专利名称：活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法与成形系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法与成形系统。属于组织工程学与软骨组织修复领域。
背景技术：
因创伤、运动损伤、炎症和组织退变等原因引起的关节组织缺损或损伤在临床上十分常见。由于软骨组织中没有血管、神经和淋巴系统，软骨细胞被限制在由胶原和蛋白多糖组成的致密陷窝内，自身代谢活力较低，因此关节软骨再生与自我修复能力极为有限。关节软骨一旦损伤，如果得不到适当的治疗，损伤的软骨不仅不能被透明软骨修复，反而可能因为磨损加重而引起软骨下骨损伤，发展成为骨性关节疾病，导致关节疼痛、关节功能紊乱甚至整个关节功能丧失。因此，如何实现关节软骨及软骨下骨缺损的修复和功能重建成为目前医学研究的重点之一。组织工程技术的出现与快速发展，为关节软骨组织缺损修复提供了新的思路和方法。组织工程的本质在于通过构建细胞-支架材料的复合体来修复或再生缺损的组织或器官。由于人体关节软骨与软骨下骨的细胞组成与空间结构各不相同，如何构建理想的骨软骨一体化支架以及实现细胞与支架材料的有效复合是利用组织工程技术修复关节软骨组织损伤的关键。理想的组织工程骨软骨一体化支架应当具备一下特点:(I)在支架材料组成方面，应当具有良好的生物相容性与细胞亲和性以利于细胞黏附、增殖和分化。同时，软骨下骨层支架应当具备良好的力学强度以支撑缺损部位的负载，并未软骨支架的固定提供有效的支撑；(2)在支架物理结构方面，一体化支架的三维贯通孔结构在支架高度方向应该具有梯度变化，以满足骨与软骨组织细胞对生存环境的不同要求；(3)在组织培养方面，细胞在支架内部应当可以实现空间定位和立体分布的可控操作，以满足具有不同功能、结构要求的复杂组织和器官的修复或再生。目前，常用的组织工程骨软骨一体化支架制备工艺组要分为传统制备工艺和快速成形工艺两大类。利用层压、纤维粘接与熔融铸型等传统工艺制备的一体化支架主要依靠手工和模具成形，支架内部的孔隙贯通度不佳，支架孔隙率与孔径分布不可控，支架结构与性能的制备重复性较差，难以满足关节软骨组织修复的要求；选择性激光烧结、低温沉积成形、立体光刻和三维打印等快速成形制备工艺能够弥补传统工艺的不足，制备出结构复杂、孔隙率与孔径大小可控且重复性好的一体化支架。但是，由于各种快速成形工艺对加工条件与所适用的材料种类都有严格的要求；无法用于成形生物性能优异的天然生物材料；难以获得精度要求较高的组织工程支架。由于材料的成形需要利用专用的工具在较为极端的温度环境下进行，因此利用快速成形工艺制备的组织工程支架只适用于先成形支架后接种细胞的传统组织工程培养模式。该培养模式下，细胞只能由支架表面向内部单向生长，无法满足自然组织中细胞三维均衡生长的要求；在培养过程中，难以实现细胞在支架内部立体空间的可控定位与分布，不利于具有功能梯度要求的组织或器官生成。
发明内容
本发明的目的在于针对现有组织工程骨软骨支架在制备与细胞培养方面的不足，提供一种活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法和成形系统，成形具有细胞活性、良好力学性能以及梯度结构的骨软骨一体化支架，为成形后的细胞提供适宜的生存环境，便于细胞的生长与分化。为达到上述目的，本发明的技术方案如下:
一种活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法，其特征在于操作步骤如
下:
O 将离子浓度敏感材料与促凝胶化天然生物材料分别制备成质量分数为3.6^4.4%和18 22%的水溶液，经灭菌后备用；
2)将种子细胞与所制备的离子浓度敏感材料和促凝胶化天然生物材料水溶液按照质量比为1:5:2.5 1:5:10充分混合均匀，制备成凝胶状细胞-生物材料混合单元；将合成高分子生物材料经过消毒，加热到熔融状态；将细胞-生物材料混合单元与熔融态高分子生物材料分别倒入不同的料筒中。根据事先设计好的支架结构与成形路径，在4°C ±0.5°C环境温度中通过计算 机系统的控制将细胞-生物材料混合单元与熔融态高分子生物材料由同轴喷头挤出，在空间的指定位置逐层增量成形一体化梯度支架中三维通孔尺寸较大的软骨下骨层支架部分；
