细胞分离的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于分离细胞和/或事先准备细胞的方法和组合物，更具体涉及用于 从外周血、骨髓、脐带血和相关的血液组织中分离红细胞的方法和组合物。
【背景技术】
[0002] 从血液中分离白细胞用于体外研究或细胞疗法通常包括主要基于构成细胞物质 >99 %的红细胞大量损耗的血液的初始分离。
[0003] 红细胞去除技术是基于红细胞的低渗裂解、密度梯度分离、增强的离心沉降，其中 增强的离心沉降使用羟乙基淀粉或促使红细胞加速沉降的混合物（其中还包含抗体）。
[0004] 低渗裂解不仅可用于体外的小体积研究，而且也可应用于为细胞疗法所处理的大 体积血液组织。在细胞疗法程序中，通常将进行红细胞的低渗裂解作为最终步骤，以在通过 其他方法发生大量损耗之后，去除样品中剩余的污染的红细胞。
[0005] 密度梯度分离依赖于细胞类型密度的差异，其中细胞类型密度的不同导致细胞被 隔离在处于不同水平的具有不同密度的流体介质中。细胞类型之间的密度差异可能较小， 而且不同的细胞类型在大小和密度上可能是多种多样的。因此，特定的细胞类型可能在分 布整个密度梯度介质中，而不是精确地沉降在密度介质中的独立区域处，因此使得所需细 胞的回收降低和/或被不需要的细胞类型污染。
[0006] 在富集罕见血液细胞类型（诸如造血祖细胞）的程序中，密度梯度沉降可引起所 需细胞子集的丢失或产量降低。例如，使用常规的密度梯度方法从脐带血中隔离祖细胞， 导致所需的干细胞，例如CD34+造血干细胞（HSC)或VSEL(极小类胚胎样干细胞）的显著 丢失（Wagner, J.E·，Am J Ped Hematol Oncol 15:169(1993))。使用常规密度梯度方法 隔离淋巴细胞可导致特定的淋巴细胞子集出现选择性丢失（Collins, J Immunol Methods 243:125(2000))〇
[0007] 这些分离方法具有用于细胞疗法的额外的禁忌，因为如果与细胞一起灌输到容器 中，分离介质中的化学实体可能是有毒性的。同样，必须进行额外的步骤，以确保在灌输 之前将它们完全去除。诸如淘析的仪器方法学还依赖于血液组分通过密度进行差动分离 (differential separation)，并且可能受性能上的类似缺陷之苦。
[0008] 从血液中去除红细胞的另一种方法是利用羟乙基淀粉，它刺激红细胞聚集，然后 在离心机中以50Xg沉降时发生比白细胞组分更快速地沉降。虽然该方法对受体通常是 无毒性的，但是其回收重要细胞类型的性能，包括例如间充质干细胞（MSC)、造血干细胞 (HSC)和VSEL是多变的，并且对于例如脐带血，可能导致干细胞的回收不太理想，而且脐带 血细胞的植入潜能降低，从而增加了移植失败的风险。
[0009] 最近报道的方法已经公开（EP 2, 117, 592 ;US 7, 598, 089)，涉及将不凝结的血液 与一种组合物混合，该组合物包括：葡聚糖；抗血型糖蛋白A的抗体；除了其他抗体种类之 外（例如，抗CD9抗体；抗CD15抗体；和串联抗体，其中已将两种不同的抗体连接在一起以 形成单一的实体）。抗体是细胞分离和从血液中回收感兴趣的有核细胞的方法的昂贵的解 决方法。
[0010] 提高罕见细胞类型从供体组织中的回收率会大大改善移植和免疫疗法的结果 (例如，骨髓移植、基于干细胞的基因疗法和免疫细胞疗法），这些疗法的成功与进行治疗 应用所引入的细胞的实际数量有关。本发明期望提供一种产生高比例的感兴趣的活细胞的 细胞分离方法。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及以下发现：当与血细胞接触时，特定的化合物（即二甲基亚砜（DMS0) 和特定的氨基酸）与大分子红细胞沉降增强因子结合具有惊人的有利效果，这些效果中有 一些仅当组织中的血细胞随后进行特定处理时才显现出来。具体地，这些化合物与大分子 红细胞沉降增强因子组合能从含血细胞的样品中回收较高数量的非红细胞的血细胞。这些 化合物还可与大分子红细胞沉降增强因子组合使用，以事先准备非红细胞的血细胞，从而 保护它们在随后的冷冻步骤中的完整性，因此还能在冷冻储藏之后回收较大量的非红细胞 的血细胞。因此，本发明人开发了一种处理血液样品的方法，以实现红血细胞和白血细胞的 分离。该方法还加速了红血细胞部分和白血细胞部分的分离，并且不依赖于抗体的使用。本 发明人还开发了一种为冷冻储藏事先准备细胞部分的方法。
[0012] 本发明提供了以下组分的组合的应用：
[0013] (i)大分子红细胞沉降增强因子，和
