一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法与应用与流程

本发明涉及一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，特别涉及一株利用glms核糖开关构建高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的方法及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

氨基葡萄糖(GlcN)是一种天然存在于结缔组织和胃肠道粘膜中的氨基单糖，内源性GlcN在动物和人体细胞内由葡萄糖转化生成，可以合成黏多糖、糖蛋白和蛋白聚糖，特别是合成关节软骨以及滑液分子的中间物，临床试验表明，外源性氨糖对于人体和动物体内的骨关节炎具有很好的疗效，此外还具有抗肿瘤活性等生理功能。目前商品化的GlcN几乎全部是来自虾、蟹等甲壳原料的高温水解，生产过程需要高温和强酸处理，排放的废液严重污染环境，因此寻找一株安全生产GlcN的微生物，利用生物法合成GlcN具有重要意义。利用微生物发酵直接合成GlcN的优势主要有：1)生产原料来源简单，获取不受地域限制；2)转化条件温和，不需高温、高压过程，能耗低；3)生产过程中无需加入强酸、强碱，不产生高盐废水，对环境污染小；4)产品无鱼腥味及微量致敏性物质，不会对体质过敏者造成过敏反应，更适合于在医药和保健领域的应用。

中国专利文献CN104195094A(申请号201410376584.2)公开了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。该基因工程菌通过在枯草芽孢杆菌中表达编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因，形成完整的从葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路；敲除或失活枯草芽孢杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖转运蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因nagP构建而成，它解决了现有技术中所生产的N-乙酰氨基葡萄糖安全性差、产量低、成本高的问题。但其无法解决在发酵过程种实时检测氨基葡萄糖变化的问题。

glms核糖开关是至今发现的唯一能够调控糖代谢的核糖开关，只存在于革兰氏阳性菌中，位于编码glmS的mRNA的5'UTR内，它需要小分子物质GlcN-6P才能激活，这在已经发现的核酶中是非常少见的，目前对glms核糖开关的相关研究较少。

技术实现要素：

本发明针对先游戏技术的不足，提供一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法与应用。该方法利用glms核糖开关基因并以此构建了一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌株，该菌株可应用于GlcN的合成。

本发明技术方案如下：

一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，将来自酿酒酵母的GFA1基因、glms核糖开关基因和EGFP增强型荧光蛋白编码基因转化至枯草芽孢杆菌中，构建获得高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌；

所述glms核糖开关基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP增强型荧光蛋白编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，GFA1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根据本发明优选的，所述构建方法，具体步骤如下：

(1)提取大肠杆菌中的质粒pEGFP-N1，以质粒pEGFP-N1为模板，使用引物EGFP-F和EGFP-R进行PCR扩增，制得EGFP增强型荧光蛋白编码基因；所述引物核苷酸序列如下：

EGFP-F:CTTCTTTTTAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；

EGFP-R:TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA；

(2)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用引物glms-F和glms-R进行PCR扩增，制得glms核糖开关基因；所述引物核苷酸序列如下：

glms-F:TCCCAATTCGAAGTCTATTATCAGAGAGTG；

glms-R:GGATCCATTTTTCTTCCTCCTAAGATTGTAA；

(3)提取酿酒酵母s288c菌体基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用引物Gfa1-F和Gfa1-R进行PCR扩增，制得GFA1基因；所述引物核苷酸序列如下：

Gfa1-F:GGATCCATGTGTGGTATCTTTGGTT；

Gfa1-R:AATAGACTTCGTTATTCGACGGTAA；

(4)将步骤(1)制得的EGFP增强型荧光蛋白编码基因与步骤(2)制得的glms核糖开关基因经重叠PCR，制得glms-EGFP片段；

(5)将步骤(3)制得的GFA1基因与步骤(4)制得的glms-EGFP片段经重叠PCR，制得GFA1-glms-EGFP片段；

(6)将步骤(6)制得的GFA1-glms-EGFP片段连接到表达载体PHT01上，制得重组表达载体；然后转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞，筛选阳性重组菌，制得高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PCR扩增体系如下，总体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物EGFP-F 2μl，浓度10μmol/L的引物EGFP-R 2μl，模板2μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的PCR扩增体系如下，总体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物glms-F 2μl，浓度10μmol/L的引物glms-R2μl，模板2μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的PCR扩增体系如下，总体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物Gfa1-F 2μl，浓度10μmol/L的引物Gfa1-R2μl，模板2μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，所述重叠PCR的初次扩增体系如下，总体系为25μl：

glms核糖开关基因4μl；EGFP增强型荧光蛋白编码基因4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述重叠PCR的补充扩增体系如下，总体系为25μl：

浓度10μmol/L的上游引物glms-F 2μl；浓度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(5)中，所述重叠PCR的初次扩增体系如下，总体系为25μl：

