专利名称：分离细胞质级分而不影响卵母细胞和胚胎细胞活力的方法
技术领域：
本发明涉及一种从卵母细胞中分离细胞质级分而不会影响卵母细胞受精能力的方法。本发明还涉及一种从胚胎细胞中分离细胞质级分而不会影响该细胞发育潜能的方法。
背景技术：
用于分析卵母细胞细胞质的方法需要破坏卵母细胞。因此，尽管在分析中提取的信息可能特别令人关注，但是研究者不能够将卵母细胞作为完整的细胞单位根据从分析中提取的信息进行进一步研究。此外，随后不能够使卵母细胞受精并使之发育成胚胎、胎儿和婴儿。
存在对研究卵母细胞中胞质机制而不影响卵母细胞受精能力的方法的需求。还存在对研究胚胎细胞中胞质机制而不影响该细胞发育潜能的方法的需求。可以将这些方法用于研究卵母细胞或胚胎细胞中的那些由线粒体介导并且是卵母细胞或胚胎细胞或来源于受精卵母细胞或胚胎细胞的子代中的功能异常或疾病的原因或怀疑可导致这些情况或与这些情况相关的机制。
本发明的描述本发明试图满足这些需求且在第一个方面中提供了一种从卵母细胞中分离细胞质级分而不会影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括包括从卵母细胞中释放细胞质级分的步骤。从卵母细胞中释放的细胞质级分的体积约占该卵母细胞体积的5％。优选该体积约占所述卵母细胞体积的2％。
在本发明第一个方面的一个实施方案中，所述的方法包括下列步骤(a)将释放装置插入卵母细胞；(b)将约占卵母细胞体积5％的细胞质级分抽入释放装置；和(c)从卵母细胞中抽出释放装置而使所述级分从释放装置中分离出来。
抽入释放装置中的细胞质级分的体积一般小于10pL且优选8pL。优选释放装置包括至少一种ICSI移液管且优选将细胞质级分抽入移液管内约(100μm)。
从卵母细胞抽入释放装置中的细胞质级分一般在释放装置与卵母细胞之间形成细胞质内含物的挤出物。通过缓慢拉伸或剪切挤出物以分离挤出物而从卵母细胞中分离细胞质级分。优选通过拉伸挤出物而分离细胞质级分。
一般来说，细胞质级分含有胞质细胞器且包括卵母细胞线粒体和线粒体产物的样品或由它们组成。
位于卵母细胞中的线粒体是一种模板，从受精卵母细胞中发展而来的子代内所有的线粒体来源于该模板。本发明者认为用于从卵母细胞中分离细胞质级分而不影响卵母细胞受精能力的方法能够研究线粒体基因组的完整性与卵母细胞和由受精卵母细胞发展而来的子代的功能之间的相关性。
因此，在第二个方面，本发明涉及一种分析卵母细胞中线粒体基因组而不影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括下列步骤a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；b)分析级分中线粒体的线粒体基因组。
线粒体基因组突变可导致功能异常或疾病或至少与此相关。例如，可以理解来自线粒体基因组8470位-13,446位核苷酸的核苷酸序列缺失即所谓的“5kb共同缺失”与克-塞综合征(KSS)和慢性进行性外眼肌瘫痪(CPEO)相关。可能或不可能因共同缺失而观察到的导致疾病的其它缺失包括脑和心脏线粒体基因组中的7.4kb缺失和10.4kb缺失/插入以及各种点突变。在包括骨骼肌、心脏、脑、卵母细胞、白细胞、视网膜和卵巢在内的人体组织中也观察到了这种缺失。
线粒体基因组中超过40个致病性点突变可能与涉及中枢神经系统、心脏、肌肉、内分泌系统、肾脏和肝脏的较广范围的退化性疾病相关。与点突变相关的疾病包括利氏综合征、MELAS(线粒体性脑肌病、乳酸中毒和中风样发作)、MERRF(伴有深红(ragged-red)纤维的肌阵挛性癫痫)、NARP(神经病、运动失调和色素性视网膜炎)和LHON(利伯氏遗传性视神经萎缩)。
一种从卵母细胞中分离细胞质级分而不影响卵母细胞受精能力的方法因卵母细胞与由受精卵母细胞发展而来的子代的功能完整性而用于检测线粒体基因组中的核苷酸序列突变、能够研究核苷酸序列、多态性或突变。
因此，在第三个方面中，本发明提供了一种检测位于卵母细胞线粒体内的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变而不影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括下列步骤a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和b)对细胞质级分中线粒体的线粒体基因组核苷酸序列分析线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的存在。
如果导致疾病或功能异常或与之相关的线粒体基因组突变(包括点突变)大部分仅通过母系遗传，那么一种分离细胞质级分而不影响卵母细胞受精能力的方法可用于预测来源于受精卵母细胞的子代是否会含有可导致疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与这些情况相关的线粒体基因组的核苷酸序列、多态性或突变。
因此，在第四个方面中，本发明提供了一种用于预测来源于受精卵母细胞的子代是否含有可导致疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与这些情况相关的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变的方法，其中该方法不会影响卵母细胞受精的能力，该方法包括下列步骤a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和b)对级分中线粒体的线粒体基因组分析线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的存在；其中核苷酸序列、多态性或突变的存在表明了来源于受精卵母细胞的子代含有核苷酸序列、多态性或突变的可能性。
