专利名称：叶用芥菜细胞质雄性不育基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及叶用芥菜细胞质雄性不育基因及其克隆方法，属于分子生物学
背景技术：
细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility)是植物中比较普遍的遗传现象，在作物杂种优势利用中有着重要应用价值。由于细胞质雄性不育不能产生正常的功能花粉，因此，利用雄性不育既可以省去人工去雄的手续，又可以保证杂交一代种子的纯度，同时它又是研究花粉发育、细胞质遗传和核质互作的良好的实验系统。十字花科作物存在着明显的杂种优势，目前杂种一代的生产主要是利用自交不亲和性和雄性不育性两种途径。细胞质雄性不育由于其理论上可以获得100％不育度和不育率的材料，因此，在十字花科作物优势育种利用中有着更广阔的前景，十字花科中许多重要的经济作物，如白菜、甘蓝、甘蓝型油菜等都选育出了综合性状良好的雄性不育系。有关细胞质雄性不育机理的研究一直是科学中的热点和难点问题，众多学者认为，细胞质雄性不育性的产生是由于线粒体基因组发生高度重排继而产生新的开放阅读框(openreading frame，orf)，导致线粒体功能发生紊乱，致使小孢子发育过程中能量供应不足(Schnable P等，Trends Plant Sci，1998，3175～180；Budar F等，LifeSci，2001，324543～550；Hanson MR等，Plant Cell，2003，S16154～169)。细胞质雄性不育相关基因的克隆、表达以及功能验证，核质互作调控基因的表达等等是解决细胞质雄性不育的发生机理、花粉发育以及核质互作等生物学相关问题的关键。
芥菜是中国的特产蔬菜，属于十字花科植物，在浙江和四川等地有着广泛的栽培，经济价值大，是重要的加工蔬菜，生产上存在病毒病严重和品质下降等问题，而杂种优势的利用可以改良现有芥菜品种的品质及提高抗性。由于芥菜类作物自交亲和指数非常高，生产上很难利用自交不亲和系进行杂种优势的利用。因此，芥菜类作物细胞质雄性不育的应用与理论研究有着重要意义，细胞质雄性不育的机理一直是生物学研究的热点之一。迄今为止，在十字花科作物中，在生产上已经应用的细胞质雄性不育系主要有Ougra型的萝卜细胞质雄性不育系、Brassica nap型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系以及Brassica pol型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系，在这些类型的细胞质雄性不育系的应用过程中，有关细胞质雄性不育的机理研究一直在进行中，一些不育性相关的基因被克隆，如从Ougra型萝卜细胞质雄性不育系中克隆的orf138基因(Bonhomme F，Mol.Gen.Genet.，1992，235240～248；Krishnasamy CA，Curr.Genet.，1993，24156～163)、Brown GG等在Brassica nap型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系克隆的orf222基因(Acata Hort.，1998，459265～274)，以及Singh M等Brassica pol型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系克隆的orf224基因(Plant Cell，1991，31349～1362)。到目前为止，尚无叶用芥菜细胞质雄性不育基因的报道，基因库里尚无叶用芥菜细胞质雄性不育基因登录。
发明内容
本发明的目的是提供叶用芥菜细胞质雄性不育基因及其克隆方法。
本发明的叶用芥菜细胞质雄性不育基因，它具有如下所示的序列。
基因序列(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征*长度663碱基对*类型核酸*链型双链(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源叶用芥菜(Brassica juncea var.multiceps Tsen et Lee)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgcctcaac tggataaatt cacttatttt tcacaattct tctggttatg ccttttcttc 60tttactttct atattttcat atgcaatgat ggagatggag tacttgggat cagcagaatt120ctaaaactac gaaaccaact gctttcacac cgggggaaga ccatccagag caaggtcaga180aaaaatcgta gttcagattc aagtcggttg gaggtcttgg cgttcgctat taattatttc240ctctttttcg tgattccaag attatggcca tatatatata ttggatacgg tttgaaattt300ttgttagggt tgaaatatgg aatattccaa aatgaaatct tgactttagg ggtcggacca360gatggcgtcg cgcccccgga tataaacgaa cgggcgccgc tgcatctctt gtacgcggat420gttgagagtt ccgactctca acaagctcga aataatgcga tgctagcgca ccttaatcgc480