GFA1基因4μl；glms-EGFP片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：

浓度10μmol/L的上游引物GFA1-F 2μl；浓度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸7min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(6)中，连接步骤如下：

将GFA1-glms-EGFP片段经BamH I和Xba I双酶切后，与同样经BamH I和Xba I双酶切后的表达载体PHT01通过T4连接酶在16℃条件下连接12h，连接体系如下：

GFA1-glms-EGFP片段3μL，PHT01质粒1μL，T4连接酶1μL，T4buffer 1μL，加ddH₂O至10μL。

根据本发明优选的，所述步骤(6)中，转化条件为：2mm电转杯、2500v脉冲条件下电击转化，时间常数＝5.0ms。

根据本发明优选的，所述步骤(6)中，筛选阳性重组菌的步骤如下：

将转化后的枯草芽孢杆菌WB800N涂布在含25μg/ml氯霉素的LB平板上，在37℃培养14～18h，筛选具有氯霉素抗性的转化子并转接至LB液体培养基中37℃培养过夜，利用引物GFA1-F和EGFP-R对菌体中的DNA进行PCR扩增进行验证。

上述构建方法制备的高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌。

上述高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌在制备氨基葡萄糖中的应用，步骤如下：

将高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌种子液按2％的比例接种于发酵培养基中，在35～38℃、150～300rpm的条件下培养至OD₆₀₀为0.8～0.9，然后加入IPTG至浓度为0.5mM，24～26℃诱导培养6h；然后经菌体破碎，纯化，制得氨基葡萄糖。

根据本发明优选的，所述高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌种子的制备步骤如下：

将高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，在35～38℃的条件下培养5～8h。

进一步优选的，所述种子培养基组分如下：

蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L。

根据本发明优选的，所述发酵培养基组分如下：

葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L。

有益效果

1、本发明首次将glms核糖开关和EGFP基因连接在PHT01中，构建成GLMS-EGFP传感器，响应枯草芽孢杆菌细胞内6-磷酸氨基葡萄糖量的变化而表现出荧光强度的变化，通过流式细胞仪，可以实时掌握氨基葡萄糖的合成情况；

2、本发明构建的高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌可以使氨基葡萄糖实现高效表达，并且可以通过流式细胞仪检测菌体荧光强度，来指示氨基葡萄糖的胞内产生量；可通过观察荧光强度确定最佳发酵条件，诱导时间等。有利于高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的使用，为进一步提高氨基葡萄糖产量奠定了基础，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是PHT01-GFA1-glms-EGFP构建示意图；

图2是流式细胞仪观测的WB800N菌体荧光情况结果图；

图3是最优诱导条件下流式细胞仪观测的工程菌菌体的荧光情况结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

质粒PHT01购自杭州宝赛生物有限公司

大肠杆菌pEGFP-N1购自杭州宝赛生物有限公司

枯草芽孢杆菌168购自杭州宝赛生物有限公司

枯草芽孢杆菌WB800N购自杭州宝赛生物有限公司

实施例1

一株高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌的构建方法，步骤如下：

(1)提取大肠杆菌中的质粒pEGFP-N1，以质粒pEGFP-N1为模板，使用引物EGFP-F和EGFP-R进行PCR扩增，制得EGFP增强型荧光蛋白编码基因；EGFP增强型荧光蛋白编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物核苷酸序列如下：

EGFP-F:CTTCTTTTTAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；

EGFP-R:TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA；

所述的PCR扩增体系如下，总体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物EGFP-F 2μl，浓度10μmol/L的引物EGFP-R 2μl，模板2μl，ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

(2)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用引物glms-F和glms-R进行PCR扩增，制得glms核糖开关基因；所述glms核糖开关基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物核苷酸序列如下：

glms-F:TCCCAATTCGAAGTCTATTATCAGAGAGTG

glms-R:GGATCCATTTTTCTTCCTCCTAAGATTGTAA

所述的PCR扩增体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，引物glms-F(10μmol/L)2μl，引物glms-R(10μmol/L)2μl，模板2μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(3)提取酿酒酵母s288c菌体基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用引物Gfa1-F和Gfa1-R进行PCR扩增，制得GFA1基因；GFA1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物核苷酸序列如下：

Gfa1-F:GGATCCATGTGTGGTATCTTTGGTT；

Gfa1-R:AATAGACTTCGTTATTCGACGGTAA；

所述的PCR扩增体系如下，总体系为50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl，浓度10μmol/L的引物Gfa1-F 2μl，浓度10μmol/L的引物Gfa1-R2μl，模板2μl，用ddH₂O补足50μl；

