芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产的制作方法
【专利说明】芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产 发明领域
[0001] 本发明涉及一种在芽孢杆菌属宿主细胞中生产不具有分泌信号的天然非分泌多 肽并且无需进行裂解步骤来回收该天然非分泌多肽的方法；并且涉及包括一种或多种外源 或异源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞，该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分 泌信号的天然非分泌感兴趣多肽。
[0002] 发明背景
[0003] 芽孢杆菌属宿主细胞已经被表征为工业制造各种感兴趣多肽的主力，主要是因为 它们主动分泌具有所谓信号肽的多肽。该信号肽是一种小多肽，典型的是约20-30个氨基 酸，该小多肽在与待分泌多肽的N-末端的转录和翻译融合体中表达。它引导该融合的多肽 进入适当配备的宿主细胞的分泌机构中，于是该融合的多肽裂解，这时不具有其信号肽的 现已成熟的感兴趣多肽被分泌进入周围培养液中，该信号肽保留在细胞中并且被降解。
[0004] 芽孢杆菌属中重组生产的感兴趣多肽的分泌能够使得不用必须进行细胞裂解步 骤而直接从培养液中比较容易地回收多肽。在芽孢杆菌属中，只有肯定会从细胞输出至生 长培养基中的多肽是天然具有信号肽的。
[0005] 然而，细胞中大多数的多肽不是肯定会输出的，而是相反原本在细胞内、周质、膜 结合的等等。生产此类天然非分泌多肽通常被认为是繁重的，因为它们需要从宿主细胞内 进行回收，这些宿主细胞通常需要凌杂的细胞溶解步骤，这导致了挑战性的回收过程，或者 它们需要被表达为与异源性分泌信号一起的人工融合多肽，希望这将使得来自像芽孢杆菌 属的宿主细胞能主动分泌，但这不是绝对能保证成功的。因此，在本领域存在着对以经济有 效的途径生产天然非分泌多肽的方法的需要。
[0006] 发明概述
[0007] 与我们的预期相反，当天然细胞内的或非分泌的酶在不具有信号肽的地衣芽孢杆 菌和枯草芽孢杆菌宿主中表达时，我们在上清液中发现了非常高水平的酶活性。这是一个 非常出人意料的结果并且是一个具有经济重要性的结果，因为这证实了天然非分泌多肽可 以在芽孢杆菌属中产生并且可以无需昂贵的细胞裂解步骤直接从培养液中回收。
[0008] 在以下实例1中，将过表达不具有信号肽的天然非分泌天冬酰胺酶（ASP)的枯草 芽孢杆菌菌株和过表达不具有信号肽的天然非分泌葡聚糖转移酶（GT)的地衣芽孢杆菌菌 株或不具有信号肽的GFP变体，分别与不具有ASP/GT/GFP-变体编码基因的对照菌株进行 比较。这些ASP、GT和GFP-变体编码基因在没有分泌信号的情况下进行表达，该分泌信号 另外被认为是芽孢杆菌属细胞主动分泌所需要的。非常出人意料的是在芽孢杆菌属宿主的 上清液中发现了高水平的酶活性。但是这是一个非常受欢迎的惊喜，我们可以在芽孢杆菌 属宿主细胞中不必进行昂贵的裂解步骤，重组地生产在天然细胞内的或非分泌的没有信号 肽的多肽，因为这允许更加具有成本效益的生产。
[0009] 因此，在第一方面，本发明提供了在芽孢杆菌属宿主细胞中生产感兴趣多肽的方 法，所述方法包括以下步骤：
[0010] i)在生长培养基中，在有助于表达该多肽的条件下，培养包括一种或多种外源多 核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞，该一种或多种外源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非 分泌的感兴趣多肽；并且
[0011] ii)无需进行裂解步骤回收该多肽。
[0012] 在第二方面，本发明涉及包括一种或多种外源或异源多核苷酸的重组体芽孢杆菌 属宿主细胞，该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌的感兴 趣多肽。
[0013] 定义
[0014] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个 或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0015] 细胞裂解步骤：术语"细胞裂解步骤"意指一种在回收期间引入的加工步骤，以导 致芽孢杆菌属细胞的裂解。实例包括向耗尽的发酵培养基添加酶，例如，溶菌酶；超声处理； 均质化、冻结并研磨，和珠磨裂解。
[0016] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0017] 控制序列：术语"控制序列"意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相同基 因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括 但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少， 控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码 一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供 有多个接头。
[0018] 表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0019] 表达载体：术语"表达载体"意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种 多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0020] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构 建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制 期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0021] 分离的：术语"分离的"意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物 质的非限制性实例包括：（1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其天然相关联的 一种或多种或所有天然存在的成分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、 蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质；或 (4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量（例如，宿主细胞中的重组体 产量；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更 强的启动子的使用）而修饰的任何物质。
[0022] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短等之后处于其最终形式的多肽。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一 多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽（即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸） 的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷 酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟 多肽（例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸）。
[0023] 天然非分泌多肽：术语"天然非分泌多肽"意指通过其天然的、野生型来源胞内产 生（即，非分泌）的多肽。在变体的情况下，术语"天然非分泌多肽"意指通过其天然的、野 生型来源胞内产生（即，非分泌）的野生型多肽（该变体衍生自该野生型多肽）。
[0024] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单-链或双链核酸分子，其分离自天然存在 的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其 包括一个或多个控制序列。
[0025] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指一种配置，其中一个控制序列相对于一 种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
[0026] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软 件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人， 2000,遗传学趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔 (Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德尔 曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物学杂志（J. Mol. Biol.) 48:443-453)来确定两个氨 基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0027] (一致的残基X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0028] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯（Rice)等人，2000,见上文）（优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序中所实施的尼 德尔曼-翁施算法（尼德尔曼（Needleman)和翁施（Wunsch)，1970,见上文）来确定两个 脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位拓展罚分 0. 5,和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的 输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0029] (-致的脱氧核糖核苷酸X 100)八比对长度-比对中的空位总数）
[0030] 变体：术语"变体"意指具有酶活性的且相比于其亲本野生型或参照的氨基酸序列 在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即取代、插入、和/或缺失）的多肽。取 代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸； 并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
[0031] 成熟多肽的变体可以在一个或多个（例如，若干个）位置处包括取代、缺失和/或 插入。弓丨入成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目可以多达10个，例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，8卩，不会显著地影响蛋白质的折 叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧 基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改 变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段（tract)、抗原表位或结合结构域。
[0032] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸及组氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、异亮氨酸及缬氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘 氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸）。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本 领域已知的并且例如由H.诺伊拉特（H.Neurath)和R. L.希尔（R. L.Hill)，1979,在蛋白 质（The Proteins)，学术出版社，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、 Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/ Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及 Asp/Gly〇
[0033] 可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基 酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
[0034] 可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（坎宁汉 (Cunningham)和威尔斯（Wells)，1989,科学（Science) 244:1081-1085)来鉴定多肽中的必 需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突 变体分子的酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希 尔顿（Hilton)等人，1996,生物化学杂志（J. Biol. Chem.) 271:4699-4708。也可结合假定接 触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进 行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例 如，德弗斯（de Vos)等人，1992,科学（Science) 255:306-312 ;史密斯（Smith)等人，1992， 分子生物学杂志（J. Mol. Biol. )224:899-904 ;乌乐达维尔（Wlodaver)等人，1992,欧洲生 化学会联合会快报（FEBS Lett. )309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需 氨基酸。
[0035] 可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组 的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森（Reidhaar-Olson) 和萨奥尔（Sauer)，1988,科学（Science) 241:53