多分析物试验的制作方法
【专利说明】多分析物试验
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月4日提交的美国临时专利申请No. 61/772, 518和 61/772,521的益处。将那些申请的每一篇的公开内容全部按引用并入本文中。 发明领域
[0003] 本发明涉及利用固定于颗粒上的多价结合剂的结合试验，尤其是免疫试验。本发 明还涉及增大颗粒的大小提高了筛选的敏感性这一令人惊讶的发现。
[0004] 发明背景
[0005] 测试液体样品的细菌污染是各种领域中的重要组成部分，如医学（例如，测试用 于输血的血样）、环境安全（例如，测试用于人使用的水样）和食品安全（例如，测试用于食 用的食品和饮料样品）。细菌测试的重要性需要快速、灵敏和特异性足够宽泛以检测多种细 菌种和属的测试。试验中的实际限制，如检测剂（例如，细菌抗原结合抗体）的量或"阳性" 结果的可视性可以控制目前的细菌测试方法来满足这些需求的能力。因此，需要用于快速、 宽泛和灵敏地检测细菌的改良试剂、装置和方法。
[0006] 发明简述
[0007] 在第一个方面中，本发明提供了用于检测样品中的细菌的侧向流动装置，该装 置包括用于样品的流动通道，并且进一步包括对于一种或多种细菌抗原特异性的全类属 (pan-generic)结合剂，其中所述全类属结合剂通过衔接物固定于一群特定大小的可检测 颗粒上；和捕获结合细菌抗原的颗粒群的捕获结合剂，其中捕获结合剂固定于流动通道上， 并且其中可检测颗粒群沿着流动通道排列，使得样品在与捕获结合剂接触之前与可检测颗 粒群接触。在一些实施方案中，可检测颗粒是化学发光、发光、荧光、磁或有色颗粒。为了方 便，将使用术语"有色颗粒"，但本发明考虑了使用其他形式的可检测颗粒的实施方案。在利 用有色颗粒的实施方案中，颗粒可以是金、银或铂颗粒。在一些实施方案中，颗粒直径为约 60至约120nm。在一些实施方案中，颗粒直径为约80nm。
[0008] 在一些实施方案中，全类属结合剂特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原。在一些这 样的实施方案中，全类属多克隆抗体结合脂磷壁质酸（LTA)。在一些实施方案中，全类属结 合剂特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些这样的实施方案中，全类属多克隆抗体结 合细菌脂多糖结构（LPS)。在一些实施方案中，至少一种全类属结合剂特异性地结合革兰 氏阳性细菌抗原而至少一种全类属结合剂特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施 方案中，全类属结合剂能够结合三个或更多个属的细菌。在一些实施方案中，衔接物是蛋白 A、蛋白G或蛋白L。
[0009] 在一些实施方案中，全类属结合剂是抗体。在一些实施方案中，全类属结合剂包括 两种或更多种全类属抗体，其中每种全类属抗体特异性地结合一种或多种细菌抗原。在各 种实施方案中，每种全类属抗体固定于有色颗粒的分开亚群上或相同的亚群上。在一些实 施方案中，可以将全类属结合剂与一种或多种非全类属的结合剂组合。例如，不是全类属的 结合剂可以结合一个或多个种或菌株的细菌，但不是结合到多个属上。
[0010] 在一些实施方案中，一个或多个颗粒群包括第一个颗粒群和第二个颗粒群。在一 些实施方案中，第一个颗粒群具有一种或多种对一种或多种第一个抗原群具有特异性的结 合剂，而第二个颗粒群具有一种或多种对一种或多种第二个抗原群具有特异性的结合剂， 其中第一个一种或多种抗原群和第二个一种或多种抗原群彼此不同。
[0011] 在一些实施方案中，全类属抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体以及多克隆和单克 隆抗体的组合。在一些实施方案中，全类属抗体是多克隆的，并且结合多种细菌抗原。在一 些实施方案中，全类属抗体是多克隆的并且结合多种革兰氏阳性细菌抗原。在一些实施方 案中，全类属抗体是多克隆的并且结合多种革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，全类 属抗体是多克隆的，并且结合多种革兰氏阴性细菌抗原和革兰氏阳性细菌抗原。在一些实 施方案中，至少一种全类属抗体是单克隆全类属抗体和至少一种全类属抗体是多克隆全类 属抗体。
