一种单细胞克隆分离专用培养膜的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及细胞培养，特别涉及一种单细胞克隆分离专用培养膜及单细胞克隆分离方法。
【背景技术】
[0002]单细胞克隆指的是分离单个细胞，其增殖产生的后代都是来源于同一个细胞，即为单细胞克隆。单细胞克隆分离技术的成功解决是实现细胞水平研宄的基础。传统的单细胞克隆分离可采用有限稀释法或克隆环法。
[0003]有限稀释法:即把细胞稀释到理论上的5~10 μ I培养液中含I个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液至96孔板中，每孔补足培养液至200 μ 1，在显微镜下找到有单细胞克隆生长的培养孔，进行单细胞克隆分离。实际的操作中，该法效率不高，大量存在的空白孔和多细胞孔(细胞数大于或等于2)需要研宄人员观察排除，费时费力。
[0004]克隆环法:在显微镜下找到要挑取的单克隆，用记号笔在培养板的背面标示出来。用镊子夹取克隆环，在环的底部均匀的涂上凡士林，扣在标记的单克隆上，形成相对封闭的空间，然后在克隆环内滴入适量的胰酶，细胞消化下来后用枪头吸出，放到新的培养板中培养。该方法对操作技巧要求较高，初学者不易掌握。
[0005]目前高端的流式细胞仪不仅可以实现活细胞的多通道分选(荧光激活细胞分选，FACS)，还可以进行单细胞的分离种植分选，为大规模的单细胞研宄奠定技术基础。但是这些分选设备价格昂贵，目前还难以普及。因此，探索一种操作简单、快速、高效的单细胞克隆分离方法十分有意义。
【实用新型内容】
[0006]为克服上述现有技术的缺陷与不足，本实用新型提供一种单细胞克隆分离专用培养膜及单细胞克隆分离方法。
[0007]本实用新型的技术方案是:
[0008]一种单细胞克隆分离专用培养膜，包括培养膜本体，所述培养膜本体上表面呈矩阵式排列多个正方形分离培养单元，每个正方形分离培养单元的中心处设有圆形分离培养区。
[0009]优选的，所述培养膜本体为聚苯乙烯膜。
[0010]优选的，所述圆形分离培养区表面进行过改性处理，接枝羟基(ΟΗ)，或者羧基(COOH)，或者氨基(NH或NH2)等亲水基团。
[0011]优选的，所述培养膜本体除每个正方形分离培养单元中心的分离培养区外，其它部分表面覆盖有超疏水纳米层。
[0012]优选的，超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料，超疏水纳米层还可以为超疏水的阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜，
[0013]优选的，每个正方形分离培养单元的边缘有边界线，每个正方形分离培养单元的左上角标有字母和数字的组合编号。
[0014]优选的，所述培养膜本体为透光膜。
[0015]优选的，每个正方形分离培养单元边长5~8mm，其中心的圆形分离培养区直径2?4mmο
[0016]一种使用单细胞克隆分离专用培养膜进行单细胞克隆分离的方法，包括步骤:
[0017]S1、将单细胞克隆分离专用纳米培养膜置于配套培养板或培养皿中；
[0018]S2、制备单细胞悬液，调整细胞密度，将有限稀释的单细胞悬液加入置有培养膜的培养板或培养皿中，细胞只能在正方形分离培养单元中心经过表面亲水改性的分离培养区粘附贴壁，而不能在培养皿上其它经过超疏水处理的部位粘附生长；
[0019]S3、每天在显微镜下观察细胞生长情况，记录有单克隆生长的培养单元；无菌条件下，用镊子取出培养膜，根据记录的编号，用剪刀剪下有单克隆细胞生长的正方形分离培养单元，在PBS中轻柔漂洗，置于24孔板中，在显微镜下复检验证，确定剪下的分离培养单元上有单细胞克隆生长；
[0020]S4、将生长有单细胞克隆的分离培养单元转移至24孔板的培养孔中，加入0.25%的胰酶消化细胞；
[0021]S5、收集消化好的单细胞悬液，经PBS重悬，在100rpm转速下离心lOmin，获取细胞沉淀，再次在100rpm转速下离心lOmin，获取细胞沉淀，用完全培养基重悬，将细胞转移至新的24孔中，继续扩大培养，所得即为单细胞克隆。
[0022]本实用新型的优点是:
[0023]本实用新型所提供的单细胞克隆分离专用培养膜及单细胞克隆分离方法，培养膜本体上表面呈矩阵式排列多个正方形分离培养单元，每个正方形分离培养单元的中心处设有圆形分离培养区。所述圆形分离培养区表面进行亲水性改性处理，有利于细胞贴壁生长。所述培养膜本体除每个正方形分离培养单元中心的分离培养区外，其它部分表面覆盖有超疏水纳米层，不利于细胞贴壁生长。只有贴壁到每个正方形分离培养单元中心分离培养区的细胞能够存活并继续增殖生长成单细胞克隆，超疏水纳米层将单细胞克隆彼此隔离开，可方便的进行单细胞克隆的分离操作。
【附图说明】
[0024]下面结合附图及实施例对本实用新型作进一步描述:
[0025]图1为本实用新型所述的单细胞克隆分离专用培养膜的俯视图。
【具体实施方式】
[0026]如图1所示，本实用新型所揭示的单细胞克隆分离专用培养膜，包括由聚苯乙烯制成的培养膜本体1，所述培养膜本体为透光膜，培养膜本体上表面呈矩阵式排列多个正方形分离培养单元2，每个正方形分离培养单元的中心处设有圆形分离培养区3。每个正方形分离培养单元的边缘有边界线，每个正方形分离培养单元边长5~8_，其中心的圆形分离培养区直径2~4mm。每个正方形分离培养单元的左上角标有字母和数字的组合编号，字母代表该正方形分离培养单元所在行，数字代表该正方形分离培养单元所在列，方便区分。