仅在卵母细胞内线粒体的线粒体基因组中存在的核苷酸序列、多态性或突变(公知它们与疾病或功能异常相关或可导致这些情况或怀疑可导致这些情况)可能不足以介导卵母细胞自身或来源于受精卵母细胞的子代中的疾病或功能异常。实际上，看起来在含有核苷酸序列、多态性或突变的卵母细胞或来源于受精卵母细胞的子代中存在产生疾病或功能异常的可能性和/或严重性的至少一种其它因素。即卵母细胞内线粒体基因组中含有特殊核苷酸序列、多态性或突变的线粒体的实际比例或“阈值水平”为卵母细胞或来源于受精卵母细胞的子代中的疾病或功能异常提供了可能性和/或严重性。特别地且与核基因组相反，在卵母细胞中存在至少约100,000个拷贝的线粒体基因组。当卵母细胞含有一种以上的线粒体基因组时，观察到了“异质性”。卵母细胞、且实际上来源于受精卵母细胞的子代的组织在将核苷酸序列、多态性或突变引入细胞时成为“异质性的”，而在引入前所述细胞含有单一种类的线粒体基因组。鉴于线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变可导致疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与这些情况相关，所以一般认为当异质性超过特定水平时，迟早会观察到疾病或功能异常的表现。
为了获得人卵母细胞中能代表所有线粒体基因组的样品，根据对小鼠卵母细胞中线粒体在减数分裂的特定阶段迁移至卵母细胞细胞质的特定区域、特别是核周区的观察结果，一般将一种用于测定人卵母细胞中异质性程度的方法应用于减数分裂的特定阶段。一种分离细胞质级分而不影响卵母细胞受精能力的方法可用于测定卵母细胞中的异质性水平并用于预测来源于受精卵母细胞的子代组织中异质性的平均水平或可能的范围。
因此，在第五个方面中，本发明提供了一种测定卵母细胞中线粒体基因组的异质性水平而不影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括下列步骤a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；b)将级分中含有核苷酸序列、多态性或突变的线粒体基因组的数量与级分中不含核苷酸序列、多态性或突变的基因组数量进行比较。
由于来源于受精卵母细胞的子代中异质性水平和可导致疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与这些情况相关的核苷酸序列、多态性或突变的存在为疾病或功能异常提供了可能性和/或严重性，故可将测定卵母细胞中线粒体基因组异质性水平的方法用于预测来源于受精卵母细胞的子代是否可能患有由特殊核苷酸序列、多态性或突变导致或与此相关的疾病或功能异常，和/或疾病或功能异常的严重性。
因此，在第六个方面中，本发明提供了一种测定来源于受精卵母细胞的子代是否患有，或可能患有由线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变导致或与此相关的疾病或功能异常，其中该方法不会影响卵母细胞受精能力且包括下列步骤
a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；b)对级分中线粒体的线粒体基因组分析核苷酸序列、多态性或突变的存在；和测定所述子代是否可能患有疾病或功能异常，其中对级分中线粒体的线粒体基因组的分析表明相应于卵母细胞中核苷酸序列、多态性或突变的线粒体基因组的异质性水平至少与公知和疾病或功能异常的表现相关的异质性水平相同。
如上所述，用于分析来自卵母细胞的细胞质级分的方法包括破坏卵母细胞的步骤。尽管这些方法揭示了有关由此破坏的卵母细胞的信息，但是该信息的价值仅限于对未评价的其它卵母细胞的推断。如果来自相同个体的卵母细胞群体就卵质内含物而言一般是异质的，那么来源于受破坏的卵母细胞的信息可以准确或可靠地推广至其它卵母细胞的程度还存在一些问题。也就是说，使用这些方法不可能因为发现卵母细胞不具有可导致或相关于卵母细胞或受精卵母细胞子代中的疾病或功能异常的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变，或与核苷酸序列、多态性或突变相关的异质性程度较低，而推断来源于相同个体的其它卵母细胞具有相同的线粒体基因型。因此，用于分析卵母细胞的这些方法限于体外受精领域，其中预计来源于患者的某些卵母细胞可以含有导致或相关于来源于受精卵母细胞子代中的疾病或功能异常的核苷酸序列、多态性或突变。
从卵母细胞中分离细胞质级分而不影响卵母细胞受精能力的方法特别可用于筛选受精前卵母细胞中核苷酸序列、多态性或突变的存在，这些核苷酸序列、多态性或突变可导致来源于受精卵母细胞子代中的疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与此相关。
因此，在第七个方面中，本发明提供了一种筛选卵母细胞内线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的存在的方法，所述核苷酸序列、多态性或突变可导致来源于受精卵母细胞子代中的疾病或功能异常，或怀疑可导致这些情况，或与此相关，其中该方法不会影响卵母细胞的受精能力且包括下列步骤a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；
