Precision Glass&Opitics，Santa Ana，CA)在浓HF(氢氟酸)中预蚀刻一小段时间，进行清洗，然后在等离子体增强化学气相淀积(PECVD)系统(PEII-A，Technics West，San Jose，CA)中沉积无定形硅牺牲层。晶片用六甲基二硅氮烷(HMDS)涂底，然后用感光性树脂(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋涂并烘烤软化。使用接触掩模对准器(Quintel Corp.San Jose，CA)将感光性树脂层曝光于一种或多种掩模图案，然后将曝光的感光性树脂用Microposit显影剂浓缩物(Shipley)和水的混合物除去。显影的晶片被烘烤硬化，然后在PECVD反应器中用CF4(四氟化碳)除去曝光的无定形硅。用浓HF对晶片进行化学蚀刻以制造出反应室11和流动通路12。剥去剩余的感光树脂，并除去无定形硅。采用这些方法，可以制备直径大约50到100μm的微通道。更小直径的通道可以用已知的方法制备，例如在微通道的内部进行涂覆，使直径变小，或者采用纳米制版术(nanolithography)、聚焦电子束技术、聚焦离子束技术或聚焦原子激光技术。制造PDMS微通道的方法在上面做了讨论。
用金刚石打孔钻头(Crystalite，Westerville，OH)在蚀刻的晶片上钻出进入孔。在可程控的真空炉(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中，将蚀刻和钻孔的两个互补平板相互热结合，制得最终的芯片。整合有反应室11和流动通路12的芯片的可选的示例性加工方法公开在美国专利5,867,266和6,214,246中。在本发明的某些实施方式中，将截留值为2500道尔顿分子量的尼龙过滤器插入到反应室11和流动通路12之间，以防止外切核酸酶15离开反应室11。
核酸制备和外切核酸酶处理 根据Sambrook等(1989)的方法，纯化人染色体DNA。在用Bam H1消化之后，将基因组DNA片段插入pBluescriptII噬粒载体(Stratagene，Inc.，LaJolla，CA)的多克隆位点，并在大肠杆菌(E.coli.)中生长。在铺板于含有氨苄青霉素的琼脂糖板上之后，选择单个菌落，并使其生长，用于测序。通过用辅助噬菌体进行共感染，援救基因组DNA插入物的单链DNA拷贝。在蛋白酶K十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中进行消化之后，对该DNA进行苯酚提取，并加入乙酸钠(pH6.5，约0.3M)和0.8体积的2-丙醇使其沉淀。将含有DNA的颗粒重新悬浮在Tris-EDTA缓冲液中，并在-20℃下存放待用。琼脂糖凝胶电泳显示出纯化DNA的单个条带。
与位置邻接于基因组DNA插入物的已知pBluescript序列互补的M13正向引物从Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)购得。这些引物被共价地修饰，以包含与寡核苷酸5′末端连接的生物素部分。通过(CH2)6间隔物，生物素基团与引物的5′-磷酸共价地连接。将标记生物素的引物与由pBluescript载体制备的ssDNA模板杂交。然后按照Dorre等(Bioimaging 5139-152，1997)的方法，将引物-模板复合体与包被有链酶抗生素蛋白的珠子14连接。在合适的DNA稀释下，单个引物-模板复合体与单个珠子14连接。将含有单个引物-模板复合体的珠子14插入到测序设备10的反应室11中。
将引物-模板与修饰型T7DNA聚合酶(United States BiochemicalCorp.，Cleveland，OH)一起温育。反应混合物包含未标记的脱氧腺苷-5′-三磷酸(dATP)和脱氧鸟苷-5′-三磷酸(dGTP)、地高辛标记的脱氧尿苷-5′-三磷酸(地高辛-dUTP)以及罗丹明标记的脱氧胞苷-5′-三磷酸(罗丹明-dCTP)。使聚合反应在37℃下进行2小时。在合成地高辛和罗丹明标记的核酸13之后，将模板链与标记的核酸13分离，并将模板链、DNA聚合酶和未整合的核苷酸从反应室11中洗掉。