3)当软骨下骨层支架成形完成后关闭熔融态高分子生物材料的供料动力，使喷头只挤出细胞-生物材料混合单元，在软骨下骨层支架的基础上继续增量成形一体化梯度支架中三维通孔直径较小的软骨层支架部分，最终得到具有细胞活性的骨软骨一体化梯度支架；
4)在逐层增量成形一体化梯度支架的过程中，每完成一层支架材料的挤出成形后，支架材料接收平台就下降一定高度，使刚成形的支架层浸入到含有触发离子的水浴溶液中，离子浓度敏感材料与溶液产生交联反应并为支架材料中的种子细胞提供多水的生存环境。本发明所述的离子浓度敏感材料为海藻酸钠，促使材料进行凝胶化转变的天然生物材料为明胶，所述的合成高分子生物材料为分子量为15，000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)。所述的触发离子为Ca2+,水浴溶液为饱和氯化I丐溶液。所述的一体化梯度支架是由细胞-生物材料混合单元构成、孔隙直径10(Γ150 μ m的软骨层支架与细胞-生物材料混合单元包裹PLGA构成的包芯材料组成、孔径尺寸20(Γ250 μ m的软骨下骨层支架经过逐层堆积成形得到的。一种活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形系统，应用于上述方法实现成形，包括:三维运动系统、同轴喷头挤出单元、气泵、支架材料接收板、水浴池、计算机控制系统和料筒，其特征在于:所述气泵、同轴喷头挤出单元、料筒安装在三维运动系统上，处于水浴池上方，可实现X-Y平面运动；支架材料接收板与三维运动系统联接，可实现Z方向运动，且支架材料接收板置于水浴池中；计算机控制系统与三维运动系统相连，根据预先设计好的支架模型以及路径规划，控制同轴喷头挤出单元在X-Y平面的运动轨迹以及每成形一层支架后支架材料接收板在水浴池中下降的高度，以实现支架结构与三维通孔的可控成形并使已成形的支架浸入水浴中；气泵通过供气软管分别与装有细胞-生物材料混合单元和熔融高分子生物材料的料筒相连，通过计算机控制系统对气泵供气的启、停控制，实现不同材料的有序挤出，最终成形由不同材料构成，具有梯度结构变化的活性骨软骨一体化梯度支架。本发明与现有技术相比较具有以下突出的实质性特点和显著的技术进步:
I)本发明引入增量成形工艺用于成形含有细胞的骨软骨一体化梯度支架的制备。基于离散-堆积成形原理的增量成形工艺是一种在计算机系统精确控制下能够成形具有复杂内、外形状结构要求的高柔性成形工艺。将该工艺与同轴喷头相结合，可用于成形由多种材料组成、具有复杂梯度结构要求的组织、器官支架。2)本发明将细胞作为可成形生物材料加入到组织工程支架的制备过程中。本发明所述由离子敏感材料与促凝胶化天然生物材料混合制得的凝胶状单元材料能够将大量的水分锁定在凝胶材料中，能够为细胞提供基本的生存环境。同时，凝胶态的材料具有良好的可成形性，能够在适宜细胞生存的温度环境范围之内进行材料成形，不仅保证在支架成形前后细胞都处在适合的生存环境中，而且还能够实现细胞-生物材料混合单元的三维立体成形。3)将同轴喷头与挤出成形工艺相结合，利用细胞-生物材料混合单元包裹PLGA所组成的同轴材料成形一体化支架中的软骨下骨层部分，软骨层支架则完全由细胞-生物材料混合单元构成。合成高分子生物材料能够为支架提供所需的力学性能，为软骨层再生提供牢固的力学支撑，同时在合成高分子生物材料外层包裹一层细胞-生物材料混合单元也同时实现了对软骨下骨层支架的表面改性，提高了支架的生物相容性与细胞亲和性；完全由细胞-生物材料混合单元构成的软骨层支架因含有大量的种子细胞而有利于软骨组织的再生。4)本发明所述成形工艺可一次性成形由不同材料组成，具有梯度结构变化的骨软骨一体化梯度支架，支架中软骨与软骨下骨层之间不存在明显的界面力学缺陷。5)本发明所述的工艺方法将工程制造所适用的材料范围扩展到具有生物活性的生命体领域。该工艺方法不仅能够实现细胞的直接三维受控组装成形，解决了利用组织工程技术进行组织与器官再生时无法实现细胞在三维空间中的精确定位与立体生长；同时，包裹合成高分子材料的同轴支架纤维不但具有生物活性，还弥补了细胞-生物材料混合单元自身力学性能不足的缺点。本发明的提出是对传统加工、制造工艺概念的重要突破，为具有细胞活性的骨、软骨类硬支架的制备提供了新的思路。
图1为活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形工艺路线图。图2为活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形系统结构示意图。