[0012] 在一些实施方案中，全类属抗体特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原。在一些实施 方案中，全类属抗体特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，至少一种全类 属抗体特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原和至少一种全类属抗体特异性地结合革兰氏阴 性细菌抗原。在一些实施方案中，全类属抗体能够结合三个或多个属的细菌。
[0013] 在一些实施方案中，装置包括至少三种特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原的全类 属结合剂，每种全类属结合剂固定于有色颗粒的分开亚群上；和至少三种特异性地结合革 兰氏阴性细菌抗原的全类属结合剂，每种全类属结合剂固定于有色颗粒的分开亚群上。在 一些实施方案中，至少一种全类属结合剂是抗体。在一些实施方案中，至少一种全类属抗体 是单克隆抗体。在一些实施方案中，颗粒的亚群是不同大小的。在一些实施方案中，颗粒是 金、银或铂。在一些实施方案中，至少一些颗粒的直径为约20nm至约120nm。在一些实施方 案中，至少一些颗粒是直径约20nm至约120nm的金颗粒。在一些实施方案中，至少一个颗 粒群（例如，金颗粒群）包括80nm颗粒。在一些实施方案中，至少一个颗粒群（例如，金颗 粒群）包括40nm颗粒。
[0014] 在一些实施方案中，捕获结合剂是特异性地结合细菌抗原的全类属抗体。在一些 实施方案中，捕获结合剂与全类属结合剂相同。在一些实施方案中，捕获抗体固定于样品流 动通道上的一个或多个位置中。在一些实施方案中，样品流动通道是吸收膜。在一些实施 方案中，吸收膜是硝基纤维素。
[0015] 在一些实施方案中，将有色颗粒在安置在吸收膜上并且与膜的上表面接触的固体 支持物表面内干燥。
[0016] 在第二个方面中，本发明提供了检测样品中存在或不存在细菌的方法，包括使样 品与细菌抗原特异性的全类属结合剂接触，其中全类属结合剂通过衔接物固定于有色颗粒 上，并且其中使样品在允许全类属结合剂和细菌抗原之间结合形成结合剂-细菌抗原复合 物的条件下与全类属结合剂接触，并且进一步包括使固定的细菌抗原特异性的捕获结合剂 在允许固定的捕获结合剂和颗粒-全类属结合剂-细菌抗原复合物之间结合的条件下与 有色颗粒接触，其中通过捕获结合剂捕获带有全类属结合剂的有色颗粒表明样品中存在细 菌。在一些实施方案中，在进行试验前，将少量可溶性全类属结合剂添加到样品中。如此少 量是足以提高系统信号的量。
[0017] 在一些实施方案中，该方法包括使根据本发明第一个方面的装置在允许捕获抗体 结合带有全类属抗体的有色颗粒的条件下与全类属抗体接触，其中通过捕获抗体捕获颗粒 表明样品中存在细菌。
[0018] 在一些实施方案中，样品已经经过预处理。
[0019] 根据本发明，样品可以是怀疑含有细菌的任何液体样品。在一些实施方案中，样品 是生物流体，包括尿液、痰液、脊髓液、腹水、血液和血液制品。在一些实施方案中，样品是怀 疑含有细菌的任何样品。在一些实施方案中，样品是血液或血液制品。在一些实施方案中， 血液或血液制品选自：全血、白血球、造血干细胞、血小板、红细胞、血浆、骨髓和血清。
[0020] 在一些实施方案中，血液或血液制品，如血小板，来自用于输血给接受者的捐献 者。在一些实施方案中，样品是透析样品。在一些实施方案中，透析样品选自血液透析流体 和腹膜透析流体。在一些实施方案中，样品是其中已经保存了组织（如来自用于输血给接 受者的捐献者的组织）的流体样品。在一些实施方案中，组织选自：血细胞培养物、干细胞 培养物、皮肤和骨和软骨移植物材料。在一些实施方案中，样品是来自肺、支气管肺泡、腹膜 或关节内窥镜检查灌洗的样品。在一些实施方案中，样品是环境样品，如水和土壤。在一些 实施方案中，样品是食物或饮料。本领域技术人员将认识到在其中样品来源是固体形式的 情况中，如土壤或固体食物，样品可以是从固体形式提取的液体或已经与固体形式接触的 液体。在一些实施方案中，样品是生物样品，例如，尿液、泪液、痰液或脑脊髓液。