通过加入外切核酸酶III 15到反应室11中，起始外切核酸酶15的活性。将反应混合物维持在pH8.0和37℃。当核苷酸16从核酸13的3′端17释放时，它们通过微流体流动被运输，沿流动通路12，通过检测单元18。
实施例6应用与纳米颗粒的共价连接，对核酸测序 本发明的另一个示例性实施方式公开在图2中。通过外切核酸酶活性，将核苷酸130从核酸释放，如上所讨论的。在本发明的某些实施方式中，核苷酸130未标记。采用外切核酸酶处理，可以对未标记核酸进行测序，未标记核酸直接纯化自任何器官、组织和/或细胞样品或用已知的克隆方法获得。释放的核苷酸130沿微流体通道110移动。
将释放的核苷酸130与银纳米颗粒140混合，银纳米颗粒140按照Lee和Meisel(J.Phys.Chem.863391-3395，1982)的方法制备。所述纳米颗粒的大小为5到200nm。在暴露于核苷酸130之前，用硅烷如3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)，一种活性接头化合物包被表面修饰的纳米颗粒140。GOP包含末端的高活性环氧基团。将硅烷化的纳米颗粒140与核苷酸130混合，并使之与核苷酸130形成共价交联。核苷酸-纳米颗粒复合体150通过流通池170，通过拉曼检测单元180被SERS、SERRS和/或CARS鉴定。由于核苷酸130非常靠近纳米颗粒140，因此拉曼信号被大大增强，使得可以检测通过流通池170的单个核苷酸130。
实施例7.用于核酸测序的设备 图3显示本发明的另一个示例性实施方式。DNA测序设备210包括与流入通道230和流出通道240具有流体交流(fluid communication)的反应室220。通过使用一个或多个阀250，可以控制流体的移动。微流体通道260也与反应室220有着流体交流。通过外切核酸酶活性从一个或多个核酸释放的核苷酸通过微流体通道260流出反应室220。核苷酸与通过纳米颗粒通道270的纳米颗粒混合，纳米颗粒通道270与微流体通道260有着流体交流。核苷酸与纳米颗粒的共价连接发生在连接通道280内。共价结合的核苷酸-纳米颗粒复合体通过流通池290，在此处，通过拉曼检测单元300对核苷酸进行鉴定。检测单元300包括激光器320和拉曼检测器310。激光器发射激发光束330，激发流通池290内的核苷酸。激发的核苷酸发出拉曼信号，被拉曼检测器310检测。
在本发明的某些实施方式中，可以在循环室340中回收纳米颗粒。对这些纳米颗粒进行化学处理，例如用酸溶液，然后洗涤，除去结合的核苷酸、接头化合物和任何其它连接的或吸附的分子。通过循环通道360，可以将纳米颗粒循环回到纳米颗粒容器370。在本发明的一些实施方式中，可以在循环通道360和/或纳米颗粒容器370中用接头化合物如GOP包被纳米颗粒。通过废物通道350，废物流出物从循环室340中被除去。
根据本公开内容，这里公开的和要求保护的所有方法和设备都可以被制造和使用，而无需过度的实验。对本领域技术人员来说，明显的是，在不偏离要求保护的主题的概念、精神和范围的情况下，可以对这里所述的方法和设备进行改变。更具体地，明显的是，化学及生理学上相关的某种试剂可以替代这里所述的试剂，而获得相同的或相似的结果。所有这些类似的替代和修饰对本领域技术人员而言是明显的，它们都被认为在所要求保护主题的精神、范围和概念之内。
权利要求
1.一种方法，包括a)使用外切核酸酶，从一个或多个核酸分子的一端释放未标记的核苷酸；b)将所述核苷酸与所述外切核酸酶和所述一个或多个核酸分子分离；c)用拉曼光谱术，鉴定所述未标记的核苷酸；以及d)从所述鉴定的核苷酸，确定所述核酸的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中用拉曼光谱术鉴定未标记核苷酸的单个分子。
3.如权利要求2所述的方法，其中对单个核酸分子测序。
4.如权利要求1所述的方法，其中对多个核酸分子同时测序。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个核酸分子被连接于表面。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸用表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)鉴定。