[0027]所述圆形分离培养区3表面进行过改性处理，如接枝羟基(OH)，或者羧基(COOH)，或者氨基(NH或NH2)等亲水基团。所述培养膜本体除每个正方形分离培养单元中心的分离培养区外，其它部分表面覆盖有超疏水纳米层。超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料，超疏水纳米层还可以为超疏水的阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜，上述超疏水纳米层的制作方法为现有技术中采用的方法，例如在聚苯乙烯、聚L-乳酸或聚四氟乙烯材料表面蚀刻具有一定粗糙度的微观结构从而构建超疏水表面，采用气相沉积的方法制备超疏水的阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜。
[0028]本实用新型的单细胞克隆分离专用培养膜的细胞分离方法，包括步骤:
[0029]本实用新型的使用单细胞克隆分离专用培养膜进行单细胞克隆分离的方法，包括步骤:
[0030]S1、将单细胞克隆分离专用纳米培养膜置于配套培养板或培养皿中；
[0031]S2、制备单细胞悬液，调整细胞密度，将有限稀释的单细胞悬液加入置有培养膜的培养板或培养皿中，细胞只能在正方形分离培养单元中心经过表面亲水改性的分离培养区粘附贴壁，而不能在培养皿上其它经过超疏水处理的部位粘附生长；
[0032]S3、每天在显微镜下观察细胞生长情况，记录有单克隆生长的培养单元；无菌条件下，用镊子取出培养膜，根据记录的编号，用剪刀剪下有单克隆细胞生长的正方形分离培养单元，在PBS中轻柔漂洗，置于24孔板中，在显微镜下复检验证，确定剪下的分离培养单元上有单细胞克隆生长；
[0033]S4、将生长有单细胞克隆的分离培养单元转移至24孔板的培养孔中，加入0.25%的胰酶消化细胞；
[0034]S5、收集消化好的单细胞悬液，经PBS重悬，在100rpm转速下离心lOmin，获取细胞沉淀，再次在100rpm转速下离心lOmin，获取细胞沉淀，用完全培养基重悬，将细胞转移至新的24孔中，继续扩大培养，所得即为单细胞克隆。
[0035]另外，本实用新型的单细胞克隆分离专用纳米培养膜可制备成各种形状，以适应目前市售的各种培养板或培养皿，也可以制备配套的专用培养皿，如方形，此专用培养皿的底面和侧壁均覆盖有超疏水纳米层。
[0036]上述实施例只为说明本实用新型的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本实用新型的内容并据以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围。凡根据本实用新型主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。
【主权项】
1.一种单细胞克隆分离专用培养膜，其特征在于:包括培养膜本体，所述培养膜本体上表面呈矩阵式排列多个正方形分离培养单元，每个正方形分离培养单元的中心处设有圆形分离培养区。
2.根据权利要求1所述的单细胞克隆分离专用培养膜，其特征在于:所述培养膜本体为聚苯乙稀膜。
3.根据权利要求2所述的单细胞克隆分离专用培养膜，其特征在于:所述圆形分离培养区表面进行过改性处理，接枝羟基、羧基或氨基等亲水基团。
4.根据权利要求3所述的单细胞克隆分离专用培养膜，其特征在于:所述培养膜本体除每个正方形分离培养单元中心的分离培养区外，其它部分表面覆盖有超疏水纳米层。
5.根据权利要求4所述的单细胞克隆分离专用培养膜，其特征在于:所述超疏水纳米层为具有超疏水表面的聚苯乙烯层、聚L-乳酸层、聚四氟乙烯层、阵列碳纳米管薄膜或氟化PEDOT薄膜中的一种。
6.根据权利要求1所述的单细胞克隆分离专用培养膜，其特征在于:每个正方形分离培养单元的边缘有边界线，每个正方形分离培养单元的左上角标有字母和数字的组合编号。
7.根据权利要求6所述的单细胞克隆分离专用培养膜，其特征在于:所述培养膜本体为透光膜。
8.根据权利要求6所述的单细胞克隆分离专用培养膜，其特征在于:每个正方形分离培养单元边长5~8_，其中心的圆形分离培养区直径2~4_。
【专利摘要】本实用新型公开了一种单细胞克隆分离专用培养膜，包括培养膜本体，所述培养膜本体上表面呈矩阵式排列多个正方形分离培养单元，每个正方形分离培养单元的中心处设有圆形分离培养区。所述圆形分离培养区表面进行亲水性改性处理，有利于细胞贴壁生长。所述培养膜本体除每个正方形分离培养单元中心的分离培养区外，其它部分表面覆盖有超疏水纳米层，不利于细胞贴壁生长。只有贴壁到每个正方形分离培养单元中心分离培养区的细胞能够存活并继续增殖生长成单细胞克隆，超疏水纳米层将单细胞克隆彼此隔离开，可方便的进行单细胞克隆的分离操作。
【IPC分类】C12M3-04, C12N5-02
【公开号】CN204608032
【申请号】CN201520253752
【发明人】何向锋, 强福林, 沈康, 王建红, 施文
【申请人】何向锋, 南通市肿瘤医院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月24日