b)对级分中线粒体的线粒体基因组分析核苷酸序列、多态性或突变的存在。
接受体外受精治疗的患者通常可用于受精的卵母细胞很少，且这些有效卵母细胞中的某些可能在线粒体基因组中含有可导致或相关于受精卵母细胞子代中的疾病或功能异常的核苷酸序列、多态性或突变。用于从卵母细胞中分离细胞质级分的其它方法特别不适于筛选受精用卵母细胞且可能导致破坏那些在其线粒体基因组中不含核苷酸序列、多态性或突变的卵母细胞或那些就所述突变而言具有低水平的异质性的卵母细胞，其中所述线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变可导致疾病或功能异常或与之相关。
从卵母细胞中分离细胞质级分而不影响卵母细胞受精能力的方法特别可用于在受精前对不含导致或可能导致或相关于受精卵母细胞子代的疾病或功能异常的核苷酸序列、多态性或突变的受精用卵母细胞进行筛选的方法。
因此，在第八个方面中，本发明涉及一种筛选受精用卵母细胞的方法，这种受精用卵母细胞(i)不含可导致受精卵母细胞子代的疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与此相关的卵母细胞内线粒体的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变；或(ii)就核苷酸序列、多态性或突变而言具有的线粒体基因组的异质性低于公知与疾病或功能异常的表现相关的异质性的水平；其中该方法不会影响卵母细胞受精能力且包括下列步骤a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；b)分析级分中线粒体的线粒体基因组；和c)筛选受精用卵母细胞，条件是使卵母细胞线粒体基因组在核苷酸序列、多态性或突变方面异质性程度低于公知与疾病或功能异常的表现相关的异质性的程度。
可以使分别按照本发明第七或第八个方面筛选或选择的卵母细胞通过胞质内精子注射(ICSI)或通过体外受精而受精。优选使卵母细胞通过ICSI受精。
就本发明的第八个方面特别适合于筛选受精用卵母细胞并可以在ICSI或IVF前使用而言，本发明者认为本发明第八个方面所包括的方法是新型体外受精过程的一个完整部分。
因此，在第九个方面中，本发明提供了一种使卵母细胞受精的方法，该方法包括下列步骤a)按照本发明第一个方面的方法从卵母细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；b)对级分中线粒体的线粒体基因组分析可导致受精卵母细胞的子代中疾病或功能异常，或怀疑可导致这些情况，或与此相关的核苷酸序列、多态性或突变的存在；和c)使卵母细胞受精，条件是使卵母细胞线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的异质性程度低于公知与疾病或功能异常的表现相关的异质性的程度。
按照标准技术可以分析按照本发明第一个方面的方法分离的属于细胞质级分中的线粒体的线粒体基因组。这些技术已在后文中举例说明，其包括聚合酶链反应(PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、基因组杂交、核苷酸测序和基因功能检测和/或测定。
既然测定了卵母细胞中线粒体基因组的异质性水平，那么在线粒体随机分配入细胞质时可以获得有代表性的基因组级分。优选当预计卵母细胞中线粒体的分布是随机的，例如在初级卵母细胞的生发泡(GV)期和/或在次级卵母细胞的减数分裂中II期至融合生殖前的阶段时，从卵母细胞中抽出细胞质级分。
当从卵母细胞中分离细胞质级分的方法不会明显受卵母细胞代谢的干扰时，本发明者认为这种分离细胞质级分的方法可用于研究其它细胞、例如胚胎细胞的细胞质而不会影响这些细胞的发育潜能。
因此，在第十个方面中，本发明提供了一种从胚胎细胞中分离细胞质级分而不影响该细胞发育潜能的方法，该方法包括使细胞质级分从所述细胞中释放出来的步骤。从细胞中释放的细胞质级分的体积约占该细胞体积的5％。优选从细胞中释放的细胞质级分的体积约占该细胞体积的2％。
在本发明第十个方面的一个实施方案中，所述方法包括下列步骤(a)将释放装置插入胚胎细胞；
(b)将约占胚胎细胞体积5％的细胞质级分抽入释放装置；和(c)从所述细胞中抽出释放装置而使所述级分从释放装置中分离出来。
抽入释放装置中的细胞质级分的体积一般小于10pL且优选8pL。优选释放装置包括至少一种ICSI移液管且优选将细胞质级分抽入该移液管内约(100μm)。
将细胞质级分从胚胎细胞中抽入释放装置的过程一般在释放装置与胚胎细胞之间形成胞质内含物的挤出物。通过缓慢拉伸或剪切挤出物以分离该挤出物可以从胚胎细胞中分离细胞质级分。优选通过拉伸挤出物来分离细胞质级分。
一般来说，细胞质级分含有胞质细胞器且包括胚胎细胞线粒体和线粒体产物的样品或由它们组成。
如上所述，已知线粒体基因组中的各种缺失和点突变可导致功能异常或疾病或至少与之相关。从胚胎细胞中分离细胞质级分而不影响该细胞发育潜能的方法可用于检测线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变，它能研究核苷酸序列、多态性或突变在胚胎细胞和来源于胚胎细胞的子代中的功能完整性。
