一种修复关节软骨损伤的凝胶支架的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物和医疗器械（介入类医疗器械）领域，特别一种修复关节软骨损 伤的凝胶支架的制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着我国进入老龄社会，膝关节软骨损伤病人越来越多。目前对于此类疾病尚无 好的治疗方法。目前临床上常用的软骨下骨打孔，骨软骨移植以及自身软骨细胞移植只能 部分缓解症状，不能达到重建软骨缺损的目的，使用此类方法得到的修复组织主要成分为I 型胶原蛋白，与原有透明软骨的II型胶原蛋白相比在生物学特性上相差甚远。
[0003] 在软骨缺损处再生修复组织，重建软骨缺损的基本原理为：募集自身或者引入外 源性的干细胞、较原始细胞于软骨缺损处，并在相关生长因子等作用下分化为软骨组织。关 节腔中有多种类型的间充质干细胞可以被招募到软骨缺损处进行损伤修复，如骨髓间充质 干细胞、关节滑液中的滑膜间充质干细胞以及髌下脂肪垫来源的脂肪间充质干细胞等。体 液以及血液等均有诱导间充质干细胞定向迀徙的能力，而软骨微环境中的各种因子具有诱 导间充质干细胞向软骨细胞定向分化的能力。但是，由于自身体内诱导因子作用效能的局 限性以及缺乏细胞生长的三维空间环境，因而，不能产生和原有软骨组织类似的修复组织。
[0004] 为了解决软骨再生这一难题，国内外医学界在过去几十年间进行了大量的探索和 研宄。如研宄各种生长因子来促进间充质干细胞向软骨细胞分化；研宄基因转染技术来获 得成软骨能力更强的种子细胞；研宄新型的组织工程支架在体外构建组织工程化软骨进而 植入体内等。但是，这些方法都存在各种局限性：生长因子由于免疫原性不能体内使用，基 因转染技术存在安全性和致瘤性问题，组织工程化软骨植入与原有组织很难整合等。因而， 目前这些方法都没有很好的解决问题。近年来，在软骨缺损处植入能募集并诱导自身间充 质干细胞向软骨细胞分化的三维支架是有光明前途的治疗方式。植入三维多孔支架尤其是 植入能缓释药物的支架材料因能招募更多的间充质干细胞并增强诱导效能，因而治疗软骨 再生带来了巨大的希望，具有广泛的社会经济意义。
[0005] 目前，研宄应用较多的支架材料多为PLGA、PGA、胶原蛋白、纤维蛋白等，这些支架 材料特点为能诱导细胞产生大量的I型胶原蛋白，而非II型胶原蛋白，因而不利于间充质 干细胞向软骨细胞分化。而在药物缓释支架的研宄领域，用来被缓释的药物多为生长因子， 此类药物价格昂贵，而且具有免疫原性，体内应用有带来动物源性疾病的风险。因而，寻找 到合适形式的、能促进细胞分泌软骨细胞外基质的支架材料以及安全有效、可以体内使用 的诱导药物是解决软骨再生问题的关键。
[0006] 经检索发现，公开号为CN104072709A的发明专利申请公开了一种可光聚合医用 透明质酸衍生物水凝胶的制备方法。该方法是将透明质酸于室温下溶解在水中搅拌4h，用 HCl调节其pH至3.5;将甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA)缓慢滴加到反应体系中，反应温度T 为60°C，反应磁力搅拌12h，用乙醇沉淀即得到可光聚合的透明质酸衍生物。将透明质酸衍 生物溶解在在磷酸盐缓冲溶液中，再加入水溶性光引发剂和抗菌药物，在紫外光照射下得 到载有药物的透明质酸水凝胶。该方法实现了透明质酸的改性以及可以反应光聚合，成本 低，反应过程可控性强，设备简单，反应过程易于操作，产品可实现产业化。
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种修复关节软骨损伤的凝胶支架的制备方法，该凝胶支架 可以在紫外点光源下聚合成凝胶状，并且可以缓释小分子有机化合物。
[0009] 为达到本发明的目的，具体采用如下的技术方案：
[0010] 一种修复关节软骨损伤的凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：
[0011] ⑴透明质酸钠的修饰；
[0012] (2)将缓释小分子化合物的PLGA纳米颗粒溶解在步骤（1)修饰后的透明质酸钠 中，浓度为2-200um/L，再加入光引发剂，得到缓释小分子化合物-透明质酸钠凝胶复合物 系统，按重量比，光引发剂的加入量为小分子化合物的1/10-1/8 ;
[0013] (3)将所述缓释小分子化合物-透明质酸钠凝胶复合物系统注入/填充至待修复 关节软骨损伤处经紫外点光源照射，得到修复关节软骨损伤的凝胶支架。
[0014] 在本发明的技术方案中，所述修饰后的透明质酸钠可选用现有技术中的所有产 品，为了达到和光引发剂及纳米颗粒的最佳结合，优选采用通过如下方法制备得到的修饰 后的透明质酸钠，具体包括以下步骤：
[0015] (I) l_5g透明质酸钠溶解在50?IOOml的蒸馏水中，低温条件（4?20°C )下放 置10?12h ;
[0016] (2)在步骤⑴所得溶液中加入1?3ml的甲基丙酸烯酐，在pH为8?9,温度为 0?5°C的条件下反应15?30h ;
[0017] (3)将步骤（2)所得的产物依次进行以下操作：在丙酮中沉淀，用乙醇洗净，溶解 在去离子水中，去离子水透析24-72h，得修饰后的透明质酸钠。
[0018] 作为透明质酸钠修饰的最佳实施方式，包括以下步骤：