具体实施例方式本发明的优选实施例结合附图详述如下:
实施例一: 参见图1，本活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法，其特征在于操作步骤如下:
1)将离子浓度敏感材料与促凝胶化天然生物材料分别制备成质量分数为3.6^4.4%和18 22%的水溶液，经灭菌后备用；
2)将种子细胞与所制备的离子浓度敏感材料和促凝胶化天然生物材料水溶液按照质量比为1:5:2.5 1:10:10充分混合均匀，制备成凝胶状细胞-生物材料混合单元；将合成高分子生物材料经过消毒，加热到熔融状态；将细胞-生物材料混合单元与熔融态高分子生物材料分别倒入不同的料筒中；根据事先设计好的支架结构与成形路径，在4°C ±0.5°C环境温度中通过计算机系统的控制将细胞-生物材料混合单元与熔融态高分子生物材料由同轴喷头一同挤出，在空间的指定位置逐层增量成形一体化梯度支架中三维通孔尺寸较大的软骨下骨层支架部分；
3)当软骨下骨层支架成形完成后，关闭熔融态高分子生物材料的供料动力，使喷头只挤出细胞-生物材料混合单元，在软骨下骨层支架的基础上继续增量成形一体化梯度支架中三维通孔尺寸较小的软骨层支架部分，最终得到具有细胞活性的骨软骨一体化梯度支架；
4)在逐层增量成形一体化梯度支架的过程中，每完成一层支架材料的挤出成形后，支架材料接收平台就下降一定高度，使刚成形的支架层浸入到含有触发离子的水浴溶液中，离子浓度敏感材料与溶液产生交联反应并为细胞提供多水的生存环境。实施例二:
本实施例与实施例一基本相同，特别之处是:所述的活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法，所述步骤I)中的离子浓度敏感材料为海藻酸钠，促使材料进行凝胶化转变的天然生物材料为 明胶，合成高分子生物材料为分子量为15，000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA);所述步骤2)和步骤3)中的一体化梯度支架中，三维通孔尺寸较小的软骨层支架由凝胶态细胞-生物材料混合单元构成，三维贯通孔尺寸为10(Γ 50μπι以利于软骨生成；三维通孔尺寸较大的软骨下骨层支架由包芯材料组成:内层的主体材料为PLGA，在主体材料的表面包裹一层细胞-生物材料混合单元,三维贯通孔尺寸为20(Γ250μπι以利于血管长入；所述步骤4)中的触发离子为Ca2+，水浴溶液为饱和氯化钙溶液；在所述步骤4)中，每成形一层支架后，接收平台下降的高度即支架浸入水浴溶液中的高度为单层支架高度的90%，以保证下一层支架与已成形支架层之间材料能够实现有效粘接。实施例三:
参见图2，本活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形系统，应用于所述的活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法实现成形，包括:三维运动系统(I )、同轴喷头挤出单元(2)、气泵(3)、支架材料接收板(4)、水浴池(5)、计算机控制系统(6)和料筒
(7)，其特征在于:所述气泵(3)、同轴喷头挤出单元(2)、料筒(7)安装在三维运动系统(I)上，处于水浴池(5)上方，可实现X-Y平面运动；支架材料接收板(4)与三维运动系统(I)联接，可实现Z方向运动，且支架材料接收板(4)置于水浴池(5)中；计算机控制系统(6)与三维运动系统(I)相连，根据预先设计好的支架模型以及路径规划，控制同轴喷头挤出单元(2)在X-Y平面的运动轨迹以及每成形一层支架后支架材料接收板(4)在水浴池(5)中下降的高度，以实现支架结构与三维通孔的可控成形并使已成形的支架浸入水浴中；气泵(3)通过供气软管分别与装有细胞-生物材料混合单元和熔融高分子生物材料的料筒(7)相连，通过计算机控制系统(6)对气泵(3)供气的启、停控制，实现不同材料的有序挤出，最终成形由不同材料构成，具有梯度结构变化的活性骨软骨一体化梯度支架。实施例四:
