多分析物试验的制作方法
【专利说明】多分析物试验
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求分别于2012年10月5日和2013年3月4日提交的美国临时专利申 请No. 61/710, 651和61/772, 523的益处。将那些申请的每一篇的公开内容全部按引用并 入本文中。 发明领域
[0003]本发明涉及利用固定于颗粒上的多价结合剂的结合试验，尤其是免疫试验。本发 明还涉及增大颗粒的大小提高了筛选的灵敏度这一令人惊讶的发现。
[0004] 发明背景
[0005]测试液体样品的细菌污染是各种领域中的重要组成部分，如医学（例如，测试用 于输血的血样）、环境安全（例如，测试用于人使用的水样）和食品安全（例如，测试用于食 用的食品和饮料样品）。细菌测试的重要性需要快速、灵敏和特异性足够宽泛以检测多种细 菌种和属的测试。试验中的实际限制，如检测剂（例如，细菌抗原结合抗体）的量或"阳性" 结果的可视性可以控制目前的细菌测试方法满足这些需求的能力。因此，需要用于快速、宽 泛和灵敏地检测细菌的改良试剂、装置和方法。
[0006] 发明简述
[0007]在第一个方面中，本发明提供了用于检测样品中的细菌的侧向流动装置，该装 置包括用于样品的流动通道，并且进一步包括对于一种或多种细菌抗原特异性的全类属 (pan-generic)结合剂，其中所述全类属结合剂固定于一群特定大小的可检测颗粒上；和 捕获结合细菌抗原的颗粒群的捕获结合剂，其中捕获结合剂固定于流动通道上，并且其中 可检测颗粒群沿着流动通道排列，使得样品在接触捕获结合剂之前接触可检测颗粒群。在 一些实施方案中，可检测颗粒是化学发光、发光、荧光、磁或有色颗粒。为了方便，将使用术 语"有色颗粒"，但本发明考虑了使用其他形式的可检测颗粒的实施方案。在利用有色颗 粒的实施方案中，颗粒可以是金、银或铂颗粒。在一些实施方案中，颗粒直径为约60至约 120nm。在一些实施方案中，颗粒直径为约80nm。
[0008] 在一些实施方案中，全类属结合剂特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原。在一些这 样的实施方案中，全类属多克隆抗体结合脂磷壁酸（LTA)。在一些实施方案中，全类属结合 剂特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些这样的实施方案中，全类属多克隆抗体结合 细菌脂多糖结构（LPS)。在一些实施方案中，至少一种全类属结合剂特异性地结合革兰氏阳 性细菌抗原而至少一种全类属结合剂特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案 中，全类属结合剂能够结合三个或更多个属的细菌。在一些实施方案中，全类属结合剂通过 衔接物固定于可检测颗粒上。在一些实施方案中，衔接物是蛋白A、蛋白G或蛋白L。
[0009]在一些实施方案中，全类属结合剂是抗体。在一些实施方案中，全类属结合剂包括 两种或更多种全类属抗体，其中每种全类属抗体特异性地结合一种或多种细菌抗原。在各 种实施方案中，每种全类属抗体固定于有色颗粒的分开亚群上或相同的亚群上。根据本发 明，至少一种全类属抗体固定于一群特定大小的有色颗粒上。在一些实施方案中，可以将全 类属结合剂与一种或多种非全类属的结合剂组合。例如，不是全类属的结合剂可以结合细 菌的一个或多个种或菌株，但不是结合到多个属上。
[0010] 在一些实施方案中，全类属抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体以及多克隆和单克 隆抗体的组合。在一些实施方案中，全类属抗体是多克隆的，并且结合多种细菌抗原。在一 些实施方案中，全类属抗体是多克隆的并且结合多种革兰氏阳性细菌抗原。在一些实施方 案中，全类属抗体是多克隆的并且结合多种革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，全类 属抗体是多克隆的，并且结合多种革兰氏阴性细菌抗原和革兰氏阳性细菌抗原。在一些实 施方案中，至少一种全类属抗体是单克隆全类属抗体而至少一种全类属抗体是多克隆全类 属抗体。
[0011] 在一些实施方案中，全类属抗体特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原。在一些实施 方案中，全类属抗体特异性地结合革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施方案中，至少一种全类 属抗体特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原而至少一种全类属抗体特异性地结合革兰氏阴 性细菌抗原。在一些实施方案中，全类属抗体能够结合三个或多个属的细菌。在一些实施 方案中，全类属结合抗体通过衔接物固定于有色颗粒上。