atagaatata taacccatga cctagagggt gagcgtgata tcgtgcggcg tcaagcctta540atcgatatca tgaagtggga gattcgaagc ctacagcagc actttcgggt ctttcggcac600ctagaccgtg tgcgagatgc gcagagagcc aggatgaacg agatcctcga tctatttcga660tga 663(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度220氨基酸*类型氨基酸*链型单链(b)分子类型肽(c)序列描述Met Pro Gln Leu Asp Lys Phe Thr Tyr Phe Ser Gln Phe Phe Trp Leu1 5 10 15Cys Leu Phe Phe Phe Thr Phe Tyr Ile Phe Ile Cys Asn Asp Gly Asp20 25 30Gly Val Leu Gly Ile Ser Arg Ile Leu Lys Leu Arg Asn Gln Leu Leu35 40 45Ser His Arg Gly Lys Thr Ile Gln Ser Lys Val Arg Lys Asn Arg Ser50 55 60Ser Asp Ser Ser Arg Leu Glu Val Leu Ala Phe Ala Ile Asn Tyr Phe65 70 75 80Leu Phe Phe Val Ile Pro Arg Leu Trp Pro Tyr Ile Tyr Ile Gly Tyr85 90 95Gly Leu Lys Phe Leu Leu Gly Leu Lys Tyr Gly Ile Phe Gln Asn Glu100 105 110Ile Leu Thr Leu Gly Val Gly Pro Asp Gly Val Ala Pro Pro Asp Ile115 120 125Asn Glu Arg Ala Pro Leu His Leu Leu Tyr Ala Asp Val Glu Ser Ser130 135 140Asp Ser Gln Gln Ala Arg Asn Asn Ala Met Leu Ala His Leu Asn Arg145 150 155 160
Ile Glu Tyr Ile Thr His Asp Leu Glu Gly Glu Arg Asp Ile Val Arg165 170 175Arg Gln Ala Leu Ile Asp Ile Met Lys Trp Glu Ile Arg Ser Leu Gln180 185 190Gln His Phe Arg Val Phe Arg His Leu Asp Arg Val Arg Asp Ala Gln195 200 205Arg Ala Arg Met Asn Glu Ile Leu Asp Leu Phe Arg210 215 220上述叶用芥菜细胞质雄性不育基因的克隆方法如下提取叶用芥菜细胞质雄性不育系基因组DNA，以其为模板，根据nap类型甘蓝型油菜(Brassica nap)细胞质雄性不育相关基因orf222和pol型甘蓝型油菜(Brassica pol)细胞质雄性不育相关基因orf224设计兼并引物，进行常规链式聚合酶反应，扩增产物克隆到pUCM-T载体上，序列测定，得到663 bp的DNA片断。
上述克隆方法所述的兼并引物是正向引物5’-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3’反向引物5’-TCATCGAAATAGATCRAGKATYTC-3’，其中R为G，A；K为G，T；Y为C，T上述链式聚合酶反应(PCR)的具体步骤如下(1)首先将下列试剂混和在一起10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5微升(μl)模板DNA 1μl正向引物(1.25μg/l) 0.4μl反向引物(1.25μg/l) 0.4μl脱氧核苷酸混合物(dNTP)1μlTaq DNA聚合酶 0.4μl灭菌水41.8μl总体积50μl(2)将上述混和液94℃变性3分钟，然后进入下来循环94℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，结果扩增到663的一条带。
(3)将扩增产物克隆到pUCM-T载体(上海生工生物有限公司)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养，挑取白色菌斑，用于序列测定(上海生工生物有限公司)。