附图1所示为本实施例的工艺路线图。首先将离子浓度敏感材料与促凝胶化天然生物材料分别制备成质量分数为3.6^4.4%和18 22%的生物材料水溶液，将种子细胞、离子浓度敏感材料和促凝胶化天然生物材料溶液按照质量比为1:5:2.5^1:10:10充分混合均匀，制备成凝胶状细胞-生物材料混合单元；将高分子生物材料经过消毒后加热到熔融状态；将细胞-生物材料混合单元与熔融态高分子生物材料分别倒入不同的料筒中。根据预先设计好的一体化梯度支架的三维模型信息，按照所定义的结构特征、材料组成以及路径规划，利用计算机控制系统驱动同轴喷头在空间的指定位置将细胞-生物材料混合单元与高分子生物材料挤出成形，通过逐层堆积完成活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形。附图2所示为实现本实施例所述成形方法的成形系统示意图。整个成形系统包括:三维运动系统(I)、同轴喷头挤出单元(2 )、气泵(3 )、支架材料接收板(4)、水浴池(5 )、计算机控制系统(6)和料筒(7)。计算机控制系统(6)与三维运动系统(I)相连，用于精确控制同轴喷头挤出单元(2)在X-Y平面的运动轨迹以及每成形一层支架后支架材料接收板
(4)在水浴池(5)中下降一定的高度，使已成形的支架层浸入水浴中；将经过灭菌处理的细胞-生物材料混合单元与熔融态 合成高分子生物材料分别装入料筒(7)中，气泵(3)通过供气软管分别与装有细胞-生物材料混合单元和熔融高分子生物材料的料筒(7)相连，通过计算机控制系统(6)对气泵(3)供气的启、停控制，实现不同材料的有序挤出。首先成形由细胞-生物材料混合单元包裹合成高分子生物材料，三维贯通孔尺寸为200~250 μ m的软骨下骨层支架部分；当软骨下骨层支架成形完成后，在计算机控制系统(6)的控制下，关闭合成高分子生物材料的供料压力，使同轴喷头挤出单元(2)只挤出细胞-生物材料混合单元，成形三维贯通孔尺寸为100~150μπι的软骨层支架。在支架增量成形的过程中，每成形一层支架，支架材料接收板(4)就会向下下降一定高度，使已成形的支架材料浸入含有触发离子的交联溶液中进行交联，并为支架中含有的细胞提供适宜的生存环境。最终，通过逐层的增量成形，得到由不同材料构成，具有梯度结构变化的活性骨软骨一体化梯度支架。本实施例的工艺过程:以脂肪干细胞为种子细胞，利用所述工艺制备活性骨软骨一体化梯度支架。将海藻酸钠与能够促使海藻酸钠溶液凝胶化并有利于细胞黏附、生长的天然生物材料明胶分别制备成质量分数为4%与20%的水溶液，灭菌备用；将脂肪干细胞与海藻酸钠溶液、明胶溶液按照溶液质量分数为1:5:5的比例混合均匀，得到凝胶状细胞-生物材料的混合物；选择分子量为15，000的PLGA经加热后成为熔融态可挤出材料。在计算机模型的控制、驱动下，同轴喷头按照预先设计好的支架结构与成形路径运动，首先成形由细胞-生物材料包裹PLGA构成的包芯纤维逐层搭接，力学性能良好，支架三维通孔尺寸在200~250μπι之间的软骨下骨层支架；通过关闭PLGA供料动力，由细胞-生物材料混合单元构成三维通孔尺寸范围在100~150μπι，但是细胞含量更多的软骨层支架部分。在成形过程中，每增量成形一层支架，支架材料接收板就会下降一定高度，使支架材料浸入到交联溶液中对支架进行交联。通过逐层的增量成形，最终得到含有脂肪干细胞的活性骨软骨一体化梯度支架。
权利要求
1.一种活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法，其特征在于操作步骤如下: 1)将离子浓度敏感材料与促凝胶化天然生物材料分别制备成质量分数为3.6^4.4%和18 22%的水溶液，经灭菌后备用； 2)将种子细胞与所制备的离子浓度敏感材料和促凝胶化天然生物材料水溶液按照质量比为1:5:2.5 1:10:10充分混合均匀，制备成凝胶状细胞-生物材料混合单元；将合成高分子生物材料经过消毒，加热到熔融状态；将细胞-生物材料混合单元与熔融态高分子生物材料分别倒入不同的料筒中；根据事先设计好的支架结构与成形路径，在4°C ±0.5°C环境温度中通过计算机系统的控制将细胞-生物材料混合单元与熔融态高分子生物材料由同轴喷头一同挤出，在空间的指定位置逐层增量成形一体化梯度支架中三维通孔尺寸较大的软骨下骨层支架部分； 3)当软骨下骨层支架成形完成后，关闭熔融态高分子生物材料的供料动力，使喷头只挤出细胞-生物材料混合单元，在软骨下骨层支架的基础上继续增量成形一体化梯度支架中三维通孔尺寸较小的软骨层支架部分，最终得到具有细胞活性的骨软骨一体化梯度支架； 4)在逐层增量成形一体化梯度支架的过程中，每完成一层支架材料的挤出成形后，支架材料接收平台就下降一定高度，使刚成形的支架层浸入到含有触发离子的水浴溶液中，离子浓度敏感材料与溶液产生交联反应并为细胞提供多水的生存环境。