[0021] 在第三个方面中，本发明提供了用于结合试验中的试剂，包括选自金颗粒、银颗粒 和铂颗粒的颗粒，其中颗粒大小为约20nm至约120nm，并且其中颗粒通过衔接物结合多特 异性全类属结合剂。在一些实施方案中，颗粒大小约80nm。在一些实施方案中，衔接物选自 蛋白A、蛋白G和蛋白L。在一些实施方案中，衔接物是蛋白A。在一些实施方案中，颗粒是 金。
[0022] 在第四个方面中，本发明提供了检测样品中的物质的方法，包括将样品与根据本 发明第三个方面的试剂混合，其中物质与试剂的结合形成可检测的复合物；并且检测复合 物。
[0023] 在第五个方面中，本发明提供了制备具有非常高的衔接物表面密度并且由此具有 非常高的结合剂表面密度的颗粒的方法。根据这个方面的方法包括用高浓度的衔接物孵育 有色颗粒。
[0024] 在第六个方面中，本发明提供了利用两个或更多个可检测颗粒群检测多分析物样 品中的分析物的基于结合可检测颗粒的结合剂的装置，其中第一个可检测颗粒群是直径为 约20nm至约60nm的颗粒而第二个可检测颗粒群为直径大于约60nm至约120nm的颗粒。在 某些实施方案中，第一个可检测颗粒群结合到一种或多种对第一个分析物群具有特异性的 结合剂上而第二个可检测颗粒群结合到一种或多种对第二个分析物群具有特异性的结合 剂上。
[0025] 在第七个方面中，本发明提供了用于检测样品中的细菌的测向流动装置，该装置 包括用于样品的流动通道，并且进一步包括特异性地结合细菌抗原的结合剂，其中结合剂 固定于两个或更多个可检测颗粒群上。在某些实施方案中，第一个颗粒群包括直径为约 20nm至约60nm的颗粒而第二个颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm的颗粒。在进一步 的实施方案中，第一个颗粒群结合到一种或多种对第一个分析物群具有特异性的结合剂上 而第二个颗粒群结合到一种或多种对第二个分析物群具有特异性的结合剂上。在再进一步 的实施方案中，固定于流动通道上的捕获结合剂捕获一个或多个颗粒群。在这些实施方案 中，可检测颗粒群沿着流动通道排列，使得样品在与捕获结合剂接触之前与可检测颗粒群 接触。
[0026] 在第八个方面中，本发明提供了检测样品中的分析物的方法，包括使样品与一种 或多种对一种或多种分析物具有特异性的结合剂接触。在这些实施方案中，将一种或多种 结合剂固定于两个或更多个可检测颗粒群上。在某些实施方案中，第一个可检测颗粒群包 括直径为约20nm至约60nm的颗粒而第二个可检测颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm 的颗粒。在进一步的实施方案中，第一个可检测颗粒群结合到一群对第一个分析物群具有 特异性的一种或多种结合剂上而第二个可检测颗粒群结合到一群对第二个分析物群具有 特异性的一种或多种结合剂上。在再进一步的实施方案中，使样品在允许结合剂和分析物 之间结合的条件下与一种或多种结合剂接触，其中结合剂被分析物结合表明样品中分析物 的存在。
[0027] 在第九个方面中，本发明提供了提高结合试验中检测多分析物样品中的多种分析 物与结合颗粒的结合剂的结合的特异性和/或敏感性的方法，包括使样品与一种或多种对 一种或多种分析物具有特异性的结合剂接触。在这些实施方案中，一种或多种结合剂固定 于两个或更多个可检测颗粒群上，其中第一个可检测颗粒群包括直径为约20nm至约60nm 的颗粒而第二个可检测颗粒群包括直径大于约60nm至约120nm的颗粒。在某些实施方案 中，第一个可检测颗粒群结合到对第一个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上而第 二个可检测颗粒群结合到对第二个分析物群具有特异性的一种或多种结合剂上。在进一 步的实施方案中，使样品在允许结合剂和分析物之间结合的条件下与一种或多种结合剂接 触，并