[0014] (ii)二甲基亚砜（DMS0)、二甲基甘氨酸（DMG)和/或缬氨酸；
[0015] 以从含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞，和/或事先准备非红细胞的血细 胞，以在随后的冷冻贮藏步骤中保护它们的完整性。优选地，所述大分子红细胞沉降增强因 子是葡聚糖，并且组分（ii)是DMS0。
[0016] 与单独使用组分（i)相比，当使用组分（i)和组分（ii)的组合从含血细胞的样品 中回收非红细胞的血细胞时，组分（ii)能从含血细胞样品中回收更多存活的非红细胞的 血细胞。
[0017] 与诸如葡聚糖和/或DMS0的试剂在例如用作冷冻保护剂时可使用的浓度相比，当 按照本发明来使用组分（i)和组分（ii)时，典型地以相对低的浓度使用这些组分。当非红 细胞的血细胞与组分（i)和组分（ii)接触时，得到的混合物可包括浓度为0.01% w/v至 20% w/v，优选 0· 05% w/v 至 10% w/v，例如 0· 1 % w/v 至 5% w/v (诸如 0· 5% w/v 至 2% w/ v、1 % w/v 至 1. 5% w/v，或 1. 25% w/v 或约 1. 25% w/v)，或 2% w/v 至 10% w/v (诸如 5% w/v 至 7. 5% w/v、6% w/v 至 6. 5% w/v，或 6. 25% w/v 或约 6. 25% w/v)的组分⑴。优选 地，当非红细胞的血细胞与组分（i)和组分（ii)接触时，该混合物可包括浓度为0. 01% v/ v 至 20% v/v，优选 0· 05% v/v 至 10% v/v，例如 0· 1 % v/v 至 5% v/v(诸如 0· 5% v/v 至 2% v/v、1 % v/v 至 1. 5% v/v，或 1. 25% v/v 或约 1. 25% v/v)，或 2% v/v 至 10% v/v (诸如 5% v/v 至 7. 5% v/v、6% v/v 至 6. 5% v/v，或 6. 25% v/v 或约 6. 25% v/v)的组分（ii)。 典型地，组分（i)的％ w/v浓度与组分（i)的％ v/v浓度近似相同，但是组分（ii)的浓度 可能偶尔较高，例如高两倍、三倍、四倍或五倍。
[0018] 优选地，当使用组分（i)和组分（ii)的组合来事先准备非红细胞的血细胞以在 随后的冷冻贮藏中保护它们的完整性时，该准备步骤与为准备好用于直接冷冻贮藏/冻结 所可能采取的任何步骤都明显不同。换句话说，在事先准备的非红细胞的血细胞进行冷冻 贮藏之前，添加适当量的冷冻保护剂的额外步骤是适当的。在此方面，对用于冷冻贮藏的制 剂，使用包括组分（i)或组分（ii)中的至少一种的冷冻保护剂可能是有利的，这将在事先 准备步骤呈现出来。这样，不需要从事先准备的组合物中回收细胞，更确切地说，可仅向细 胞和事先准备的组合物中添加一种或多种额外的冷冻保护剂。
[0019] 优选地，当使用组分（i)和组分（ii)的组合来事先准备非红细胞的血细胞以在随 后的冷冻贮藏中保护它们的完整性时，所述随后的冷冻贮藏步骤可涉及以下步骤中的一个 或多个步骤：(b)向由此获得的非红细胞的血细胞添加冷冻保护剂，（c)冷冻贮藏非红细胞 的血细胞，（d)使非红细胞的血细胞解冻，和/或（e)从冷冻贮藏的制剂中回收非红细胞的 血细胞。典型地，它涉及步骤（b)，涉及步骤（c)，或涉及步骤（b)和步骤（c)两个步骤，因 为在防止如果没有组分（i)和组分（ii)的组合的情况下（即，即使仅存在这些组分中的一 种，而另一组分不存在）可能出现的损伤类型中，这些步骤是组分（i)和组分（ii)的组合 在帮助保护细胞的完整性中特别有效的步骤。
[0020] 应理解的是，组分（i)和组分（ii)当然可用于以细胞部分的形式事先准备非红细 胞的血细胞，该细胞部分已经经过处理以去除红细胞和/或一种或多种特定的有核细胞， 从而获得白血细胞的特别期望的子集。但是，因为本发明的细胞分离方法还用于保护得到 的（分离/回收的）细胞免于在随后的冷冻贮藏步骤中受到损伤，因此简单使用本发明的 细胞分离方法可更加有效，因为在不需要两步单独的（分离和事先准备）处理步骤的情况 下，可获得与本发明的准备方法类似的益处。
[0021] 因此，本发明提供了一种分离细胞的方法，所述方法包括：
[0022] (a)使含血细胞的样品与以下组分接触：
[0023] ⑴大分子红细胞沉降增强因子，和
[0024] (ii)DMSO、DMG 和 / 或缬氨酸；
[0025] (b)使所述样品分成沉降相和上清液相；和
[0026] (c)从所述沉降相和/或所述上清液相中回收细胞。