因此，在第十一个方面中，本发明提供了一种检测胚胎细胞线粒体内的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变而不影响该细胞发育潜能的方法，该方法包括下列步骤a)按照本发明第十个方面的方法从胚胎细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和b)对细胞质级分中线粒体的线粒体基因组核苷酸序列分析线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的存在。
本发明者认为分离细胞质级分而不影响胚胎细胞发育潜能的方法可用于预测来源于胚胎细胞的子代是否会在线粒体基因组中含有可导致疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与之相关的核苷酸序列、多态性或突变。
因此，在第十二个方面中，本发明提供了一种用于预测来源于胚胎细胞的子代是否在线粒体基因组中含有可导致疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与这些情况相关的核苷酸序列、多态性或突变的方法，其中该方法不会影响所述细胞的发育潜能，该方法包括下列步骤a)按照本发明第十个方面的方法从胚胎细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和b)对级分中线粒体的线粒体基因组分析核苷酸序列、多态性或突变的存在。
其中核苷酸序列、多态性或突变的存在表明了来源于胚胎的子代含有核苷酸序列、多态性或突变的可能性。
正如本文上述所讨论的，在观察到由线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变导致或与之相关的疾病或功能异常的表现之前必须超过异质性的特定水平是可能的。
因此，在第十三个方面中，本发明提供了一种测定胚胎细胞中线粒体基因组异质性水平而不影响该细胞发育潜能的方法，且该方法包括下列步骤a)按照本发明第十个方面的方法从胚胎细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和b)将级分中含有核苷酸序列、多态性或突变的线粒体基因组的数量与级分中不含核苷酸序列、多态性或突变的基因组数量进行比较。
因此，在第十四个方面中，本发明提供了一种测定来源于胚胎细胞的子代是否可能患有由线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变导致或怀疑由这些因素导致或与此相关的疾病或功能异常的方法，其中该方法不会影响所述细胞的发育潜能且包括下列步骤a)按照本发明第十个方面的方法从胚胎细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和b)对级分中线粒体的线粒体基因组分析核苷酸序列、多态性或突变的存在；测定所述子代是否可能患有疾病或功能异常，其中对级分中线粒体的线粒体基因组的分析表明胚胎细胞的线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的异质性水平至少与公知与疾病或功能异常的表现相关的异质性水平相同。
在胚胎转移过程开始前，重要的是选择(i)一种胚胎，其线粒体基因组不含可导致或怀疑可导致或相关于疾病或功能异常的核苷酸序列、多态性或突变；和/或(ii)一种胚胎，其核苷酸序列、多态性或突变具有低水平异质性。
从胚胎细胞中分离细胞质级分而不影响该细胞发育潜能的方法特别可用于，在胚胎转移前，筛选不含可导致或怀疑可导致或相关于来自胚胎细胞的子代的疾病或功能异常的核苷酸序列、多态性或突变的、用于胚胎转移的胚胎。
因此，在第十五个方面中，本发明提供了一种筛选胚胎转移所用胚胎的方法，这种胚胎(i)不含来自该胚胎之胚胎细胞线粒体的线粒体基因组的核苷酸序列、多态性或突变，所述核苷酸序列、多态性或突变可导致或怀疑可导致或相关于该胚胎细胞或胚胎的子代的疾病或功能异常；或(ii)线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的异质性水平低于公知与疾病或功能异常的表现相关的异质性水平；其中该方法不会影响胚胎发育潜能且包括下列步骤a)按照本发明第十个方面的方法从胚胎细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和b)分析级分中线粒体的线粒体基因组；和c)筛选用于胚胎转移的胚胎，条件是使胚胎细胞线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的异质性程度至少低于公知与疾病或功能异常的表现相关的异质性程度。
在第十七个方面中，本发明涉及一种在从卵母细胞中或从胚胎细胞中分离细胞质级分的方法中应用的试剂盒。该试剂盒包括至少一种对卵母细胞或胚胎细胞内线粒体的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变具有特异性的核苷酸探针，其中所述线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变可导致来源于受精卵母细胞或胚胎细胞的子代中的疾病或功能异常或怀疑可导致这些情况或与此相关。在一个实施方案中，至少一种核苷酸探针对线粒体基因组中表1中所示的任意一种核苷酸序列突变具有特异性。