结果得到了663bp的DNA片断，具有自己的起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)，推定编码220个氨基酸，因此，定名为orf220。经数据库及相关软件分析，orf220与orf138、orf222以及orf224在氨基酸水平上的同源性分别为24％、86％和87％。因此，orf220是在叶用芥菜细胞质雄性不育系中发现的一种新型十字花科芸薹属作物细胞质雄性不育基因。利用上述方法得到了叶用芥菜细胞质雄性不育基因orf220。
本发明首次克隆叶用芥菜细胞质雄性基因orf220，并设计了合适的兼并引物，以其基因组DNA为模板，成功完成orf220基因的克隆。本发明克隆的叶用芥菜细胞质雄性基因orf220在叶用芥菜细胞质雄性不育系回交各世代中稳定遗传，为研究叶用芥菜细胞质雄性不育的分子机理奠定基础。
具体实施例方式
实施例1一种克隆叶用芥菜细胞质雄性不育基因，具有如下序列(1)SEQ ID NO.1的信息(a)序列特征*长度663碱基对*类型核酸*链型双链(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源叶用芥菜(Rrassica juncea var.multiceps Tsen et Lee)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgcctcaac tggataaatt cacttatttt tcacaattct tctggttatg ccttttcttc60tttactttct atattttcat atgcaatgat ggagatggag tacttgggat cagcagaatt120ctaaaactac gaaaccaact gctttcacac cgggggaaga ccatccagag caaggtcaga180aaaaatcgta gttcagattc aagtcggttg gaggtcttgg cgttcgctat taattatttc240ctctttttcg tgattccaag attatggcca tatatatata ttggatacgg tttgaaattt300ttgttagggt tgaaatatgg aatattccaa aatgaaatct tgactttagg ggtcggacca360gatggcgtcg cgcccccgga tataaacgaa cgggcgccgc tgcatctctt gtacgcggat420
gttgagagtt ccgactctca acaagctcga aataatgcga tgctagcgca ccttaatcgc480atagaatata taacccatga cctagagggt gagcgtgata tcgtgcggcg tcaagcctta540atcgatatca tgaagtggga gattcgaagc ctacagcagc actttcgggt ctttcggcac600ctagaccgtg tgcgagatgc gcagagagcc aggatgaacg agatcctcga tctatttcga660tga 663(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度220氨基酸*类型氨基酸*链型单链(b)分子类型肽(c)序列描述Met Pro Gln Leu Asp Lys Phe Thr Tyr Phe Ser Gln Phe Phe Trp Leu1 5 10 15Cys Leu Phe Phe Phe Thr Phe Tyr Ile Phe Ile Cys Asn Asp Gly Asp20 25 30Gly Val Leu Gly Ile Ser Arg Ile Leu Lys Leu Arg Asn Gln Leu Leu35 40 45Ser His Arg Gly Lys Thr Ile Gln Ser Lys Val Arg Lys Asn Arg Ser50 55 60Ser Asp Ser Ser Arg Leu Glu Val Leu Ala Phe Ala Ile Asn Tyr Phe65 70 75 80Leu Phe Phe Val Ile Pro Arg Leu Trp Pro Tyr Ile Tyr Ile Gly Tyr85 90 95Gly Leu Lys Phe Leu Leu Gly Leu Lys Tyr Gly Ile Phe Gln Asn Glu100 105 110Ile Leu Thr Leu Gly Val Gly Pro Asp Gly Val Ala Pro Pro Asp Ile115 120 125Asn Glu Arg Ala Pro Leu His Leu Leu Tyr Ala Asp Val Glu Ser Ser130 135 140Asp Ser Gln Gln Ala Arg Asn Asn Ala Met Leu Ala His Leu Asn Arg145 150 155 160
