一种基于表面增强拉曼散射技术的检测芯片、制备方法以及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于表面增强拉曼散射技术的检测芯片，包括：纳米金属基底；两种或两种以上的信号分子，均匀分布于纳米金属基底上；以及两种或两种以上的用于检测肿瘤标志物的探针序列，分别固定于不同的信号分子上。本发明还提供了所述检测芯片的制备方法以及包含其的检测试剂盒。本发明的检测芯片以及检测试剂盒通过不同微区固定不同拉曼信号分子，结合纳应力传感技术实现对多种肿瘤标志物的一步、同时、灵敏、定量检测，具有巨大的应用潜力。
【专利说明】
-种基于表面増强拉曼散射技术的检测巧片、制备方法从及 试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及生物检测领域，具体设及一种基于表面增强拉曼散射技术的检测忍 片、其制备方法W及包含所述检测忍片的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肿瘤标志物microRNAs(miRNAs)伴随着肿瘤的发生、生长、转移和治疗过程，呈现 出不同的表达水平。miRNA的定量、高灵敏检测可W用于诊断早期肿瘤，提高病人的生存率， 在肿瘤的诊断和治疗方面具有非常重要的意义。目前对miRNAs的定量检测方法包括 Nodhern blotting、QT-PCR、巧光法、微阵列法、S邸S法等。
[0003] 目前，S邸S(表面增强拉曼散射)法中的双溫度杂交法检测miRNA只能一次检测一 种miRNA，且步骤较多。其过程如下：在SERS基底上连接上与目标待测物部分互补的捕捉探 针，用于捕捉目标待测物，再在待测物剩余片段上连接信号探针，W产生SERS信号。然而，在 SERS法检测中，目标待测物miRNA本身SERS信号极弱，直接检测时，谱图中干扰峰特别多，不 易获得其结构和浓度信息。因此现有的方法多数通过设计合理的生物忍片，将miRNA的浓度 和结构信息，转化为信号分子的强度或位移信息，但上述检测方法多数只能用来检测单个 miRNA，两种及W上标志物同时检测的研究未见报道。
[0004] 癌症是一种复杂的疾病，同一种标志物可能出现在不同肿瘤中，而一种肿瘤中也 会包含多种标志物，仅对一种标志物进行检测很难反映肿瘤的发展和治疗状态。因此，多种 标志物的联合检测，能极大提高肿瘤诊断的准确性，对癌症早诊具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术中无法多种肿瘤标记物联合检测的缺陷，本发明的目的是提供一 种基于表面增强拉曼散射(SERS)技术的检测忍片，可同时检测多种标记物，且准确性、灵敏 度更优。
[0006] 本发明的另一目的是提供所述检测忍片的制备方法W及包含所述检测忍片的检 测试剂盒。
[0007] 本发明提供的基于表面增强拉曼散射技术的检测忍片，包括W下组成：
[000引纳米金属基底；
[0009] 两种或两种W上的信号分子，均匀分布于所述纳米金属基底上；W及
[0010] 两种或两种W上的用于检测肿瘤标志物的探针序列，分别固定于不同的所述信号 分子上。
[0011] 本发明的检测忍片中，选用纳米金属基底具有更好的灵敏性，所述纳米金属基底 可选用检测忍片领域常见的纳米基底，也可按照现有方法即时制备，包括但不限于纳米银、 纳米金或纳米铜的基底;优选为纳米银基底。
[0012] 本发明的检测忍片中，所述信号分子的选择需满足：1)表面增强拉曼散射特征峰 可明显互相区分；2)可印刷于纳米金属基底上并具备活性基团与探针序列相连。所述信号 分子包括但不限于对琉基苯甲酸、5,5'-二硫代双(班巧酷亚氨基-2-硝基苯甲酸）、对琉基 苯胺、对琉基苯棚酸、2-硝基-5-琉基苯甲酸或2-氨基-6-琉基嚷岭。
[0013] 本发明的检测忍片中，所述探针序列与所述信号分子之间包含有桥联基团，桥联 基团可W增加固定在基底上的探针序列的灵活性，从而不影响其与目标miRNA的结合。所述 桥联基团可W为碳原子数20W下的直链饱和烷基;优选碳原子数为3~6的直链饱和烷基。
[0014] 本发明的检测忍片优选包括W下组成：
[0015] 纳米银基底；
[0016] 两种信号分子对琉基苯甲酸W及5,5'-二硫代双(班巧酷亚氨基-2-硝基苯甲酸）， 均匀分布于所述纳米银基底上；W及