表1位置 RNA 基因 疾病721 r12SADPD阿尔茨海默病/帕金森病1555 r12SDEAF，弱1606 tVal脑肌病(Encephalomyopathy)1642 tVal MELAS1644 tVal 利伯氏病(Leighs)3010 r16s 长寿3196 r16s ADPD3243 tLeu(UUR) MELAS3250 tLeu(UUR) MM线粒体肌病3251 tLeu(UUR) MM3254 tLeu(UUR) 糖尿病3256 tLeu(UUR)3260 tLeu(UUR) HCM肥大性心肌病3271 tLeu(UUR) MELAS晚期发作而非32433288 tLeu(UUR) MM3302 tLeu(UUR) MM3303 tLeu(UUR) HCM/MM3394 mND1 LHON还涉及ECG中的长U间隔3397 mND1 ADPD3460 mND1 LHON严重型4160 mND1 LHON+4216 mND1 LHON4269 tIle FICP婴儿致死性心肌病+4274 tIle CPEO4317 tIle FICP4336 tGln ADPD(弱)4917 mND2 LHON5178 mND2 长寿5244 mND2 LHON5521 tTrp 肌病，晚期发作6480 mCOI6930 COI G6930A(终止密码子)多系统7444 mCOI LHON7445 mCOI PPK掌跖角皮病和听觉丧失7472 tSer肌阵挛性癫痫，w/o RRF7497 tSerMERRF肌阵挛性癫痫等7512 tSer肌阵挛性癫痫，w/o RRF8342 tLys外眼肌麻痹，肌病，w.o RRF8344 tLysMERRF肌阵挛性癫痫，深红纤维；脂肪过多症8356 tLysMERRF8414 mATP8 长寿8851 ATP6 双侧纹状体坏死8860 ATP6 正常A-＞G8993 mATP6 NARP/Leighs神经原性衰弱，运动失调，视网膜炎9176 mATP6 双侧纹状体坏死9438 mCOILHON9804 mCOILHON9997 tGlyHCM10004 tGly儿童期猝死？10010 t 脑肌病10410 tArgAlpers综合征11778 mND4LHON严重型18832 mND4肌病12258 tLeu2(CUN) 色素性视网膜炎，感觉神经性听觉丧失12300 tLeu2(CUN) 针对UUR读码的反密码子突变12320 tLeu2(CUN) 肌病患者老化加剧13708 mND5LHON13730 mND5LHON14459 mND6LHON或利伯氏病14569 mND6LHON或利伯氏病14484 mND6LHON严重型14709 tGlu可变的婴儿肌病至NIDDM14826 cytb 运动不耐受性15084 mcytb 运动不耐受性15168 mcytb 运动不耐受性15257 m cytbLHON15498 第24位核 cytb运动不耐受性苷酸缺失15723 m cytb运动不耐受性15762 m cytb肌病，晚期发作15812 m cytbLHON15923 t Thr LIMM婴儿致死性线粒体肌病15990 t Pro MM16189 D NIDDM 非胰岛素依赖型糖尿病N＝任意的核苷酸R＝两种嘌呤(A，G)之一Y＝两种嘧啶(U，C)之一可以按照标准技术分析按照本发明第十个方面的方法分离的属于细胞质级分中的线粒体的线粒体基因组。这些技术已在后文中举例说明，包括聚合酶链反应(PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、基因组杂交、核苷酸测序和基因功能检测和/或测定。
在另一个方面中，本发明提供了包括下列序列的核苷酸ATP6FTCACCACCCAACAATGACATP6RTAAGGCGACAGCGATTTC定义在本说明书和权利要求中，“卵母细胞”指的是包括初级卵母细胞和次级卵母细胞在内的雌性生殖系细胞并且包括人卵母细胞。初级卵母细胞包括减数分裂GV(生发泡)期的生殖细胞。次级卵母细胞包括减数分裂中II期的生殖细胞。
在本说明书和权利要求中，“来源于受精卵母细胞的子代”指的是由雌性生殖细胞与雄性生殖细胞受精而产生的个体。“个体”指的是从胚胎生命最早期(例如，2细胞阶段)到成体生命的多细胞生物体。
在本说明书和权利要求中，“不影响卵母细胞受精能力”指的是带有所分离的细胞质级分的卵母细胞可以受精；或者换句话说，它们可以经历与受精过程中任意一个或多个阶段相关的任意一种或多种生化或细胞过程，从精子的进入而激活卵母细胞开始到产生受精卵并形成受精卵的分裂产物。一般在分离细胞质的级分后，可以通过例如包括ICSI和IVF在内的标准技术在体外使卵母细胞受精。
在本说明书和权利要求中，“胚胎细胞”包括雌性与雄性生殖细胞的有性生殖后的融合产物受精卵和从2细胞阶段到植入阶段的任意发育阶段的受精卵分裂产物。
在本说明书和权利要求中，“来源于胚胎细胞的子代”或“来源于胚胎的子代”指的是由雌性与雄性生殖细胞的有性生殖后的融合产物产生的个体。“个体”指的是从胚胎生命最早期(例如，2细胞阶段)到成体生命的多细胞生物体。
在本说明书和权利要求中，“不影响细胞发育潜能”或“不影响胚胎发育潜能”指的是带有所分离的细胞质级分的胚胎细胞和产生胚胎细胞的胚胎可以经受与细胞分化和/或成熟相关的任意一种或多种生化或细胞过程。
附图简述附
图1表示使用寡核苷酸引物L29和H04从来源于卵母细胞A1-A7的细胞质活检样品的线粒体基因组D-环区扩增的400bp(by)片段。
附图2表示使用相应于mtDNA 8201和8472位的引物扩增分离自胚胎细胞的线粒体基因组的271bp片段。
实施本发明的最佳方法1.卵母细胞的活检材料和方法卵母细胞的来源将人卵母细胞A1-A5用于研究。这些卵母细胞是生发泡(GV)细胞或处于减数分裂的MI期的细胞，已恢复6小时。