Ile Glu Tyr Ile Thr His Asp Leu Glu Gly Glu Arg Asp Ile Val Arg165 170 175Arg Gln Ala Leu Ile Asp Ile Met Lys Trp GluIle Arg Ser Leu Gln180 185190Gln His Phe Arg Val Phe Arg His Leu Asp Arg Val Arg Asp Ala Gln195 200205Arg Ala Arg Met Asn Glu Ile Leu Asp Leu Phe Arg210 2l5 220实施例2叶用芥菜细胞质雄性不育基因的克隆方法叶用芥菜细胞质雄性不育系(Brassica juncea var.multiceps Tsen etLee)由本实验室提供，材料在浙江大学农业与生物技术学院园艺系蔬菜研究所种植。
(1)引物设计根据Genebank数据库中nap类型甘蓝型油菜(Brassica nap)细胞质雄性不育相关基因orf222和pol型甘蓝型油菜(Brassica pol)细胞质雄性不育相关基因orf224设计兼并引物(orf222基因Genebank登录号U10423，orf224基因Genebank登录号S46795，均可以在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/中查找到)设计兼并引物。
(2)CTAB法提取植物总DNA方法(a)取0.5g嫩叶于研钵中，液氮状态下研磨，加入600ul 65℃预热的2×CTAB，(30μl巯基乙醇混匀)，转移到离心管中，65℃保温1小时。
(b)加入600ul氯仿异戊醇(24/1)轻轻摇匀，4℃，13000rpm离心，10分钟。
(c)取上清，重复(b)步骤一次。
(d)取上清于另一离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置5分钟，13000rpm，离心10分钟。
(e)倒去上清，加入700ul Wash Buffer漂洗DNA沉淀，离心，重复一次。
(f)加15微升TE-Rnase，37℃保温1小时。
(g)加入2mol/L NaCl 100ul+100％乙醇250ul混匀，-20℃静置30min，13000rpm离心10分钟。
(h)倒去上清，加入500ul 70％乙醇，漂洗，倒去乙醇，重复一次，常温晾干。
(i)加入30-50ul ddH2O或TE，回溶，-20℃保存备用。
注2×CTAB配方，200ulCTAB4gTris(pH8.0) 20mlEDTA1.488gNaCl 16.352gTE-RNase15ul TE加入1/100体积的RNaseWash Buffer10mmol/L乙酸氨76％乙醇(3)链式聚合酶反应(PCR)的试剂与条件首先将下列试剂混和在一起10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5微升(μl)模板DNA 1μl正向引物(1.25μg/l) 0.4μl反向引物(1.25μg/l) 0.4μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 1μlTaq DNA聚合酶0.4μl灭菌水 41.8μl总体积 50μlPCR反应条件将上述混和液94℃变性3分钟，然后进入以下循环94℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，结果扩增到663的一条带。
(4)orf220基因的克隆(a)连接反应，离心管顺序加入以下各组分H2O 2μlT4DNA Ligase 10×Buffer 1μlpUCM-T载体 1μlPCR产物 4μlPEG#4000 1μlT4DNA Ligase 1μl(b)热激法转化大肠杆菌DH5α(I)200μl摇匀后的感受态细胞悬浮液，加入4μl质粒，用枪头轻轻吹打均匀，冰浴30分钟；(II)42℃保温90秒，迅速放入冰中，冰浴5分钟；(III)加入37℃预热的1ml LB液体培养基(Amp-)，混匀，37℃保温1个小时，使细胞恢复正常生长状态；(IV)3000rpm离心10分钟；(V)弃去上清，余下的200μl用枪头轻轻吹打均匀，使细菌充分悬浮后均匀涂布于含X-Gal和IPTG的LB筛选平板培养基上(Amp+)(VI)37℃正面向上放置半个小时后，倒置培养8-12小时，观察。
LB培养基配方100ml体系中加入以下各组分蛋白胨(Typtone)1g酵母提取物(Yeast Extract) 0.5gNaCl 1gNaOH(1mol/L) 100μl高压高温灭菌后4℃保存。
(5)质粒纯化(a)取1-2ml菌液于Epeendorf管中，12000rpm离心1分钟；(b)加入100μl Solution I，用枪头充分悬浮菌液；(c)加入200μl Solution II，颠倒Epeendorf管，冰浴3分钟；(d)加入150μl预冷的Solution III，颠倒Epeendorf管，冰浴5分钟；(e)4℃，12000rpm离心5分钟，上清液加入等体积的苯酚/氯仿混匀；(f)4℃，12000rpm离心5分钟，上清液加入2倍体积的乙醇，室温放置5分钟；(g)4℃，12000rpm离心5分钟，用70％乙醇漂洗一下，凉干沉淀，50μl TE融解沉淀，-20℃保存备用。
其中Solution I100ml体系1mol/L Tris-HCl(pH8.0) 2.5ml0.5mol/L EDTA(pH8.0) 2.0ml20％Glucose(1.11mol/L)4.5mldH2O 91ml高温高压灭菌后4℃保存。