[0012] 在一些实施方案中，装置包括至少三种特异性地结合革兰氏阳性细菌抗原的全类 属结合剂，每种全类属结合剂固定于有色颗粒的分开亚群上；以及至少三种特异性地结合 革兰氏阴性细菌抗原的全类属结合剂，每种全类属结合剂固定于有色颗粒的分开亚群上。 在一些实施方案中，至少一种全类属结合剂是抗体。在一些实施方案中，至少一种全类属抗 体是单克隆抗体。在一些实施方案中，颗粒的亚群是不同大小的。在一些实施方案中，颗粒 是金、银或铂。在一些实施方案中，至少一些颗粒的直径为约60nm至约120nm。在一些实施 方案中，至少一些颗粒是直径约60nm至约120nm的金颗粒。在一些实施方案中，至少一个 颗粒群（例如，金颗粒群）包括80nm颗粒。在一些实施方案中，至少一个颗粒群（例如，金 颗粒群）包括40nm颗粒。
[0013] 在一些实施方案中，捕获结合剂是特异性地结合细菌抗原的全类属抗体。在一些 实施方案中，捕获结合剂与全类属结合剂相同。在一些实施方案中，捕获抗体固定于样品流 动通道上的一个或多个位置中。在一些实施方案中，样品流动通道是吸收膜。在一些实施 方案中，吸收膜是硝基纤维素。
[0014] 在一些实施方案中，将有色颗粒在安置在吸收膜上方并且与膜的上表面接触的固 体支持物表面内干燥。
[0015] 在第二个方面中，本发明提供了检测样品中存在或不存在细菌的方法，包括将样 品与细菌抗原特异性的全类属结合剂接触，其中全类属结合剂固定于特定大小的有色颗粒 上，并且其中样品在允许全类属结合剂和细菌抗原之间结合形成结合剂-细菌抗原复合物 的条件下与全类属结合剂接触，并且进一步包括将固定的细菌抗原特异性的捕获结合剂在 允许固定的捕获结合剂和颗粒-全类属结合剂-细菌抗原复合物之间结合的条件下与特定 大小的有色颗粒接触，其中通过捕获结合剂捕获带有全类属结合剂的有色颗粒表明样品中 存在细菌。在一些实施方案中，在试验进行前，将少量可溶性全类属结合剂添加到样品中。 如此少量是足以提高系统信号的量。
[0016] 在一些实施方案中，该方法包括将根据本发明第一个方面的装置在允许捕获抗体 结合带有全类属抗体的有色颗粒的条件下与全类属抗体接触，其中通过捕获抗体捕获颗粒 表明样品中存在细菌。
[0017] 在一些实施方案中，样品已经经过预处理。
[0018] 根据本发明，样品可以是怀疑含有细菌的任何液体样品。在一些实施方案中，样品 是生物流体，包括尿液、痰液、脊髓液、腹水、血液和血液制品。在一些实施方案中，样品是怀 疑含有细菌的任何样品。在一些实施方案中，样品是血液或血液制品。在一些实施方案中， 血液或血液制品选自：全血、白细胞、造血干细胞、血小板、红细胞、血浆、骨髓和血清。
[0019] 在一些实施方案中，血液或血液制品，如血小板，来自用于输血给接受者的捐献 者。在一些实施方案中，样品是透析样品。在一些实施方案中，透析样品选自血液透析流体 和腹膜透析流体。在一些实施方案中，样品是其中已经保存了组织（如来自用于输血给接 受者的捐献者的组织）的流体样品。在一些实施方案中，组织选自：血细胞培养物、干细胞 培养物、皮肤和骨和软骨移植物材料。在一些实施方案中，样品是来自肺、支气管肺泡、腹膜 或关节内窥镜检查灌洗。在一些实施方案中，样品是环境样品，如水和土壤。在一些实施方 案中，样品是食物或饮料。本领域技术人员将认识到在其中样品来源是固体形式的情况中， 如土壤或固体食物，样品可以是从固体性质提取的液体或已经与固体形式接触的液体。在 一些实施方案中，样品是生物样品，例如，尿液、泪液、痰液或脑脊髓液。
[0020] 在第三个方面中，本发明提供了用于结合试验中的试剂，包括选自金颗粒、银颗粒 和铂颗粒的颗粒，其中颗粒大小为约60nm至约120nm，并且其中颗粒结合到多特异性全类 属结合剂上。在一些实施方案中，颗粒大小约80nm。在一些实施方案中，全类属结合剂通过 衔接物结合到颗粒上。在一些实施方案中，衔接物选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。在一些实 施方案中，衔接物是蛋白A。在一些实施方案中，颗粒是金。
[0021] 在第四个方面中，本发明提供了检测样品中的物质的方法，包括将样品与根据本 发明第三个方面的试剂混合，其中物质与试剂的结合形成可检测的复合物；并且检测复合 物。
[0022] 附图简述
[0023] 图1A是说明了使用较大的胶态金颗粒在每个反应不同数量的颗粒下导致捕获线 上较高的信号强度的图。图1B是来自模型侧向流动系统中50%稀释系列的40nm( "通用 的"）金颗粒的照片，其中在兔子IgG捕获线上捕获了葡萄球菌蛋白A覆盖的颗粒。图1C 是来自模型侧向流动系统中50%稀释系列的80nm( "增强的"）金颗粒的一组照片，其中在 兔子IgG捕获线上捕获了葡萄球菌蛋白A覆盖的颗粒。
[0024] 图2是取自模型侧向流动条带的照片。这些结果从8种不同的细菌裂解产物的十 倍稀释获得，并且从1〇8储液开始产生，并且将所得到的样品在侧向流