[0017] 两种用于检测肿瘤标志物的探针序列，分别固定于所述两种信号分子上。
[0018] 本发明提供的检测忍片制备方法，包括W下步骤：
[0019] S1:制备纳米金属基底；
[0020] S2:使用微接触印刷技术在所述纳米金属基底上分别印刷两种或两种W上的信号 分子使其均匀分布于所述纳米金属基底上；
[0021] S3:使两种或两种W上的用于检测肿瘤标志物的探针序列分别与不同的所述信号 分子结合。
[0022] 步骤S2中，微接触印刷技术可使用现有的工艺技术或简单变型，印刷不同信号分 子没有顺序限定，优选地，可先印刷生长速度较慢的信号分子。
[0023] 进一步地，所述步骤S3包括：
[0024] S31:修饰所述探针序列使其含有与所述信号分子结合的活性基团；
[0025] S32:将步骤S31所得的探针序列通过所述活性基团分别与不同的所述信号分子反 应W使所述探针序列与所述信号分子结合。
[0026] 进一步地，所述步骤S31还包括修饰所述探针序列使所述探针序列与所述活性基 团之间含有桥联基团。
[0027] 步骤S32中，通常可先使反应活性较高的信号分子与探针结合，反应完毕后将反应 位点封闭，然后再进行其他信号分子的反应，必要时，也可采用保护基团W保证未反应的信 号分子不受影响，进而保证不同信号分子与不同探针序列的特异性结合。
[0028] 步骤S32中，当信号分子上的活性基团反应活性较小时，也可使用活化剂提高反应 活性。活化剂的种类可根据信号分子的活性基团使用有机反应领域的常见种类。
[0029] 本发明还提供了一种用于检测肿瘤标志物的试剂盒，其包含W上技术方案任一项 所述的基于表面增强拉曼散射技术的检测忍片。
[0030] 本发明的检测忍片在纳米金属基底上，利用微接触印刷技术，构筑不同的功能微 区，印刷SERS特征峰区别明显的不同信号分子，然后把对应于不同标志物的检测探针序列 分别固定在对应的信号分子上，再通过目标待测物miRNA与探针序列之间的特异性相互作 用检测目标miRNA，目标miRNA与探针特异性结合前后会对信号分子的某个(些)拉曼峰位移 产生影响，分析拉曼峰位移的大小即可得到miRNA的浓度信息。
[0031] 本发明的检测忍片具有W下优点：
[0032] (1)选用灵敏性更高的纳米金属基底W及不同种类的信号分子，通过信号分子的 特征峰的峰位置区别，可同时检测多种肿瘤标志物，实现了联合检测，提高了检测效率。
[0033] (2)采用微接触印刷技术，可使不同信号分子均匀印刷至纳米金属基底上形成不 同的功能微区，检测探针与信号分子的化学键合，不会互相影响，因而可提高检测的灵敏度 W及准确性，而且，信号分子的均匀分布还能够保证miRNA的浓度信息转化为稳定的、重现 性更好的SERS信号，从而使检测过程具有良好的重现性。
[0034] (3)利用纳应力传感，将miRNA的浓度信息转化为信号分子的特征峰位移量，从而 可W通过其来检测miRNA的绝对浓度，检测准确性更高。
[0035] (4)制备过程步骤少，避免了过多的干扰因素，从而进一步保证了检测结果的准确 性。
[0036] 本发明的检测忍片W及检测试剂盒通过不同微区固定不同拉曼信号分子，结合纳 应力传感技术实现对多种标志物的一步、同时、灵敏、定量检测，具有巨大的应用潜力。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明实施例所述检测忍片的制备过程示意图（两种信号分子）；
[003引图2A为本发明实施例检测过程中信号分子的SERS谱图；图2B为信号分子对琉基苯 甲酸(MBA)特征峰的放大图；图2C为信号分子5,5'-二硫代双(班巧酷亚氨基-2-硝基苯甲 酸KDSNB)特征峰的放大图；图2D为C-S键的拉曼信号峰;其中：曲线a表示印刷信号分子MBA 后的SERS图，曲线b表示在SERS基底空白处连接上第二种信号分子DSNB后的SERS图，曲线C 表示连接上探针后的SERS图，曲线d表示检测miRNA后SERS图；
[0039] 图3A、3B分别为本发明实施例两种miRNA的浓度与不同信号分子峰位移的关系 (error bar为5次试验所得结果的标准偏差）；
[0040] 图4为本发明实施例中2-氨基-6-琉基嚷岭印刷在纳米银基底后的SERS谱图。
【具体实施方式】
[0041 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 实施例