将人卵母细胞B1-B8用于研究。这些卵母细胞处于减数分裂的MII期并且是提取(retrieval)后24小时的细胞。
以要求参与研究的患者命名人卵母细胞C1。该卵母细胞处于减数分裂的MII期并且是提取后24小时的细胞。
卵母细胞细胞质级分的分离使用ICSI移液管(Sydney IVF，Sydney)对来自人卵母细胞的少量卵质物质进行活检。简单地说，所述的移液管是一种拉出具有约7μm直径的末端并带有斜尖端的玻璃毛细管。
如下实施活检技术将卵质抽入所述移液管内约100μm(约8pl)。然后从卵母细胞中抽出移液管而形成薄卵质桥，随后通过拉伸将其打断。直接将各卵质活检物排入含有20μl的PCR缓冲液、蛋白酶K和20mM DTT的PCR管中。在37℃下将管培养过夜或在50℃下培养30分钟，然后冷冻。两种方案均随后在95℃下将蛋白酶K加热10分钟使之失活。
卵母细胞细胞质级分中线粒体基因组的分析通过聚合酶链反应(PCR)来分析卵母细胞细胞质级分中的线粒体基因组。
(i)D-环片段建立20μl反应物；将10μl反应混合物加入到10μl卵质活检制剂中。101反应混合物含有引物各2.5pmol、dNTP各200μM、PCR缓冲液、milli-Q水和0.5个单位的Taq。所有反应均在加盖的0.2ml长管(tube strips)中进行。在下列条件下在FTS热测序仪(Corbett Research，Sydney，NSW)中进行PCR循环在93℃下起始变性5分钟；随后进行93℃变性45秒、60℃退火1分钟和72℃延伸1分钟的24-40个循环；通过72℃下7分钟的补齐步骤结束；冷却至15℃并保持在4℃下。所有PCR反应均以缺乏模板DNA的全反应混合物作为阴性对照。
使用特异性针对线粒体D-环区中400bp序列的引物L29(5’-GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3’)和H04(5’-CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA-3’)。
(ii)共同缺失片段使用与上述相同的方案，不过应用下列条件在95℃起始变性3分钟；随后进行92℃变性1分钟、60℃退火10秒和68℃延伸45秒的20-35个循环；通过75℃下7分钟的补齐步骤结束；冷却至15℃并保持在4℃下。从第11个循环开始，每个循环加入15秒的延伸时间。所有PCR反应均以缺乏模板DNA的全反应混合物作为阴性对照。
通过共同缺失区对4977具有特异性的引物L820(5’-TTCATGCCCATCGTCCTAGA-3’)和H1363(5’-GGGGAAGGGAGGTTGACCTG-3’)要求应用改良型酶ExpandTM高保真(High Fidelity)，这是因为需扩增较大片段PCR程序特别“长”所导致的。
在丙烯酰胺∶双丙烯酰胺37∶1的5％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳来分析来自D-环区或所述共同缺失区的扩增的DNA片段。
已活检的卵母细胞的受精按标准方案(1、2)通过ICSI或IVF使B1-B8卵母细胞和C1卵母细胞受精。在对卵母细胞进行胞质活检后立即进行受精。
结果胞质活检后卵母细胞的结局卵母细胞A1-A5显然不受胞质活检过程的影响且在活检后48小时时没有表现出退化的征兆。卵母细胞B1-B3和B5-B8在活检后的48小时时没有表现出退化的征兆。卵母细胞C1在活检后的48小时时没有表现出退化的征兆。仅有卵母细胞B4在活检后的17小时时退化(表2)。
表2卵母细胞胞质活检活检后17小时活检后48小时A1 有 不退化A2 有 不退化A3 有 不退化A4 有 不退化A5 有 不退化B1 有 不退化B2 有 不退化B3 有 不退化B4 有 退化B5 有 不退化B6 有 不退化B7 有 不退化B8 有 不退化C1 有 不退化从胞质活检物经PCR扩增线粒体DNA
考虑从取自卵母细胞的胞质活检物扩增线粒体DNA。有必要计算可能在这类活检物中获得的线粒体的近似量以便确定是否存在足以用于PCR的模板DNA。
如上所述通过使用ICSI移液管获取胞质活检物。据估计这种胞质活检物的体积约为8pl。由于卵母细胞的体积约为500pl，据估计取出的胞质活检物包括约2％的细胞质。据一种保守的估计，每个卵母细胞中存在约100,000个线粒体基因组(3)。根据这一估计，活检取出了约1000个线粒体。这一线粒体的量在聚合酶链反应扩增能力的范围内。
从D-环区进行PCR扩增通过35个循环的扩增从卵母细胞A1-A5的胞质活检物扩增400bp的D-环片段(附图1)。
从其同缺失区进行PCR扩增从卵母细胞B1-B3和B5-B8的胞质活检物扩增5.5kb的片段(数据未显示)。
已活检的卵母细胞的受精已活检的卵母细胞B1-B8和C1的受精结果如表3中所示。
表3卵母细胞 IVF/ICSI 活检后17小时活检后48小时B1ICSI2PN2细胞B2ICSI2PN未分裂B3ICSI3PN2细胞B4ICSI退化B5IVF未受精B6IVF未受精B7IVF未受精B8IVF未受精C1ICSI2PN2细胞PN＝观察到的原核使进行ICSI方案的所有卵母细胞(除B4外)受精。在受精后17小时在B1、B3和C1中观察到两个原核，在B3中观察到3个原核。卵母细胞B1、B3和C1发生分裂并在受精后48小时进化成2细胞期。在48小时时的B2中没有观察到细胞分裂。
尽管B5-B8卵母细胞在活检后48小时时没有退化，但是这些卵母细胞中无一通过经IVF方案的受精而受精。