[0019] (l)2g透明质酸钠溶解在IOOml的蒸馏水中，低温条件（4?20°C )下放置12h ;
[0020] ⑵在步骤⑴所得溶液中加入1.6ml的甲基丙酸烯酐，在pH为8?9,温度为 4°C的条件下反应24h ;
[0021] (3)将步骤（2)所得的产物依次进行以下操作：在丙酮中沉淀，用乙醇洗净，溶解 在去离子水中，去离子水透析48h后，得修饰后的透明质酸钠。
[0022] 所述缓释小分子化合物选自Kartogenin、双磷酸盐、Licofelone或雷尼酸锁中的 一种或几种，优选为Kartogenin。
[0023] 当缓释小分子化合物选用Kartogenin时，优选地，Kartogenin的PLGA纳米颗粒溶 解在步骤（1)修饰后的透明质酸钠中，浓度为10um/L，本发明提供的凝胶支架持续缓释软 骨诱导药物KGN达60天之久，并且浓度维持在最优浓度IOuM ;支架可塑性强，可以根据软 骨缺损的形状随意塑形；整个过程中未引入有害物质，可以体内使用；支架生物相容性好。
[0024] Kartogenin可选用市售产品，也可以采用如下方法进行制备。具体的，Kartogenin 的制备流程如下所示：
[0025]
【主权项】
1. 一种修复关节软骨损伤的凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 透明质酸钠的修饰； (2) 将缓释小分子化合物的PLGA纳米颗粒溶解在步骤（1)修饰后的透明质酸钠中，浓 度为2-60um/L，再加入光引发剂，得到缓释小分子化合物-透明质酸钠凝胶复合物系统，按 重量比，光引发剂的加入量为小分子化合物的1/10-1/8 ; (3) 将所述缓释小分子化合物-透明质酸钠凝胶复合物系统注入/填充至待修复关节 软骨损伤处经紫外点光源照射，得到修复关节软骨损伤的凝胶支架。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)具体包括以下步骤： (1) 1?5g透明质酸钠溶解在50?IOOml的蒸馏水中，低温条件下放置10?12h ; (2) 在步骤⑴所得溶液中加入1?3ml的甲基丙酸烯酐，在pH为8?9,温度为0? 5°C的条件下反应15?30h ; (3) 将步骤（2)所得的产物依次进行以下操作：在丙酮中沉淀，用乙醇洗净，溶解在去 离子水中，去离子水透析24-72h，得修饰后的透明质酸钠。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓释小分子化合物选自 Kartogenin、双磷酸盐、Licofelone或雷尼酸锁中的一种或几种，优选为Kartogenin。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓释小分子化合物的PLGA纳米 颗粒的制备方法包括以下步骤： (1) 将PLGA溶解在二氯甲烷中，浓度约为2-20mg/ml，得混合溶液1 ;将缓释小分子化 合物溶解在丙酮中，浓度约为2-20mg/ml，得混合溶液2 ;将混合溶液2加入到混合溶液1 中，得混合溶液3 ; (2) 将混合溶液3通过注射泵添加到0. 05?0. 5% (V/V)壳聚糖溶液，在冰浴下使用 高速均质器大于IOOOOrpm形成水包油乳液； (3) 将水包油乳液加入到100?300ml 0. 1?0. 5 % (V/V)的壳聚糖溶液中，100? 300rpm搅拌蒸发有机相； (4) 将步骤（3)所得产物通过离心得到缓释小分子化合物的PLGA纳米颗粒。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中将混合溶液3通过注射泵 添加到壳聚糖溶液的速度为l_3ml/min。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的Mn为550-552kDa ;脱 乙酰度为92-98%。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂选用Irgacure 2595。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中紫外光强为5-20 μ W/cm2， 对应的光照时间为30s-lmin。
【专利摘要】本发明涉及药物和医疗器械领域，特别涉及一种修复关节软骨损伤的凝胶支架的制备方法，具体包括如下步骤：(1)透明质酸钠的修饰；(2)将缓释小分子化合物的PLGA纳米颗粒溶解在步骤(1)修饰后的透明质酸钠中，再加入光引发剂，得到缓释小分子化合物-透明质酸钠凝胶复合物系统；(3)将所述缓释小分子化合物-透明质酸钠凝胶复合物系统注入/填充至待修复关节软骨损伤处经紫外点光源照射，得到修复关节软骨损伤的凝胶支架。本发明提供的凝胶支架支架可塑性强，可以根据软骨缺损的形状随意塑形；整个过程中未引入有害物质，可以体内使用。
【IPC分类】A61L27-54, A61L27-52, A61L27-20, A61L27-18
【公开号】CN104587531
【申请号】CN201410828328
【发明人】顾臻, 史冬泉
【申请人】南京臻泉医药科技有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月25日