[0044] 如图1所示，W两种标志物的检测为例，先用表面具有微阵列结构的聚二甲基娃氧 烧(PDMS)印章在银岛基底上印刷信号分子MBA。再在其他区域生长上信号分子DSNB，形成多 种信号分子均匀、间隔分布的表面功能微区结构;控制反应条件使探针1和探针2先后与信 号分子1和信号分子2特异性结合;最后，探针1和探针2分别与目标待测物特异性杂交，对底 部的信号分子的结构造成影响，从而产生峰位移。具体过程如下：
[0045] 1.银岛基底制备
[0046] 1 X 1cm2的娃片/玻璃片在乙醇和丙酬中分别超声lOmin，吹干后置于piranha洗液 化2SO4/此化=3:1，v/v)中，加热到95°C清洗40min。用超纯水彻底清洗娃片/玻璃片后，吹 干，置于(3-琉丙基)立甲氧基硅烷的甲苯溶液中（2%)修饰化。分别用甲苯、丙酬和乙醇，将 娃片/玻璃片清洗干净后待用。
[0047] 称取440mg的硝酸银，置于80mL的烧杯中，加入50mL水，揽拌均匀。边快速揽拌边向 硝酸银溶液中缓慢加入13扣L NaOH( 10 % )生成灰绿色沉淀。向烧杯中逐滴加入2血10 %氨 水溶液，直至沉淀消失。将溶液置于冰水浴中冷却。向冷却后的溶液中加入3(Κ)化戊二醒溶 液(25%)，反应10s后，置于90°C水浴中，并将修饰好的娃片/玻璃片贴壁放置在溶液中。反 应4min，银纳米粒子在娃片/玻璃片上生长，形成银岛基底。立即取出银岛，置于预先冷却的 乙二醇中，终止生长。超声20s除去非特异性附着的银纳米粒子，待用。
[004引 2.印章制备
[0049] 7μπιΧ化m排列的Si微阵列模板，分别用乙醇和丙酬超声清洗lOmin，吹干后置于 Piranha洗液中，加热到95 °C清洗40min，用超纯水清洗干净，并吹干。将模板置于20化全氣 硅烷的蒸汽中，修饰15min，并固定在一次性比色皿开口处(微阵列面朝内）。一次性比色皿 底部开口待用。将聚二甲基硅氧烷和固化剂按10:1的比例揽拌均匀，静置待气泡消失后，从 一次性比色皿底部缓慢注入。比色皿置于60°C烘箱，固化化即得到印章。
[0050] 3.表面微纳结构构筑
[0051 ] 向印章表面上滴加20化MBA的乙醇溶液，静置Imin并吹干。印章与银岛接触Imin， 使印章上的MBA在银岛上生长。再将银岛置于5mM DSNB的乙腊溶液中，反应4h使银岛未生长 MBA的空白区域生长上DSNB，得两种信号分子微区均匀分布的修饰银岛。
[0化2] 4.探针修饰
[0053]将信号分子修饰的银岛置于ΙΟμΜ的胺基化修饰的探针1(序列为SEQ ID N0:1，分 子结构见表1，BI0肥邸公司）溶液中（3 X SSC(巧樣酸钢缓冲液），抑7.4，含0.04%十二烷基 硫酸钢），室溫下反应地，使探针1与DSNB结合而固定到基底上。将基底转移到lOOiiM的下胺 (3 X SSC，抑7.4)溶液中，室溫下继续反应40min，封闭未反应的DSNB位点。将银岛转移到含 N服（lOmM)和邸C(50mM)的憐酸盐缓冲液中（pH 6.8，lOmM)，反应化，活化MBA末端的簇基。用 2 X SSC(pH 7.4，含0.1 %十二烷基硫酸钢)清洗后，转移到含ΙΟμΜ的胺基化修饰的探针2(序 列为SEQIDN0:2，分子结构见表l，BI0肥ER公司）的溶液中（3XSSC，pH7.4，pH7.4，含 0.04%十二烷基硫酸钢），使探针2与MBA结合固定到基底上。测定基底的SERS谱图，得到检 测前的信号分子位移。
[0 化 4] S.miRNA 检测
[00对探针修饰的基底分别置于含10-6-10-"M，W及不含miRNA的5 X SSC溶液中（pH 7.4， 含0.01 %十二烷基硫酸钢），置于42°C杂交16h，测定基底的SERS谱图，得到检测后信号分子 位移。
[0化6] 6.结果分析
[0057]基底上信号分子的谱图变化见图2A-2D。首先，利用微接触印刷技术，印刷上信号 分子MBA，检测SERS谱图，发现在1068cm-哺1581cm-i处有MBA的特征峰；生长上第二种信号 分子DSNB后，在1334cnfi处检测到DSNB的特征峰;信号分子连接上探针分子后，MBA和DSNB的 特征峰都发生了红移;与两种miRNA特异性结合后，MBA和DSNB的特征峰再次发生红移，位移 量与miRNA的浓度相关。由此可同时对两种miRNA进行定量检测。