Solution II100ml体系10％SDS 10ml2mol/L NaOH10ml加灭菌水至100ml，充分混匀，室温保存，最好现用现配。
SolutionIII100ml体系KOAc 29.4gCH3COOH11.5ml加灭菌水至100ml，高温高压灭菌后4℃保存。
(5)序列测定与分析序列测定由上海生工生物技术有限公司完成。将所得序列在Genebank及分子生物学软件DNAMAN、ClustalW等分析。
权利要求
1.一种叶用芥菜细胞质雄性不育基因，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1所示的序列atgcctcaac tggataaatt cacttatttt tcacaattct tctggttatg ccttttcttc 60tttactttct atattttcat atgcaatgat ggagatggag tacttgggat cagcagaatt120ctaaaactac gaaaccaact gctttcacac cgggggaaga ccatccagag caaggtcaga180aaaaatcgta gttcagattc aagtcggttg gaggtcttgg cgttcgctat taattatttc240ctctttttcg tgattccaag attatggcca tatatatata ttggatacgg tttgaaattt300ttgttagggt tgaaatatgg aatattccaa aatgaaatct tgactttagg ggtcggacca360gatggcgtcg cgcccccgga tataaacgaa cgggcgccgc tgcatctctt gtacgcggat420gttgagagtt ccgactctca acaagctcga aataatgcga tgctagcgca ccttaatcgc480atagaatata taacccatga cctagagggt gagcgtgata tcgtgcggcg tcaagcctta540atcgatatca tgaagtggga gattcgaagc ctacagcagc actttcgggt ctttcggcac600ctagaccgtg tgcgagatgc gcagagagcc aggatgaacg agatcctcga tctatttcga660tga 663。
2.一种权利要求1所述的叶用芥菜细胞质雄性不育基因的克隆方法，其特征是，提取叶用芥菜细胞质雄性不育系基因组DNA，以其为模板，根据nap类型甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因orf222和pol型甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因orf224设计兼并引物，进行常规链式聚合酶反应，扩增产物克隆到pUCM-T载体上，序列测定，得到663bp的DNA片断。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于所述的兼并引物是正向引物5’-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3’反向引物5’-TCATCGAAATAGATCRAGKATYTC-3’，其中R为G，A；K为G，T；Y为C，T。
4.按权利要求2所述的方法，其特征在于链式聚合酶反应的具体步骤如下(1)首先将下列试剂混和在一起10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5微升(μl)模板DNA 1μl正向引物(1.25μg/l) 0.4μl反向引物(1.25μg/l) 0.4μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 1μlTaq DNA聚合酶 0.4μl灭菌水41.8μl总体积50μl(2)将上述混和液94℃变性3分钟，然后进入以下循环94℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，结果扩增到663的一条带；(3)将扩增产物克隆到pUCM-T载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养，挑取白色菌斑，用于序列测定。
全文摘要
本发明涉及叶用芥菜细胞质雄性不育基因及其克隆方法，属于分子生物学技术领域。本发明的叶用芥菜细胞质不育基因具有SEQ ID NO.1所示的序列，长度为663碱基对。提取叶用芥菜细胞质雄性不育系基因组DNA，以其为模板，设计兼并引物，进行常规链式聚合酶反应，扩增产物克隆到载体上，得到663bp的DNA片断。本发明的叶用芥菜细胞质雄性不育基因在叶用芥菜细胞质雄性不育系回交各世代中可以稳定遗传。
文档编号C12N15/29GK1699570SQ20051005031
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月13日 优先权日2005年5月13日
发明者张明方, 杨景华, 陈竹君 申请人:浙江大学