[0027] 与单独使用组分（i)所能获得的存活的非红细胞的血细胞相比，组分（i)和组分 (ii)的组合能回收更多存活的非红细胞的血细胞。在（a)分离步骤之后和（b)随后的冷冻 贮藏步骤之后体现出了这一优点。
[0028] 优选地，步骤（a)包括使含血细胞的样品与包括组分（i)和组分（ii)的组合物接 触。如下所述，用作组分（i)的优选试剂是葡聚糖。
[0029] 优选地，组分（ii)是DMSO、DMG或缬氨酸。
[0030] 优选地，步骤（c)包括从所述沉降相或所述上清液相中回收细胞。
[0031] 因此，在优选方面，本发明提供了一种分离细胞的方法，所述方法包括：
[0032] a)使含血细胞的样品与组合物接触，该组合物包括：
[0033] I)葡聚糖；和
[0034] II)二甲基亚砜（DMS0)、二甲基甘氨酸（DMG)或缬氨酸
[0035] b)使所述样品分成沉降相和上清液相；和
[0036] c)从所述沉降相或所述上清液相中回收细胞。
[0037] 优选地，在本发明的分离细胞的方法中，步骤（a)包括使含血细胞的样品与包括 组分（i)和组分（ii)的组合物接触，其中，使该含血细胞的样品和该组合物以10:1至1:10 的体积比（除非特别指出，本文提到的组分的比率通常用于指体积比），优选以5:1至1:5 的体积比，更优选以2:1至1:2的体积比混合。典型地，上述体积比为1:1或约1:1的比率。
[0038] 具体使用的比率取决于组合物中的组分（i)和组分（ii)的浓度。因此，在本发 明中使用的一种特别优选的组合物是如下的组合物，该组合物基于PBS，并且通过组合等 量（体积）的在PBS中的5% w/v葡聚糖（Dextran) 500和在PBS中的5% v/v DMS0来制 备（除非特别指出，本文中提到的组分（i)的浓度单位通常指％ w/v，而本文中提到的组分 (ii)的浓度单位通常指％v/v)。在本文中将该组合物称为"TotiCyte IX"，含有在PBS中 的2. 5% w/v葡聚糖500和2. 5% v/v DMS0。当使用该组合物时，上述比率是特别优选的。 但是，组合物中的组分（i)和组分（ii)的浓度可以改变。例如，在本发明中使用的替代组合 物是更加浓缩的制剂，在本文中称为"TotiCyte 5X"，指基于PBS的并且含有7. 5% w/v葡 聚糖500和7. 5% v/v DMS0的TotiCyte组合物。当使用诸如这种TotiCyte 5X的组合物 时，可调整上述优选比率，以使组合物的比例减小至例如三分之一、四分之一或五分之一。 因此，在该实施方式中，含血细胞的样品和组合物以50:1至1:2的体积比，优选25:1至1:1 的体积比，更优选10:1至5:2的体积比混合可能是更优选的。典型地，上述体积比为5:1 或约5:1的比率。
[0039] 因此，通常在本发明的上下文中，含血细胞的样品和组合物以50:1至1:10的体积 比，优选25:1至1:5的体积比，更优选10:1至1:2的体积比混合是优选的。
[0040] 含血细胞的样品与组分（i)和组分（ii)混合的比率还可参照组分（i)和组分 (ii)在得到的混合物中的浓度来定义。优选地，使含血细胞的样品与组分（i)组合，以使 组分（i)在得到的混合物中的浓度为0. 1% w/v至8% w/v，优选0. 25% w/v至5% w/v，更 优选〇· 5% w/v至2% w/v，还更优选1 % w/v至1. 5% w/v，并且典型地为1. 25% w/v或约 1. 25% w/v。优选地，含血细胞的样品与组分（ii)组合，以使组分（ii)在得到的混合物中 的浓度为 〇· 1 % v/v 至 8 % v/v，优选 0· 25 % v/v 至 5 % v/v，更优选 0· 5 % v/v 至 2 % v/v， 还更优选1% v/v至1.5% v/v，并且典型地为1.25% v/v或约1.25% v/v。典型地，组分 (i)和组分（ii)的浓度近似相同。因此，在本发明的分离方法的一个优选方面中，一旦含血 细胞的样品与组分（i)和组分（ii)接触，则组分（i)的浓度是〇.25%w/v至5%w/v，并且 组分（ii)的浓度是0. 25% v/v至5% v/v。
[0041] 如果使用更加浓缩的组分（i)和组分（ii)的组合物（诸如TotiCyte 5X)，则在 (细胞+组合物）混合物中的目标浓度可能更高。因此，更通常来讲，组分（i)的目标浓度 是0· 1 % w/v至10% w/v，优选0· 5% w/v至5% w/v，更优选1 % w/v至4% w/v，并且典型 地为1. 25% w/