7.一种方法，包括a)从一个或多个核酸分子的一端逐个移去核苷酸；b)将每个核苷酸与至少一个纳米颗粒连接；d)用拉曼光谱术，鉴定所述核苷酸；以及e)确定所述核酸的序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中用拉曼光谱术鉴定核苷酸的单个分子。
9.如权利要求8所述的方法，其中对单个核酸分子测序。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述核苷酸未被标记。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述纳米颗粒用一种或多种接头化合物修饰。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述核苷酸与所述接头化合物共价连接。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述接头化合物是3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述核苷酸在从所述核酸移去之后，与纳米颗粒连接。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述核苷酸在从所述核酸移去之前，与纳米颗粒连接。
16.如权利要求15所述的方法，其中纳米颗粒与所述核酸的3′端连接。
17.如权利要求7所述的方法，其中所述核苷酸用表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)鉴定。
18.如权利要求7所述的方法，进一步包括将所述核苷酸与所述一个或多个核酸分子分离。
19.如权利要求7所述的方法，其中使用外切核酸酶，从所述核酸移去所述核苷酸。
20.如权利要求16所述的方法，其中通过酸水解，移去所述核苷酸。
21.如权利要求20所述的方法，进一步包括，采用酸水解，从所述核苷酸移去嘌呤或嘧啶碱基。
22.一种方法，包括a)获得与拉曼标记连接的核苷酸；b)合成包含标记核苷酸的核酸；c)从所述核酸的一端移去核苷酸；d)用拉曼光谱术鉴定所述核苷酸；以及e)确定所述核酸的序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中用拉曼光谱术鉴定单个核苷酸分子。
24.如权利要求22所述的方法，其中每一类型的核苷酸用可区分的拉曼标记进行标记。
25.如权利要求22所述的方法，其中只有嘧啶核苷酸用拉曼标记进行标记。
26.如权利要求22所述的方法，进一步包括(i)获得至少一个模板核酸分子；(ii)将所述模板核酸分子与引物杂交；和(iii)加入DNA聚合酶，合成所述核酸。
27.一种设备，其包括a)反应室；b)与所述反应室具有流体交流的微流体通道；c)与所述微流体通道具有流体交流的流通池；以及d)与所述流通池可操作地连接的拉曼检测单元。
28.如权利要求27所述的设备，其中所述拉曼检测器能够检测核苷酸的单个分子。
29.如权利要求28所述的设备，其中所述核苷酸未被标记。
30.如权利要求27所述的设备，进一步包括在流通池中的纳米颗粒。
全文摘要
这里所公开的方法和设备涉及通过增强拉曼光谱术进行的核酸测序。在本发明的某些实施方式中，在整合进核酸之前，将核苷酸与拉曼标记共价连接。在其它实施方式中，使用未标记的核酸。核酸的外切核酸酶处理导致释放出标记或未标记核苷酸，核苷酸用拉曼光谱术检测。在本发明的可选实施方式中，通过外切核酸酶处理，从核酸释放的核苷酸与纳米颗粒共价交联，并用表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)和/或相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)检测。本发明的其它实施方式涉及用于核酸测序的设备。
文档编号C12Q1/68GK1894421SQ03827166
公开日2007年1月10日 申请日期2003年9月15日 优先权日2003年9月12日
发明者X·苏, A·A·伯林, S·陈, S·J·柯奇, T-W·丘, G·纽鲍尔, V·拉奥, N·桑达拉赞, M·山川 申请人:英特尔公司