[0化引图3A、3B是miRNA浓度与信号分子峰位移的关系。miRNA 1(SEQ ID N0:3,序列见表 Ι,ΒΙΟ肥邸公司）的浓度由信号分子MBA特征峰的位移量反应，检测极限可达到l0-i6mol/L; miRNA 2(SEQ ID N0:4,序列见表Ι,ΒΙΟ肥邸公司）的浓度由信号分子DSNB特征峰的位移量 反应，检测极限可为l0-i6mol/L。
[0059]表1实施例中使用的miRNA及其相应探针序列
[0060]
[0061] 7. Ξ种信号分子
[0062] 在前述基础上，可增加为Ξ种信号分子，例如MBA、DSNBW及2-氨基-6-琉基嚷岭 (结构式如下所示）。
[0063]
[0064] 如图4所示，2-氨基-6-琉基嚷岭印刷在纳米银基底后的拉曼谱图中，其特征峰在 1300cnf 1处，结合图2A-2D可知:2-氨基-6-琉基嚷岭的特征峰与MBA、DSNB的特征峰是可W明 显区分开的，由此可制备同时检测Ξ种肿瘤标志物的检测忍片。
[0065] 除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。
[0066] 本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用W限制本发明的保护范围， 本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于 上述实施方式，而仅由权利要求限定。
【主权项】
1. 一种基于表面增强拉曼散射技术的检测芯片，包括以下组成： 纳米金属基底； 两种或两种以上的信号分子，均匀分布于所述纳米金属基底上；以及 两种或两种以上的用于检测肿瘤标志物的探针序列，分别固定于不同的所述信号分子 上。2. 根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述纳米金属基底选自纳米银、纳米 金或纳米铜的基底。3. 根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述信号分子选自对巯基苯甲酸、5， 5 二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸）、对巯基苯胺、对巯基苯硼酸、2-硝基-5-巯基 苯甲酸或2-氨基-6-巯基嘌呤。4. 根据权利要求1-3任一项所述的检测芯片，其特征在于，所述探针序列与所述信号分 子之间包含有桥联基团;所述桥联基团为碳原子数为3~6的直链饱和烷基。5. 根据权利要求1-4任一项所述的检测芯片，其特征在于，所述检测芯片，包括以下组 成： 纳米银基底； 两种信号分子对巯基苯甲酸以及5,5'_二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸），均匀 分布于所述纳米银基底上；以及 两种用于检测肿瘤标志物的探针序列，分别固定于所述两种信号分子上。6. 权利要求1-5任一项所述检测芯片的制备方法，包括以下步骤： S1:制备纳米金属基底； S2:使用微接触印刷技术在所述纳米金属基底上分别印刷两种或两种以上的信号分子 使其均匀分布于所述纳米金属基底上； S3:使两种或两种以上的用于检测肿瘤标志物的探针序列分别与不同的所述信号分子 结合。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3包括： S31:修饰所述探针序列使其含有与所述信号分子结合的活性基团； S32:将步骤S31所得的探针序列通过所述活性基团分别与不同的所述信号分子反应以 使所述探针序列与所述信号分子结合。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S31还包括修饰所述探针序 列使所述探针序列与所述活性基团之间含有桥联基团。9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S32在活化剂存在下进行反 应。10. -种用于检测肿瘤标志物的试剂盒，其包含权利要求1-5任一项所述的基于表面增 强拉曼散射技术的检测芯片。
【文档编号】G01N21/65GK105823768SQ201610262077
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】李敏, 朱文凤, 赵宇亮
【申请人】中国科学院高能物理研究所