讨论仅在实施胞质活检技术的14种卵母细胞中的一种中观察到了退化现象。由于某些卵母细胞在提取后约24小时倾向于退化(4、5)，故可能B4卵母细胞不依赖于胞质活检技术而退化。应注意卵母细胞A1-A5在特别为受精而不是为使卵母细胞成熟而配制的培养基中成熟。
结果表明一般可以将胞质活检技术应用至提取卵母细胞后24小时。由此能够将这种活检技术与公知的受精技术一起应用，所述的公知受精技术例如包括ICSI和IVF，一般将它们在提取卵母细胞的约4-6小时后使用。尽管在本研究中在活检后立即进行受精，但是希望可以在受精后进行活检。
我们发现ICSI过程(即注射精子而不除去细胞质)后形态上完整的卵母细胞百分比为95.2％(以注射的2649个卵母细胞为基准)(未公布结果)。
通过与未记录的其它种类中为核移植而除去极体和下面的细胞质后的退化率比较，仍然难以建立用于其它类型显微操作的标准(6、7)。在人卵母细胞中进行胞质注射，据报导外源线粒体注射的存活率为30.8％(67/217)，裂解率为6％。
尽管除去细胞质比单独使用ICSI更具有侵害性，但是在本研究中卵母细胞的总体存活率令人意外地高于我们上述讨论的标准ICSI后的存活率。因此，可认为胞质活检技术在临床上是可接受的。
对胞质活检中线粒体基因组D环区和共同缺失区片段的扩增表明，活检样品中存在足够进行PCR分析的模板DNA，可从该样品中扩增0.5kb以下至5kb以上的片段。对线粒体基因组的2个独立基因座片段的扩增提示，使用PCR和特异性寡核苷酸可以从胞质活检样品中扩增线粒体基因组的其它基因座上的突变、特别是表1中所述的突变。
鉴于在这些实验组中指定的卵母细胞在进行胞质活检时已经存活了24小时以上且尝试对其进行受精，所以有助于提高受精率和随后的分裂率。预先的研究已经表明，在受精前培养20小时以上可以兼顾卵母细胞的受精和发育(4、5)。此外，在体外成熟的卵母细胞缺乏体内成熟的卵母细胞维持高分裂率的能力(8)。由于这一原因，所以B5-B8卵母细胞在通过IVF方案受精后不再受精这一事实并不令人意外。
2.胚胎细胞材料和方法胚胎细胞的来源使冷冻的研究用胚胎(3个二原核的胚胎、1个二细胞的胚胎和1个四细胞的胚胎)解冻并在生长培养基中平衡。
胚胎细胞胞质级分的分离使用标准ICSI对3个单细胞胚胎和来自每种多细胞胚胎的1个细胞进行活检。在每种情况中将移液管导入胞质区域并抽出相当于细胞体积约5％的细胞质等分部分。将这一等分部分转入蔗糖溶液。使胚胎返回培养箱以使其连续生长。
对胚胎细胞胞质级分中线粒体基因组的分析用氢氧化钾使细胞质制备物呈碱性并加热至90℃持续5分钟。在用TrisHCl中和后，将一等分部分加至含有线粒体DNA特异性引物的反应混合物中，以扩增相应于mtDNA 8201和8472位的271个碱基对的片段。线粒体基因组中的该区包括氧化酶和ATP酶的编码区部分。使用能够实时监测与双链DNA扩增相关的荧光增加的热循环仅对该混合物进行PCR扩增。试剂和培养基空白对任何荧光改变来说是阴性的。通过与对照组人DNA的外部稀释液进行比较来分析DNA的拷贝数。
结果对来自胞质活检的线粒体DNA进行PCR扩增全部5个样品显示出存在线粒体靶DNA。表4表示活检样品中估计的mtDNA拷贝。
表4
活检后胚胎的结局活检过程后约24小时使用显微镜检验胚胎以确定它们的个体持续活力。2PN胚胎中仅有一个没有分裂，不过，在原始的2细胞和4细胞胚胎中观察到了某些退化的细胞物质。3天后，进一步的观察结果表明两个胚胎已经进化而形成胚泡。
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权利要求
1.一种从卵母细胞中分离细胞质级分而不会影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括从卵母细胞中释放约占该卵母细胞5％体积的细胞质级分的步骤。
2.一种根据权利要求2所述的方法，其中所述的级分约占所述卵母细胞体积的2％。
3.一种根据权利要求1所述的方法，该方法包括下列步骤(a)将释放装置插入卵母细胞；(b)将约占卵母细胞体积5％的细胞质级分抽入释放装置；和(c)从卵母细胞中抽出释放装置而使所述级分从释放装置中分离出来。
4.一种根据权利要求3所述的方法，其中所述级分的体积小于10pL。
5.一种根据权利要求4所述的方法，其中所述级分的体积等于卵母细胞细胞质可以抽取至胞质内精子注射(ICSI)移液管内约100μm的体积。
6.一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的细胞质级分包括线粒体。
7.一种根据权利要求3所述的方法，其中所述的释放装置包括一种注射移液管。
8.一种根据权利要求7所述的方法，其中所述的注射移液管是一种ICSI移液管。
9.一种检测卵母细胞内线粒体的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变而不影响该卵母细胞受精能力的方法，该方法包括下列步骤(a)按照权利要求1所述的方法从卵母细胞中分离包含线粒体的细胞质级分；和(b)对细胞质级分中线粒体基因组的核苷酸序列进行分析以明确线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的存在。
10.一种根据权利要求9所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多态性或突变可导致卵母细胞或来源于受精卵母细胞的子代中的疾病或功能异常，或怀疑可导致这些情况，或与这些情况相关。