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

(4)将步骤(1)制得的EGFP增强型荧光蛋白编码基因与步骤(2)制得的glms核糖开关基因经重叠PCR，制得glms-EGFP片段；

所述的重叠PCR的初次扩增体系如下，总体系为25μl：

glms核糖开关基因4μl；EGFP增强型荧光蛋白编码基因4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系如下，总体系为25μl：

浓度10μmol/L的上游引物glms-F 2μl；浓度10μmol/L的下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min；-20℃保存。

(5)将步骤(3)制得的GFA1基因与步骤(4)制得的glms-EGFP片段经重叠PCR，制得GFA1-glms-EGFP片段；

所述的重叠PCR的初次扩增体系如下，总体系为25μl：

GFA1片段4μl；glms-EGFP片段4μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 4.5μl；

所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1.5min，5个循环；72℃延伸2min；

所述的重叠PCR的补充扩增体系如下，总体系为25μl：

上游引物GFA1-F 2μl；下游引物EGFP-R 2μl；2×HiFi-PCR master 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸7min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

(6)将步骤(6)制得的GFA1-glms-EGFP片段连接到表达载体PHT01上，制得重组表达载体；然后转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞，筛选阳性重组菌，制得高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌；

所述步骤(6)中，连接步骤如下：

将GFA1-glms-EGFP片段经BamH I和Xba I双酶切后，与同样经BamH I和Xba I双酶切后的表达载体PHT01通过T4连接酶在16℃条件下连接12h，连接体系如下：

GFA1-glms-EGFP片段3μL，PHT01质粒1μL，T4连接酶1μL，T4buffer 1μL，加ddH₂O至10μL。

所述步骤(6)中，转化条件为：将感受态细胞以100μl每管分装，采用2mm电转杯，2500v脉冲条件下电击转化，时间常数＝5.0ms。

所述步骤(6)中，筛选阳性重组菌的步骤如下：

将转化后的枯草芽孢杆菌WB800N涂布在含25μg/ml氯霉素的LB平板上，在37℃培养14～18h，筛选具有氯霉素抗性的转化子并转接至LB液体培养基中37℃培养过夜，利用引物GFA1-F和EGFP-R对菌体中的DNA进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳证明重组质粒PHT01转化到枯草芽孢杆菌WB800N中。

实施例2

高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌在发酵生产氨基葡萄糖中的应用，步骤如下：

1)从含氯霉素25μg/mL的LB平板挑取高产氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌单菌落转接于3mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下过夜培养，制得种子液；

LB平板每升组分如下：

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，水定容至1L，pH值7.0。

LB液体培养基每升组分如下：

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水定容至1L，pH值7.0。

2)将种子液接种于含氯霉素25μg/mL的100mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm培养，分别按表1中的条件诱导表达。

表1枯草芽孢杆菌氨基葡萄糖合酶表达条件优化正交实验表

3)将诱导表达结束后的发酵液离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，洗涤菌体三次，最后用适量PBS缓冲液悬浮菌体，用流式细胞仪观察菌体荧光强度，设置激发光波长为480nm，发射光波长为610nm，速度为300个粒子/sec，通过比较检测不同批次发酵结束时菌体荧光强度和氨基葡萄糖的含量，可以用荧光强度表示氨基葡萄糖的产生量。可通过观察荧光强度确定最佳发酵条件结果如表2中所示。

通过对影响氨基葡萄糖产量的诱导温度、培养时间、IPTG浓度和诱导时间4个因素进行优化的结果表明，以胞内氨基葡萄糖含量为评价指标的最佳诱导条件为：诱导温度25℃、培养时间6h、IPTG浓度0.5mM、诱导时间6h。荧光强度为65％，氨基葡萄糖产量为0.745g/L，如表2所示。

表2枯草芽孢杆菌氨基葡萄糖合酶表达条件优化结果

对比例1

中国专利文献CN104195094A(申请号201410376584.2)公开了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。该基因工程菌通过在枯草芽孢杆菌中表达编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因，形成完整的从葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路；敲除或失活枯草芽孢杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖转运蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因nagP构建而成。

本申请与对比例1的不同之处在于对比例1中发酵液氨基葡萄糖的含量是通过高效液相色谱法测定，此方法获得的数据相对滞后，不能及时监测到细胞内氨基葡萄糖的变化。本申请利用核糖开关构建的生物传感器可以通过绿色荧光蛋白的亮度反映氨基葡萄糖的产生量，当细胞内GlcN-6P浓度较高时将反馈抑制glmS的表达，就会检测到GFP荧光降低；而当细胞内的GlcN-6P浓度降低时，glmS的抑制解除，GFP荧光又会升高，达到实时监测细胞内GlcN-6P浓度变化的目的，为更加及时进行过程代谢的调控提高GlcN的生物合成提供帮助。