2.按照权利要求1所述的活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法，其特征在于:所述步骤I)中的离子浓度敏感材料为海藻酸钠，促使材料进行凝胶化转变的天然生物材料为明胶，合成高分子生物材料为分子量为15，000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polyIactic-co-glycolic acid, PLGA)。`
3.按照权利要求1或2所述的活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法，其特征在于:所述步骤2)和步骤3)中的一体化梯度支架中，三维通孔尺寸较小的软骨层支架由凝胶态细胞-生物材料混合单元构成，三维贯通孔尺寸为10(Γ150 μ m以利于软骨生成；三维通孔尺寸较大的软骨下骨层支架由包芯材料组成:内层的主体材料为PLGA，在主体材料的表面包裹一层细胞-生物材料混合单元，三维贯通孔尺寸为20(Γ250 μ m以利于血管长入。
4.按照权利要求1或2或3所述的活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法，其特征在于:所述步骤4)中的触发离子为Ca2+，水浴溶液为饱和氯化钙溶液。
5.按照权利要求1或2或3或4所述的活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法，其特征在于:在所述步骤4)中，每成形一层支架后，接收平台下降的高度即支架浸入水浴溶液中的高度为单层支架高度的90%，以保证下一层支架与已成形支架层之间材料能够实现有效粘接。
6.一种活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形系统，应用于按照权利要求1所述的活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法实现成形，包括:三维运动系统(I)、同轴喷头挤出单元(2)、气泵(3)、支架材料接收板(4)、水浴池(5)、计算机控制系统(6)和料筒(7)，其特征在于:所述的同轴喷头挤出单元(2)、气泵(3)、料筒(7)安装在三维运动系统(I)上，处于水浴池(5)上方，可实现X-Y平面运动；支架材料接收板(4)与三维运动系统(I)联接，可实现Z方向运动，且支架材料接收板(4)置于水浴池(5)中；计算机控制系统(6)与三维运动系统(I)相连，根据预先设计好的支架模型以及路径规划，控制同轴喷头挤出单元(2)在X-Y平面的运动轨迹以及每成形一层支架后支架材料接收板(4)在水浴池(5)中下降的高度，以实现支架结构与三维通孔的可控成形并使已成形的支架浸入水浴中；气泵(3)通过供气软管分别与装有细胞-生物材料混合单元和熔融高分子生物材料的料筒(7)相连，通过计算机控制系统(6)对气泵(3)供气的启、停控制，实现不同材料的有序挤出，最终成形由不 同材料构成，具有梯度结构变化的活性骨软骨一体化梯度支架。
全文摘要
本发明涉及一种活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法及成形系统。该方法将天然生物材料与种子细胞经充分混合后调制成细胞-生物材料活性凝胶作为一体化活性支架中软骨层的主体材料与软骨下骨层的表面改性材料，力学性能好、降解性能可控的合成高分子生物材料作为软骨下骨层支架的主体材料。根据预先设计好的支架结构与成形路径，将活性生物凝胶与熔融态合成高分子生物材料由同轴喷头挤出，通过计算机控制合成高分子生物材料供料动力的启停，逐层增量成形具有良好力学性能与生物活性的骨软骨一体化梯度支架。具有生物活性的一体化梯度支架不仅可以实现细胞的三维可控成形，同时可以保证支架具有良好的力学性能，支架的孔隙结构与降解速度可控，有利于细胞的立体培养与组织再生。
文档编号A61L27/18GK103143062SQ20131007008
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者于永泽, 刘莹, 韩振中, 刘媛媛, 胡庆夕 申请人:上海大学