11.一种根据权利要求10所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多态性或突变如表1中所示。
12.一种测定卵母细胞中线粒体基因组的异质性水平而不影响卵母细胞受精能力的方法，该方法包括下列步骤(a)按照权利要求1所述的方法从卵母细胞中分离包含线粒体的细胞质级分；和(b)将级分中含有核苷酸序列、多态性或突变的线粒体基因组的数量与级分中不含核苷酸序列、多态性或突变的基因组数量进行比较。
13.一种根据权利要求12所述的方法，其中分离出细胞质级分的卵母细胞是处于卵母细胞发育之生发泡期的初级卵母细胞或处于从减数分裂的中II期至融合生殖之前的卵母细胞发育期的次级卵母细胞。
14.一种根据权利要求13所述的方法，其中所述的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变可导致卵母细胞或来源于受精卵母细胞的子代中的疾病或功能异常，或怀疑可导致这些情况的原因，或与这些情况相关。
15.一种根据权利要求14所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多态性或突变如表1中所示。
16.一种从胚胎细胞中分离细胞质级分而不会影响该细胞发育潜能的方法，该方法包括从所述细胞中释放约占该细胞体积的5％的细胞质级分的步骤。
17.一种根据权利要求16所述的方法，其中所述的级分约占所述细胞体积的2％。
18.一种根据权利要求16所述的方法，该方法包括下列步骤(a)将释放装置插入胚胎细胞；(b)将约占所述细胞体积5％的细胞质级分抽入释放装置；和(c)从所述细胞中抽出释放装置而使所述级分从释放装置中分离出来。
19.一种根据权利要求18所述的方法，其中所述级分的体积小于10pL。
20.一种根据权利要求19所述的方法，其中所述级分的体积等于胚胎细胞细胞质可以抽入ICSI移液管内100μm的体积。
21.一种根据权利要求16所述的方法，其中所述的细胞质级分包括线粒体。
22.一种根据权利要求18所述的方法，其中所述的释放装置包括一种注射移液管。
23.一种根据权利要求22所述的方法，其中所述的注射移液管是一种ICSI移液管。
24.一种检测胚胎细胞内线粒体的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变而不影响该细胞发育潜能的方法，该方法包括下列步骤(a)按照权利要求16所述的方法从胚胎细胞中分离包括线粒体的细胞质级分；和(b)对细胞质级分中线粒体基因组的核苷酸序列进行分析以明确线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的存在。
25.一种根据权利要求24所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多态性或突变可导致胚胎细胞或来源于胚胎细胞的子代中的疾病或功能异常，或怀疑可导致这些情况，或与这些情况相关。
26.一种根据权利要求25所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多态性或突变如表1中所示。
27.一种测定胚胎细胞中线粒体基因组的异质性水平而不影响该细胞发育潜能的方法，该方法包括下列步骤(a)按照权利要求16所述的方法从胚胎细胞中分离包含线粒体的细胞质级分；和(b)将级分中含有核苷酸序列、多态性或突变的线粒体基因组的数量与级分中不含核苷酸序列、多态性或突变的基因组数量进行比较。
28.一种根据权利要求27所述的方法，其中所述的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变可导致胚胎细胞或来源于该细胞的子代中的疾病或功能异常，或怀疑可导致这些情况，或与这些情况相关。
29.一种根据权利要求28所述的方法，其中所述的核苷酸序列、多态性或突变如表1中所示。
30.一种在权利要求9或权利要求12所述方法中使用的试剂盒，该试剂盒包括能够检测线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的寡核苷酸，其中所述的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变可导致卵母细胞或来源于受精卵母细胞的子代中的疾病或功能异常，或怀疑可导致这些情况，或与这些情况相关。
31.一种在权利要求24或权利要求27所述方法中使用的试剂盒，该试剂盒包括能够检测线粒体基因组中核苷酸序列、多态性或突变的寡核苷酸，其中所述的线粒体基因组中的核苷酸序列、多态性或突变可导致胚胎细胞或来源于胚胎细胞的子代中的疾病或功能异常，或怀疑可导致这些情况，或与这些情况相关。
32.一种根据权利要求30或权利要求31所述的试剂盒，其中所述的寡核苷酸能够检测表1中所示的核苷酸序列、多态性或突变。
全文摘要
本发明公开了一种从卵母细胞中分离细胞质级分而不会影响卵母细胞受精能力的方法,该方法包括包括从卵母细胞中释放约占该卵母细胞体积的5%的细胞质级分的步骤。本发明还公开了一种从胚胎细胞中分离细胞质级分而不会影响该细胞发育潜能的方法,该方法包括从所述细胞中释放约占该细胞体积5%的细胞质级分的步骤。
文档编号G01N33/50GK1341212SQ00804183
公开日2002年3月20日 申请日期2000年2月23日 优先权日1999年2月23日
发明者罗伯特·詹森, 凯利·德博尔 申请人:悉尼Ivf有限公司